Glyphosatbaserede produkter (GBP) er de mest almindelige bredspektrede herbicider på verdensplan. I denne artikel introducerer vi generelle retningslinjer for at kvantificere effekten af GBP på mikrobiomer, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser.
Glyphosatbaserede produkter (GBP) er de mest almindelige bredspektrede herbicider på verdensplan. Målet for glyphosat er enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i shikimatvejen, som er næsten universel i planter. Inhiberingen af enzymet stopper produktionen af tre essentielle aminosyrer: phenylalanin, tyrosin og tryptofan. EPSPS er også til stede i svampe og prokaryoter, såsom arkæer og bakterier; Anvendelsen af GBP kan således have en indvirkning på mikrobiomsammensætningen af jordbund, planter, planteædere og sekundære forbrugere. Denne artikel har til formål at præsentere generelle retningslinjer for vurdering af effekten af GBP på mikrobiomer fra feltforsøg til bioinformatikanalyser og give et par testbare hypoteser. To feltforsøg præsenteres for at teste GBP på organismer uden for målgruppen. For det første udtages og analyseres planterelaterede mikrober fra 10 replikerede kontrol- og GBP-behandlingsplotter, der simulerer no-till-beskæring. I det andet forsøg blev der opnået prøver fra forsøgsparceller befrugtet af enten fjerkrægødning indeholdende glyphosatrester eller ikke-behandlet kontrolgødning. Bioinformatikanalyse af EPSPS-proteinsekvenser anvendes til at bestemme mikrobernes potentielle følsomhed over for glyphosat. Det første skridt i estimeringen af effekten af GBP på mikrobiomer er at bestemme deres potentielle følsomhed over for målenzymet (EPSPS). Mikrobielle sekvenser kan opnås enten fra offentlige arkiver eller ved hjælp af PCR-forstærkning. I de fleste feltstudier er mikrobiomsammensætningen imidlertid blevet bestemt ud fra universelle DNA-markører såsom 16S rRNA og den interne transskriberede afstandslinje (ITS). I disse tilfælde kan følsomheden over for glyphosat kun estimeres gennem en sandsynlighedsanalyse af EPSPS-sekvenser ved hjælp af nært beslægtede arter. Kvantificeringen af organismers potentielle følsomhed over for glyphosat baseret på EPSPS-enzymet giver en robust tilgang til yderligere forsøg med henblik på at undersøge mål- og ikke-målresistente mekanismer.
Den store brug af pesticider i det moderne landbrug er helt klart en stor bidragyder til nedgangen i biodiversiteten1. Dette papir fokuserer på glyphosat, fordi glyphosatbaserede produkter (GBP’er) er blevet de mest anvendte pesticider globalt på grund af deres effektivitet og overkommelige pris 2,3. Ud over at dræbe ukrudt i landbrugsmarker anvendes GBP’er almindeligvis i silvikultur, bymiljøer og hjemmehaver; Desuden er de blevet erklæret for ugiftige for organismer uden for målgruppen, hvis de anvendes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Et stigende antal nylige undersøgelser har imidlertid vist, at restkoncentrationer af glyphosat og dets nedbrydningsprodukter kan tilbageholdes og transporteres i jordbunden og derved have kaskadevirkninger på organismer uden for målgruppen 4,5,6,7,8 . Virkningerne af glyphosat er ikke kun begrænset til planter – shikimatvejen er også til stede i mange svampe og prokaryoter. Glyphosat er rettet mod enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i shikimatvejen, også kendt som aroA9. Dette enzym er i centrum af shikimatvejen i syntesen af de tre essentielle aromatiske aminosyrer (phenylalanin, tyrosin og tryptofan), og det er til stede i de fleste prokaryoter, planter og svampe10,11. Nogle mikrobielle arter har udviklet delvis eller absolut resistens over for glyphosat ved hjælp af flere mekanismer, herunder mutationer i EPSPS-sekvenserne. Det er således blevet foreslået, at brugen af GBP’er kan have en direkte effekt på plante- og dyremikrobiomer, herunder det humane tarmmikrobiom 12,13,14. Ikke desto mindre kan anvendelsen af GBP have en negativ indvirkning på stort set alle økosystemtjenester og -tjenester, der er afhængige af mikrober og mikrobe-faciliterede processer. De deraf følgende trusler kan vedrøre biokemiske jordprocesser, bestøvningsbiologi og dyrs og menneskers trivsel. Dette kræver en mere omfattende forståelse af, hvordan glyphosat påvirker shikimatveje og metoder til at vurdere mikrobers følsomhed over for glyphosat.
I denne protokol præsenterer vi en pipeline til test af effekten af glyphosat og GBP på mikrobiomet, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser. Vi beskriver i detaljer en nyligt offentliggjort bioinformatikmetode, der kan bruges til at bestemme organismers potentielle følsomhed over for glyphosat12. Så vidt forskerne ved, er dette det første og hidtil eneste bioinformatikværktøj til at vurdere enzymet EPSPS’s iboende følsomhed over for den aktive komponent i GBP’er. Denne bioinformatikmetode er baseret på påvisning af kendte aminosyremarkører i glyphosatmålenzymet (EPSPS)12. Pipelinen er opdelt i fem hovedarbejdsfaser (figur 1): 1) en kort introduktion til to felteksperimenter for at teste effekten af GBP’er, 2) et kort resumé af mikrobiomanalyser (16S rRNA, ITS og EPSPS-gen ), 3) indsamling af EPSPS-sekvenser fra offentlige arkiver, 4) bestemmelse af organismers potentielle følsomhed over for glyphosat og 5) vurdering af EPSPS-klassen fra universelle mikrobielle markører (16S rRNA og ITS).
Denne protokol indeholder generel vejledning i, hvordan man kvantificerer effekten af GBP på mikrobiomer baseret på analysen af EPSPS-proteinet. Protokollen har tre vigtige kritiske trin: (i) Kvantificering af EPSPS-proteinet fra mikrobiomdata. Dette trin er kritisk, fordi EPSPS er herbicidets direkte målenzym. Således kan arter, der har en kopi af EPSPS-genet, blive påvirket af brugen af GBP. Ikke desto mindre kan selv arter, der mangler en kopi af EPSPS-genet, blive påvirket af herbicidet gennem alternative ikke-målmekanismer43,44. (ii) Hvis analysen af EPSPS-genet ikke indgår i undersøgelsens design, er det muligt at få et godt skøn ved at analysere 16S rRNA (bakterier) eller ITS (svampe). I dette tilfælde er det vigtigt at basere sig på en omfattende referencetabel (f.eks. indeholder ATGC-databasen sekvenser af EPSPS-proteinet fra flere nært beslægtede arter). iii) EPSPS-proteinet er opdelt i potentielt følsomt eller resistent over for glyphosat afhængigt af visse aminosyrerester fra EPSPS’ aktive sted. Mutationer, der påvirker en enkelt aminosyre, kan dog ændre denne klassifikation45, og overgange mellem klasser kan forekomme på relativt kort tid14.
Organismers potentielle følsomhed over for glyphosat kan bestemmes ved hjælp af referencegenomer, aminosyremarkører og sekvensjusteringer. i) Referencegenomer: EPSPS-enzymet kan klassificeres som potentielt følsomt (klasse I [alfa eller beta]46,47) eller resistent (klasse II 48,49, III50 og IV51) over for glyphosat på grundlag af tilstedeværelsen af aminosyremarkører og -motiver (for så vidt angår klasse III). Disse aminosyremarkører og motiver er baseret på placeringen af aminosyrerester i EPSPS-proteinet af Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III) og Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). ii) Aminosyremarkører: Glyphosat interagerer med EPSPS-enzymet og konkurrerer med phosphoenolpyruvat (PEP, EPSPS-enzymets andet substrat)52,53. Hos visse arter giver små aminosyreændringer i EPSPS-sekvensen en højere affinitet for PEP og en resistens over for glyphosat 12,14,52,54,55. I andre sekvenser binder glyphosat EPSPS-sekvensen i en ikke-hæmmende konformation 45. Selv om mange resistente 12,14,48,49,52,54,55 og tolerante 56,57 EPSP-sekvenser over for glyphosat er blevet beskrevet, er det nuværende klassificeringssystem for EPSPS opdelt i fire hovedklasser (I-IV)12 (tabel 5 ). (iii) Sekvensjusteringer: For at klassificere et EPSPS-enzym udførte vi parvise justeringer med et program med flere sekvensjusteringsprogram-standardparametre35-af forespørgselssekvensen mod hver enkelt af referencesekvenserne (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS og sdEPSPS). Disse justeringer er nødvendige for at identificere aminosyrermarkørernes positioner i forespørgselssekvensen. Som følge heraf klassificeres et enzym som beskreveti klasse I, II og/eller IV baseret på tilstedeværelsen af aminosyremarkører og klasse III-baserede motivmarkører.
Protokollen er baseret på fire kendte typer EPSPS: den ene type er følsom, de tre andre er resistente). Imidlertid er ca. 10 % af EPSPS-sekvenserne i prokaryoter endnu uklassificerede (16 % i arkæer og 8 % i bakterier)12. Således bør yderligere forskning analysere disse sekvenser for at bestemme glyphosatfølsomheden. EPSPSClass-serveren giver mulighed for at teste nye genetiske markører. Identifikationen af kendte klasser i EPSPS er ligetil, som vist i afsnit 4.4. og figur 5. I de tilfælde, hvor brugerne ønsker at sammenligne deres egne forespørgsels- og referenceproteiner, giver serveren desuden mulighed for manuelt at medtage en referencesekvens og et sæt aminosyremarkører (figur 11). Denne mulighed kan bruges til at identificere nye klasser af EPSPS samt til at teste andre herbicider og målsekvenser.
Analysen af EPSPS-klassen bestemmes ved sekvensanalyse og tilstedeværelsen/fraværet af aminosyremarkører. Dette er et foreløbigt skøn, der kan bruges til hypotesetest på området. Aminosyremarkører er blevet bestemt i litteraturen baseret på empiriske og observationsstudier 46,47,48,49,50,51. Referenceproteinsekvenser til bestemmelse af EPSPS-klassen er dog kun blevet testet i et begrænset antal arter og kan lejlighedsvis ikke forklare resistens over for glyphosat. Virkningen af kompenserende mutationer og EPSPS-associerede domæner (hovedsagelig i svampe) kan også påvirke følsomheden over for glyphosat58. Dette papirs analyse er baseret på fire EPSPS-klasser. En undersøgelse af bakterier i det humane tarmmikrobiom viste, at omkring 30 % af dem var uklassificerede (dvs. EPSPS-proteiner fra disse arter tilhører ikke nogen af de kendte klasser), og der er behov for yderligere undersøgelser for at identificere andre EPSPS-klasser. Det skal også bemærkes, at EPSPS-proteinsekvensen i bakterier og planter er unidomain, mens svampe-EPSPS-proteiner indeholder flere domæner59. Således kan en proteinfoldning i svampe føre til en anden reaktion fra EPSPS-enzymet på glyphosat. Desuden tages der ikke hensyn til yderligere resistensmekanismer, der ikke er mål (f.eks. effluxpumper og overekspression af EPSPS-genet 13) eller følsomhed over for glyphosat (f.eks. glyphosats virkning på mitokondrietransportkæden12).
Selvom GBP’er har eksisteret som et herbicid siden 1974 og er blevet udbredt siden 1991, er dette den første bioinformatikmetode til at bestemme organismers potentielle følsomhed over for glyphosat. Metoden er baseret på identifikation af kendte aminosyrerester i målsekvensen. Vores metode giver således et baseline estimat af glyphosats potentielle effekt på arten. I den nærmeste fremtid bør nye bioinformatikmetoder omfatte yderligere klasser af EPSPS-proteinet for at bestemme den potentielle følsomhed over for glyphosat af uklassificerede sekvenser 12,54,55. I betragtning af at EPSPS-enzymets nøjagtige opførsel kan variere efter enkelte aminosyreændringer 12,14,52,54,55, bør der yderligere i silico-forsøg tages hensyn til små variationer i foldningen af EPSPS-proteinet samt effekten af de EPSPS-associerede domæner på proteinstrukturen i svampe58 . Desuden har det vist sig, at tolerance over for glyphosat kan frembringes ved overekspression af EPSPS-proteinet56,57; således kan bioinformatikanalyser baseret på forbedring af kodonbrug60 anvendes til at identificere nye EPSPS-sekvenser, der maksimerer eller minimerer genekspression.
Landmænd, politikere og beslutningstagere har akut brug for en grundig forståelse af de risici, der er forbundet med den store brug af pesticider. Således er både bioinformatiske værktøjer, der afslører organismernes potentielle følsomhed over for pesticider og velreplikaterede, randomiserede og feltrealistiske eksperimentelle undersøgelser udført i forskellige miljøer, nødvendige. Den præsenterede bioinformatiske metode, der er designet til at undersøge organismers følsomhed over for glyphosat, kan moduleres for andre pesticider. Tilsvarende kan metoderne til eksperimentel økologi anvendes til at studere eventuelle relaterede økologiske spørgsmål. Sammen kan metoderne bruges til at demonstrere tab mellem feltobservationer, genomiske data og pesticidbrug. Alle præsenterede metoder er uvurderlige i risikovurderingen. Bioinformatiske metoder kan f.eks. anvendes til overvågning af mikrobielle tilpasninger til landbrugskemikalier og til at tilvejebringe en kvantitativ metode til at teste de potentielle andre tilknyttede risici, såsom en stigning i patogeners resistens over for landbrugskemikalier, negative virkninger på mikrober, der anvendes som biologiske bekæmpelsesmidler i integreret bekæmpelse af skadegørere (IPM), og antibiotikaresistens i bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi (bevilling nr. 311077 til Marjo Helander).
2100 Bioanalyzer Instrument | INVITEK Molecular | 1037100300 | Genomic DNA extraction from plant tissues |
dNTP mix (10 mM each) | BIO-RAD | 1852196 | For PCR reactions |
GoTaq G2 DNA Polymerase kit | Promega | M7848 | PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification |
Invisorb Spin Plant Mini Kit | Agilent | G2939B | To check the concentration and quality of PCR products |
Ion Chip Minifuge | sage science | PIP0001 | For size fractionation of PCR amplicons |
Ion PGM System | ThermoFisher Scientific | 4462921 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Ion PGM Torrent Server | ThermoFisher Scientific | 4483643 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pippinprep | ThermoFisher Scientific | 4479672 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pressure tank | Berthoud | 102140 | For sprayin glyphosate based products in field |
Primers | ThermoFisher Scientific | R0192 | For PCR amplification |
Rotary tiller | Grillo | 984511 | For tilling the soil in experimental plots |
S1000 ThermalCycler | Sigma-Aldrich | Custom-made | For PCR amplification |