Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

माइक्रोबायोम पर ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पादों के संभावित प्रभाव का परिमाणीकरण

Published: January 10, 2022 doi: 10.3791/63109
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2,3,4
1Biodiversity Unit, University of Turku, 2Department of Biology, University of Turku, 3Nutrition and Health Unit, Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology, Rovira i Virgili University

Summary

ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पाद (जीबीपी) दुनिया भर में सबसे आम व्यापक स्पेक्ट्रम जड़ी-बूटियों हैं। इस लेख में, हम माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव को मापने के लिए सामान्य दिशानिर्देश पेश करते हैं, क्षेत्र प्रयोगों से लेकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तक।

Abstract

ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पाद (जीबीपी) दुनिया भर में सबसे आम व्यापक स्पेक्ट्रम जड़ी-बूटियों हैं। ग्लाइफोसेट का लक्ष्य एंजाइम 5-एनोल्पाइरुविलशिकिमेट-3-फॉस्फेट सिंथेज़ (ईपीएसपीएस) है, जो शिकिमेट मार्ग में है, जो पौधों में लगभग सार्वभौमिक है। एंजाइम का निषेध तीन आवश्यक अमीनो एसिड के उत्पादन को रोकता है: फेनिलएलनिन, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन। ईपीएसपीएस कवक और प्रोकैरियोट्स में भी मौजूद है, जैसे कि आर्किया और बैक्टीरिया; इस प्रकार, GBP के उपयोग का मिट्टी, पौधों, शाकाहारी और माध्यमिक उपभोक्ताओं की माइक्रोबायोम संरचना पर प्रभाव पड़ सकता है। इस लेख का उद्देश्य क्षेत्र प्रयोगों से लेकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तक माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव का आकलन करने और कुछ परीक्षण योग्य परिकल्पनाएं प्रदान करने के लिए सामान्य दिशानिर्देश प्रस्तुत करना है। गैर-लक्ष्य जीवों पर GBP का परीक्षण करने के लिए दो क्षेत्र प्रयोग प्रस्तुत किए जाते हैं। सबसे पहले, 10 दोहराए गए नियंत्रण और जीबीपी उपचार भूखंडों से पौधे से जुड़े रोगाणुओं को नो-टिल क्रॉपिंग का अनुकरण करने के लिए नमूना और विश्लेषण किया जाता है। दूसरे प्रयोग में, ग्लाइफोसेट अवशेषों या गैर-उपचारित नियंत्रण खाद युक्त पोल्ट्री खाद द्वारा निषेचित प्रयोगात्मक भूखंडों से नमूने प्राप्त किए गए थे। EPSPS प्रोटीन अनुक्रमों के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण का उपयोग ग्लाइफोसेट के लिए रोगाणुओं की संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव का अनुमान लगाने में पहला कदम लक्ष्य एंजाइम (EPSPS) के लिए उनकी संभावित संवेदनशीलता निर्धारित करना है। माइक्रोबियल अनुक्रमों को या तो सार्वजनिक भंडारों से या पीसीआर प्रवर्धन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, अधिकांश क्षेत्र अध्ययनों में, माइक्रोबायोम संरचना को सार्वभौमिक डीएनए मार्करों जैसे कि 16 एस आरआरएनए और आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) के आधार पर निर्धारित किया गया है। इन मामलों में, ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशीलता का अनुमान केवल निकटसे संबंधित प्रजातियों का उपयोग करके ईपीएसपीएस अनुक्रमों के संभावित विश्लेषण के माध्यम से लगाया जा सकता है। EPSPS एंजाइम के आधार पर ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता का परिमाणीकरण, लक्ष्य और गैर-लक्ष्य प्रतिरोधी तंत्र का अध्ययन करने के लिए आगे के प्रयोगों के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

आधुनिक कृषि में कीटनाशकों का भारी उपयोग स्पष्ट रूपसे जैव विविधता की गिरावट में एक प्रमुख योगदानकर्ता है। यह पेपर ग्लाइफोसेट पर केंद्रित है क्योंकि ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पाद (जीबीपी) अपनी दक्षता और सस्ती कीमत 2,3 के कारण वैश्विक स्तर पर सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले कीटनाशक बन गए हैं। कृषि क्षेत्रों में खरपतवारों को मारने के अलावा, जीबीपी आमतौर पर सिल्विकल्चर, शहरी वातावरण और घर के बगीचों में उपयोग किए जाते हैं; इसके अतिरिक्त, उन्हें गैर-लक्षित जीवों के लिए नॉनटॉक्सिक के रूप में घोषित किया गया है यदि निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग किया जाता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चला है कि ग्लाइफोसेट के अवशेषों और इसके क्षरण उत्पादों को मिट्टी में बनाए रखा और ले जाया जा सकता है, जिससे गैर-लक्षित जीवों पर कैस्केडिंग प्रभाव पड़ताहै 4,5,6,7,8। ग्लाइफोसेट के प्रभाव केवल पौधों तक ही सीमित नहीं हैं- शिकिमेट मार्ग कई कवक और प्रोकैरियोट्स में भी मौजूद है। ग्लाइफोसेट एंजाइम 5-एनोलपाइरुविलशिकिमेट-3-फॉस्फेट सिंथेज़ (ईपीएसपीएस) को शिकिमेट मार्ग में लक्षित करता है, जिसे एआरओए9 के रूप में भी जाना जाता है। यह एंजाइम तीन आवश्यक सुगंधित अमीनो एसिड (फेनिलएलनिन, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन) के संश्लेषण में शिकिमेट मार्ग के केंद्र में है, और यह अधिकांश प्रोकैरियोट्स, पौधों और कवक10,11 में मौजूद है। कुछ माइक्रोबियल प्रजातियों ने ईपीएसपीएस अनुक्रमों में उत्परिवर्तन सहित कई तंत्रों के माध्यम से ग्लाइफोसेट के लिए आंशिक या पूर्ण प्रतिरोध विकसित किया है। इस प्रकार, यह सुझाव दिया गया है कि जीबीपी के उपयोग का पौधे और पशु माइक्रोबायोम पर सीधा प्रभाव पड़ सकता है, जिसमें मानव आंत माइक्रोबायोम 12,13,14 शामिल हैं। फिर भी, GBP के उपयोग का लगभग किसी भी पारिस्थितिकी तंत्र समारोह और सेवा पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है जो रोगाणुओं और माइक्रोब-सुविधाजनक प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है। परिणामस्वरूप खतरे जैव रासायनिक मिट्टी प्रक्रियाओं, परागण जीव विज्ञान, और पशु और मानव कल्याण की चिंता कर सकते हैं। यह एक और अधिक व्यापक समझ के लिए कहता है कि ग्लाइफोसेट ग्लाइफोसेट ग्लाइफोसेट के लिए रोगाणुओं की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए शिकिमेट मार्गों और तरीकों को कैसे प्रभावित करता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम माइक्रोबायोम पर ग्लाइफोसेट और जीबीपी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक पाइपलाइन पेश करते हैं, क्षेत्र प्रयोगों से लेकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तक। हम हाल ही में प्रकाशित जैव सूचना विज्ञान विधि का विस्तार से वर्णन करते हैं जिसका उपयोग ग्लाइफोसेट12 के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। शोधकर्ताओं के ज्ञान के लिए, यह पहला और अब तक का है, जीबीपी के सक्रिय घटक के लिए एंजाइम ईपीएसपीएस की आंतरिक संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एकमात्र जैव सूचना विज्ञान उपकरण है। यह जैव सूचना विज्ञान विधि ग्लाइफोसेट लक्ष्य एंजाइम (EPSPS)12 में ज्ञात अमीनो एसिड मार्करों का पता लगाने पर आधारित है। पाइपलाइन को पांच मुख्य कामकाजी चरणों (चित्रा 1) में विभाजित किया गया है: 1) जीबीपी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए दो क्षेत्र प्रयोगों का एक संक्षिप्त परिचय, 2) माइक्रोबायोम विश्लेषण (16 एस आरआरएनए, आईटीएस, और ईपीएसपीएस जीन) का एक संक्षिप्त सारांश, 3) सार्वजनिक भंडारों से ईपीएसपीएस अनुक्रमों को इकट्ठा करना, 4) ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता का निर्धारण करना, और 5) सार्वभौमिक माइक्रोबियल मार्करों (16 एस आरआरएनए और आईटीएस) से ईपीएसपीएस वर्ग का आकलन करना।

Protocol

1. दो क्षेत्र प्रयोगों जीबीपी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए

नोट:: यह प्रोटोकॉल संयंत्र से जुड़े रोगाणुओं पर जीबीपी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए फ़ील्ड प्रयोगात्मक डिज़ाइन के दो उदाहरण प्रस्तुत करता है। दोनों प्रयोगों को फिनलैंड में तुर्कू रुइसालो बॉटनिकल गार्डन विश्वविद्यालय (60º26'N, 22º10'E) में हर्बिसाइड या कृषि उपयोगों के पिछले इतिहास के साथ सेट-साइड क्षेत्रों में आयोजित किया गया था। मिट्टी कार्बनिक पदार्थों के उच्च अनुपात के साथ रेतीली मिट्टी है।

  1. प्रयोग 1
    नोट: इस प्रयोग को खरपतवारों का मुकाबला करने के लिए बढ़ते मौसम से पहले और बाद में GBP अनुप्रयोगों के साथ नो-टिल कृषि की सामान्य कृषि प्रथाओं का अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।
    1. प्रयोगात्मक क्षेत्र को 10 प्रतिकृति नियंत्रण और GBP उपचार भूखंडों (23 मीटर x 1.5 मीटर) में विभाजित करें, भूखंडों के बीच वनस्पति के बफर स्ट्रिप्स के साथ (वसंत 201415 में इस अध्ययन में) (चित्रा 2)।
    2. सुनिश्चित करें कि भूखंडों को रोटरी टिलर के साथ 5 सेमी की गहराई तक जुताई की जाती है और वर्ष में दो बार इलाज किया जाता है। यहां, भूखंडों को बढ़ते मौसम की शुरुआत (मई) और अंत (अक्टूबर) में इलाज किया गया था।
    3. नल के पानी (5 एल / प्लॉट) और वाणिज्यिक GBP (glyphosate एकाग्रता 450 ग्राम ) के साथ GBP भूखंडों के साथ नियंत्रण भूखंडों का इलाज करें · एल -1, आवेदन दर 6.4 L · ha -1 प्रति भूखंड नल के पानी के 5 एल में) कृषि प्रथाओं में अधिकतम अनुमत ग्लाइफोसेट खुराक की नकल करने के लिए (3 kg · ha -1)।
    4. एक हाथ से संचालित दबाव टैंक है कि एक मैनुअल स्प्रेयर है के साथ उपचार लागू होते हैं. GBP आवेदन के दो सप्ताह बाद, बोना जई (Avena sativa), faba बीन्स (Vicia faba), शलजम बलात्कार (Brasica rapa subsp. oleifera), और संयंत्र आलू (सोलनम tuberosum) कृषि प्रथाओं के अनुसार भूखंडों में.
    5. बढ़ते मौसम के दौरान, पौधों की प्रतियोगिता और मिट्टी की संरचना को नियंत्रण और GBP-उपचारित भूखंडों में यथासंभव समान रखने के लिए भूखंडों को हाथ से खरपतवार करें।
    6. प्रयोगात्मक पौधों से माइक्रोबायोटा का नमूना लें। इस अध्ययन में, माइक्रोबायोटा को 2017 से 2020 तक लगातार GBP-उपचारित और नियंत्रण उपचार भूखंडों दोनों में अध्ययन के दौरान बढ़ते मौसम में एक बार नमूना दिया गया था।
    7. खेत से पौधे के नमूनों (जड़ और पत्ती) की दस प्रतिकृतियों को इकट्ठा करें, तुरंत उन्हें बर्फ पर रखें, और उन्हें आगे के प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में लाएं, जैसा कि धारा 2.1 में वर्णित है।
  2. प्रयोग 2
    नोट: इस प्रयोग को परिपत्र खाद्य अर्थव्यवस्था से जुड़े जोखिमों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था; अधिक सटीक रूप से, इसे फसल पौधों के लिए उर्वरक के रूप में लागू खाद में GBP अवशेषों के परिणामों की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था2 (चित्रा 3)।
    1. लकड़ी के शेविंग, मल, और कुछ बिखरे हुए फ़ीड सहित बिस्तरों को इकट्ठा करें, 12 महीने के एवियरी प्रयोग16,17 में GBP-दूषित या नियंत्रण फ़ीड पर खिलाए गए बटेर से।
      नोट: GBP-दूषित फ़ीड में 160 मिलीग्राम ग्लाइफोसेट / किग्रा के बराबर के साथ संयुक्त मुर्गियों को बिछाने के लिए कार्बनिक फ़ीड शामिल था, जो वयस्क जापानी बटेर 16,17 में प्रति किलोग्राम शरीर द्रव्यमान 12-20 मिलीग्राम ग्लाइफोसेटके दैनिक सेवन से मेल खाता है।
    2. सत्यापन के लिए, फ़ीड के छह बैचों में ग्लाइफोसेट एकाग्रता माप के लिए नमूनों को एक मान्यता प्राप्त प्रयोगशाला में भेजें।
    3. इसके अलावा, एक्सपोजर के 12 महीनों के बाद बटेर मल के नमूनों में ग्लाइफोसेट अवशेषों को मापें। नियंत्रण समूह को कोई GBP अतिरिक्त16,17 के साथ एक ही कार्बनिक फ़ीड खिलाया गया था।
    4. Aviary प्रयोग के दौरान, बिस्तर द्वि-साप्ताहिक बदलें। GBP उपचार और नियंत्रण, प्रति उपचार पूल से एक्सपोजर के 8-12 महीनों से नियमित रूप से उपयोग किए गए बिस्तरों को इकट्ठा करें, और उर्वरक के रूप में उपयोग करने से पहले 6 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखे, अंधेरे भंडारण कमरे में बंद कंटेनरों में स्टोर करें।
    5. दो समय बिंदुओं पर प्रयोगात्मक क्षेत्र में 6 x 6 शतरंज के बोर्ड ग्रिड में 18 GBP और 18 नियंत्रण भूखंडों (आकार 1 मीटर x 1 मीटर) में से प्रत्येक पर मैन्युअल रूप से बिस्तरों के 12 एल फैलाएं। इस अध्ययन में, बिस्तर अगस्त 2018 में और मई 2019 में फैल गए थे।
    6. इसे फैलने के बाद सीधे ग्लाइफोसेट एकाग्रता माप के लिए एक मान्यता प्राप्त प्रयोगशाला में बिस्तर के नमूने भेजें (मई 2019 में इस अध्ययन में)।
    7. अपनी जड़ और पत्ती माइक्रोबायोटा का अध्ययन करने के लिए प्रत्येक भूखंड में बारहमासी घास और स्ट्रॉबेरी के पौधे लगाएं।
      नोट: इस अध्ययन में चार बारहमासी घास के पौधों (फेस्टुका प्रैटेंसिस), और दो स्ट्रॉबेरी पौधों (Fragaria x vescana) को प्रत्येक भूखंड पर लगाया गया था और उनकी जड़ और पत्ती माइक्रोबायोटा के लिए अध्ययन किया गया था।

2. माइक्रोबायोम विश्लेषण (16S rRNA, ITS और EPSPS जीन)

नोट: अधिकांश माइक्रोबायोम अध्ययन अगली पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके कवक समुदायों के लिए बैक्टीरिया और आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्रों के लिए 16 एस आरआरएनए जीन के विश्लेषण पर आधारित हैं। इस प्रकार, पेपर में EPSPS के प्रकार के बारे में जानकारी नहीं है। हजारों प्रजातियों के ईपीएसपीएस अनुक्रम सार्वजनिक भंडारों (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) (चित्रा 4) में उपलब्ध हैं।

  1. 16S rRNA जीन
    1. ऊपर वर्णित प्रयोगों में एकत्र किए गए अलग-अलग पत्ते और जड़ के नमूनों से, एंडोफाइटिक रोगाणुओं (यानी, पौधे के ऊतकों के अंदर रहने वाले रोगाणुओं) की पहचान करें।
    2. नल के पानी के साथ पौधे के नमूनों को धोएं और फिर एपिफाइटिक रोगाणुओं (यानी, पौधे के ऊतकों की सतह पर रोगाणुओं) को हटाने के लिए उन्हें निष्फल करें। 3 मिनट के लिए 3% ब्लीच का उपयोग करके निष्फल करें, इसके बाद 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल समाधान हो, और प्रत्येक 1 मिनट के लिए ऑटोक्लेव्ड अल्ट्राप्योर पानी के साथ तीन बार धोएं।
    3. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को फ्रीज करें।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संयंत्र डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण करें।
    5. 16S rRNA जीन के चर क्षेत्रों V6-V8 को लक्षित करें, जो कि भेदभाव करने वाले प्राइमरों के साथ एक नेस्टेड दृष्टिकोण का उपयोग करके निकाले गए डीएनए नमूनों से हैं जो विशेष रूप से बैक्टीरिया डीएनए18 से बांधते हैं, इस प्रकार मेजबान पौधे डीएनए से प्रवर्धन को कम करते हैं।
    6. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के तीन दौर के बाद, लक्ष्य जीन को बारकोड और एडाप्टर अनुक्रमों के साथ टैग करें ताकि इसे अनुक्रमण के लिए टेम्पलेट के रूप में तैयार किया जा सके। पीसीआर प्रवर्धन के लिए चरण 2.1.7- 2.1.11 का पालन करें
    7. नमूनों की आवश्यक संख्या के लिए पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि प्रत्येक प्रतिक्रिया में 30 μLof कुल मात्रा हो और इसमें 30 एनजी डीएनए, 1x पीसीआर बफर, 0.2 एमएम dNTPs, प्रत्येक प्राइमर के 0.3 μM, और 2000 U / mL डीएनए पोलीमरेज़ शामिल हों। पीसीआर के दूसरे और तीसरे दौर के लिए एक ही चरण का पालन करें।
    8. पीसीआर के पहले दौर के लिए, प्राइमर 799F19 और 1492R (20 से संशोधित) (तालिका 1) का उपयोग करें। थर्मोसाइकलर पर प्रवर्धन प्रोफ़ाइल सेट करें (95 डिग्री सेल्सियस पर 3-मिनट प्रारंभिक विकृतीकरण, इसके बाद 45 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 35 चक्र, 45 सेकंड के लिए 54 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार)। 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार करें।
    9. पीसीआर के दूसरे दौर के लिए टेम्पलेट के रूप में, वैद्युतकणसंचलन (1.5% एगारोज़ जेल पर पीसीआर उत्पादों के 5 μL) द्वारा प्रवर्धन को सत्यापित करें और फिर 1: 10 के अनुपात में ऑटोक्लेव्ड अल्ट्राप्योर पानी में पीसीआर उत्पाद के बाकी 25 μL को पतला करें।
    10. पतला पीसीआर टेम्पलेट्स और प्राइमर यूनि -1062 एफ 21 और यूनि -1390आर 22 (तालिका 1) के साथ पीसीआर को दोहराएं। चक्रों की संख्या को 25 तक कम करने के अलावा एक ही पीसीआर प्रतिक्रिया स्थितियों और प्रवर्धन प्रोफ़ाइल (चरण 2.1.8) को बनाए रखें।
    11. 1: 1 के अनुपात में ऑटोक्लेव्ड अल्ट्राप्योर पानी में परिणामी पीसीआर उत्पादों को पतला करें। चरण 2.1.8 में उल्लिखित एक ही पीसीआर प्रोफ़ाइल के 8 चक्रों के साथ बारकोड और पी 1-एडाप्टर अनुक्रम के साथ उत्पादों को टैग करने के लिए पीसीआर का तीसरा दौर करें।
  2. पुस्तकालय की तैयारी
    1. एक bioanalyzer पर पीसीआर उत्पादों की एकाग्रता और गुणवत्ता को सत्यापित करें और एक equimolar पुस्तकालय तैयार करने के लिए एक 1.5 mL ट्यूब में प्रत्येक नमूने के डीएनए के 30 एनजी का गठन मात्रा पूल।
    2. एक agarose जेल कैसेट पर एक स्वचालित डीएनए आकार चयन प्रणाली का उपयोग कर आकार fractionation द्वारा आकार 350-550 बीपी के amplicons का चयन करें। ध्यान दें कि यह पुस्तकालय से गैर-विशिष्ट एम्प्लिकॉन और पीसीआर अभिकर्मकों को भी समाप्त करता है। कैसेट में एक शीशी में निर्दिष्ट आकार के amplicons से मिलकर elute ले लीजिए, एक शुद्ध 16S rRNA जीन पुस्तकालय में जिसके परिणामस्वरूप.
    3. पिपेट एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में elute बाहर और शुद्धता और bioanalyzer पर एकाग्रता सत्यापित करें। 26 पीएम की अंतिम एकाग्रता के लिए ऑटोक्लेव्ड अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके डीएनए लाइब्रेरी को पतला करें; नमूना अनुक्रमण के लिए तैयार है।
  3. यह है
    नोट:: ITS क्षेत्र ITS-विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया है, और परिणामी PCR उत्पाद बारकोड और अनुक्रमण के लिए एक P1-एडाप्टर अनुक्रम के साथ लेबल किया गया है।
    1. आईटीएस प्राइमरों के साथ अनुभाग 2.1 में उल्लिखित उसी प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    2. थर्मोसाइकिलर पर प्रवर्धन प्रोफ़ाइल को 95 डिग्री सेल्सियस पर 5-मिनट के प्रारंभिक विकृतीकरण के रूप में सेट करें, इसके बाद 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृत, एनीलिंग और विस्तार के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 7 मिनट के लिए अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस।
    3. 1.5% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 5 μL का विश्लेषण करें और autoclaved ultrapure पानी का उपयोग कर शेष 25 μL को 1:10 तक पतला करें। पीसीआर के दूसरे दौर के लिए टेम्पलेट के रूप में पतला पीसीआर उत्पाद का उपयोग करें।
    4. बारकोड-टैग किए गए फॉरवर्ड प्राइमरों और P1-एडाप्टर टैग किए गए रिवर्स प्राइमरों के साथ नमूनों की आवश्यक संख्या (चरण 2.1.6 को देखें) के लिए पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें। चरण 2.3.2 के रूप में एक ही प्रवर्धन प्रोफ़ाइल के साथ बढ़ाएँ, 8 चक्रों का उपयोग करने को छोड़कर।
    5. अनुभाग 2.2 में उल्लिखित प्रोटोकॉल के अनुसार अनुक्रमण के लिए परिणामी पीसीआर उत्पादों को तैयार करें।
  4. EPSPS जीन
    1. अनुक्रम और रोगाणुओं के EPSPS जीन का विश्लेषण.
      नोट: यह पता लगाने के हित में कि क्या GBP एक्सपोजर ने समुदाय में ग्लाइफोसेट-संवेदनशील और प्रतिरोधी रोगाणुओं की संरचना को बदल दिया है, रोगाणुओं के EPSPS जीन को अनुक्रमित और विश्लेषण करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, संरेखित तंग जीनोमिक क्लस्टर (एटीजीसी) डेटाबेस में माइक्रोबियल टैक्सा के एक विस्तृत संग्रह से ईपीएसपीएस जीन के 353 अनुक्रमों को इकट्ठा किया गया था, और सभी प्रोटीन अनुक्रमों को22 संरेखित किया गया था। ये संरेखण ATGC डेटाबेस23 पर उपलब्ध हैं और संरक्षित क्षेत्रों से प्राइमर उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। एक आसान-से-उपयोग जैव सूचना विज्ञान उपकरण को एकाधिक अनुक्रम संरेखण से संरक्षित क्षेत्रों की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और यह पेरे प्यूग्बो अनुसंधान पृष्ठ24 पर उपलब्ध है। हालांकि, यह इस वेब सर्वर का एक विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए इस प्रकाशन के दायरे से बाहर है। फिर भी, ग्लाइफोसेट के लिए माइक्रोबायोम की संवेदनशीलता को खोजने के लिए ईपीएसपीएस जीन के प्रवर्धन के लिए इन प्राइमरों का उपयोग करने के लिए एक संभावित प्रोटोकॉल चित्र 4 में प्रदान किया गया है।

3. सार्वजनिक भंडार से EPSPS प्रोटीन अनुक्रमों को इकट्ठा करना

  1. मैक्रोइवोल्यूशन अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले EPSPS अनुक्रम
    1. सार्वजनिक भंडारों जैसे PFAM23 (प्रोटीन परिवारों 25 का एक डेटाबेस), GenBank24 (जीन, जीनोम और प्रोटीन26 का एक डेटाबेस), COG 25 (ऑर्थोलॉगस समूह 27 के क्लस्टर; आर्किया और बैक्टीरिया से ऑर्थोलॉगस प्रोटीन का एक डेटाबेस) से ईपीएसपीएस प्रोटीन इकट्ठा करें; और पीडीबी26 (प्रोटीन डेटा बैंक28; प्रोटीन संरचनाओं का एक डेटाबेस)।
      नोट: शोधकर्ताओं द्वारा किए गए एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि इन प्रोटीनों का उपयोग शिकिमेट मार्ग12 वाले जीवों पर ग्लाइफोसेट के संभावित प्रभाव के माइक्रोवोल्यूशनरी और तुलनात्मक विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। लेखकों ने एक उपयोगकर्ता के अनुकूल वेबसाइट विकसित की है जो हजारों ईपीएसपीएस प्रोटीन अनुक्रमों29 पर जानकारी एकत्र करती है, जिसमें मानव आंत माइक्रोबायोम12 से प्रोटीन का मैन्युअल रूप से क्यूरेट किया गया डेटासेट शामिल है। इन पूर्व-परिकलित डेटासेट में दी गई जानकारी में वर्तमान ईपीएसपीएस वर्गीकरण को ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशील और प्रतिरोधी, प्रजातियों पर टैक्सोनोमिक जानकारी, ईपीएसपीएस सक्रिय साइट के एनोटेशन और पीडीबी और एनसीबीआई डेटाबेस के लिंक में शामिल किया गया है। इसके अलावा, वेबसर्वर में EPSPS के आईडी कोड और कई बाहरी डेटाबेस (तालिका 2) के लिंक शामिल हैं।
  2. ईपीएसपीएस अनुक्रमों का उपयोग माइक्रोइवोल्यूशन अध्ययन एटीजीसी में किया जाना है
    नोट: प्रोटीन अनुक्रमों के सामान्य भंडार अपेक्षाकृत दूर के जीवों के बीच तुलनात्मक अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं; हालांकि, ग्लाइफोसेट का संभावित प्रभाव विकासवादी दृष्टिकोण से अपेक्षाकृत हाल ही में है। इस प्रकार, कुछ अध्ययनों में, ग्लाइफोसेट14 के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए निकटता से संबंधित प्रजातियों (उदाहरण के लिए, एक ही जीवाणु प्रजातियों से विभिन्न उपभेदों) की तुलना करना आवश्यक है। इन मामलों में, Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC)30 का डेटाबेस, जिसमें निकटता से संबंधित आर्कियल और बैक्टीरियल जीनोम की एक व्यापक सूची शामिल है, एक अधिक अनुकूल संसाधन है। एटीजीसी डेटाबेस में सैकड़ों समूहों में संगठित हजारों जीनोम से कई मिलियन प्रोटीन की जानकारी होतीहै। प्रत्येक जीनोम क्लस्टर संरेखित है (जीनोम ≥अपनी लंबाई का 85%) और तंग (संतृप्ति के नीचे एक पर्यायवाची प्रतिस्थापन दर होने) पर सिंटेनी साझा करते हैं। शोधकर्ताओं ने हाल के एक अध्ययन में ईपीएसपीएस प्रोटीन14 में माइक्रोइवोल्यूशनरी परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए एटीजीसी डेटासेट का उपयोग किया। ATGC में EPSPS प्रोटीन अनुक्रम की पहचान करने के लिए निम्न चरणों की आवश्यकता है:
    1. एक स्थानीय परियोजना में31 लिंक और COG0128 के सभी प्रोटीन (डेटाबेस में EPSPS प्रोटीन के अनुरूप कोड) 32 से ATGCs के पूरे डेटाबेस डाउनलोड करें।
      नोट: यदि शोधकर्ता / प्रयोगकर्ता फिनलैंड में स्थित हैं, तो CSC-IT Center for Science33 भंडारण और सॉफ़्टवेयर सुविधाएं प्रदान करता है। FASTA प्रारूप में सभी अनुक्रमों को इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है।
    2. COG0128 का एक विस्फोट डेटाबेस बनाया गया है जिसमें प्रोकैरियोट्स की प्रजातियों के एक प्रतिनिधि सेट में EPSPS प्रोटीन के ऑर्थोलॉग्स होते हैं। CSC विस्फोट कार्यक्रम34 preinstalled है, आदेश makeblastdb के उपयोग की अनुमति देता है -COG0128.fa में -dbtype prot EPSPS अनुक्रमों का एक संदर्भ डेटाबेस बनाने के लिए।
    3. COG0128.fa (EPSPS प्रोटीन) पर ATGC डेटाबेस मैप कमांड ब्लास्टप -क्वेरी [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150 के साथ एक पुनरावर्ती विस्फोट खोज का उपयोग कर।
    4. नतीजतन, यह प्रत्येक के भीतर ईपीएसपीएस प्रोटीन अनुक्रमों का डेटासेट बनाता है। ATGC डेटाबेस से निकटता से संबंधित EPSPS प्रोटीन अनुक्रमों का एक पूर्व-परिकलितडेटासेट उपलब्ध है।

4. एल्गोरिथ्म glyphosate करने के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए (EPSPSClass वेब सर्वर: इनपुट, प्रसंस्करण, और outputs)

नोट: शोधकर्ताओं ने EPSPS प्रोटीन अनुक्रम 12,35 के वर्ग को निर्धारित करने के लिए 29 पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है कि एक आसान-से-उपयोग सर्वर लागू किया है। सर्वर को केवल EPSPS वर्गों में से प्रत्येक के लिए पहचान प्रतिशत और ग्लाइफोसेट के लिए उनकी संभावित संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए FASTA प्रारूप में प्रोटीन अनुक्रम के इनपुट की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, उपयोगकर्ता अपने स्वयं के संदर्भ अनुक्रमों और अमीनो एसिड मार्करों का परीक्षण करने के लिए वेबसर्वर का उपयोग कर सकते हैं। सबसे पहले, एल्गोरिथ्म (चित्रा 5) अमीनो एसिड की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक से अधिक अनुक्रम संरेखण प्रोग्राम35 का उपयोग करके क्वेरी अनुक्रमों और संदर्भ अनुक्रमों को संरेखित करता है। फिर, यह क्वेरी अनुक्रम के EPSPS वर्ग (I, II, III, या IV) की पहचान करने के लिए अमीनो एसिड मार्करों की उपस्थिति की खोज करता है।

  1. एंजाइम (चित्रा 6A) के वर्ग की पहचान करने के लिए इनपुट टेक्स्ट बॉक्स में FASTA स्वरूप में एक EPSPS प्रोटीन अनुक्रम का परिचय दें, और भेजें दबाएँ.
  2. प्रदान किए गए आउटपुट से ग्लाइफोसेट (चित्रा 6B-E) के लिए क्वेरी अनुक्रम की संभावित संवेदनशीलता का आकलन करें:
    आउटपुट 1: क्वेरी अनुक्रमों (कक्षा I, II, और IV) में मौजूद अमीनो एसिड मार्करों (यानी, पहचान) का अंश, और रूपांकनों की संख्या (वर्ग III)।
    आउटपुट 2: क्वेरी और मार्कर अवशेषों के आधार पर संदर्भ अनुक्रमों के संरेखण।
    आउटपुट 3: क्वेरी और संदर्भ अनुक्रमों के पूर्ण pairwise संरेखण.
    आउटपुट 4: EPSPS संदर्भ अनुक्रम: Vibrio cholerae (vcEPSPS, वर्ग I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, वर्ग II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, कक्षा III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, वर्ग IV)।
  3. आउटपुट पृष्ठ के अंत में, क्वेरी EPSPS अनुक्रम (चित्रा 6F) का आगे विश्लेषण करने के लिए ब्लास्टप और संरक्षित डोमेन जैसे बाहरी उपकरणों के लिंक ढूँढें.

5. सार्वभौमिक माइक्रोबियल मार्करों (16S rRNA और ITS ) से EPSPS वर्ग का आकलन

नोट: अधिकांश माइक्रोबायोम अध्ययन 16S rRNA और / या ITS36 के विश्लेषण पर आधारित हैं। ऐसे मामलों में, EPSPS अनुक्रम का प्रत्यक्ष विश्लेषण करना संभव नहीं है। इस प्रकार, ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता का अनुमान लगाने के लिए एक संभाव्य दृष्टिकोण आवश्यक है। यह विश्लेषण सीधा है और माइक्रोबायोम परियोजना में EPSPS अनुक्रमों के प्रकार का एक उचित अनुमान प्रदान करता है। प्रक्रिया को 3 चरणों में विभाजित किया गया है (चित्र 7 और चित्र8):

  1. सार्वजनिक भंडारों से EPSPS अनुक्रमों की पहचान करें। प्रतिनिधि अनुक्रमों के एक व्यापक डेटासेट के EPSPS वर्ग को PFAM37, GenBank 38, COG39, PDB40, ATGC30 से संकलित और पूर्व-परिकलित किया गयाहै। इन डेटासेट को EPSPSClass सर्वर के मुख्य पृष्ठ से एक्सेस करें, जिसमें टैक्सोनोमिक जानकारी और 50,000 से अधिक अनुक्रमों का EPSPS वर्ग (चित्रा 7) शामिल है।
  2. बढ़ते मौसम के दौरान प्रयोगात्मक पौधों की ऊंचाई को द्विसाप्ताहिक रूप से मापें, और GBP में पौधों के विकास की तुलना करने और भूखंडों को नियंत्रित करने के लिए क्षेत्र के मौसम के अंत में पौधों के ऊपर के बायोमास का वजन करें।
    नोट: क्षेत्र प्रयोगों से माइक्रोबायोटा विश्लेषण अभी तक पूरी तरह से विश्लेषण नहीं किया गया है।
  3. माइक्रोबायोम प्रयोगों से पूर्व-परिकलित डेटासेट में बैक्टीरियल ओटीयू (16एस आरआरएनए या आईटीएस के आधार पर) को मैप करने के लिए एक स्प्रेडशीट का उपयोग करें।
    नोट: पिछले अध्ययनों से पता चला है कि EPSPS वर्ग (यानी, ग्लाइफोसेट के लिए आंतरिक संवेदनशीलता) एक phylogenetic समूह14 के भीतर अत्यधिक संरक्षित है। इस प्रकार, यह मानना अपेक्षाकृत सुरक्षित है कि अत्यधिक संरक्षित टैक्सन से निकटता से संबंधित प्रजातियों में ग्लाइफोसेट (चित्रा 8) के लिए समान ईपीएसपीएस प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं।
  4. एक ही स्प्रेडशीट में, एक संभाव्य स्कोर (S = s / (s + r + u) के आधार पर ग्लाइफोसेट के लिए आंतरिक संवेदनशीलता की गणना करें, जहां S: संवेदनशीलता स्कोर; s: संभावित संवेदनशील अनुक्रमों की संख्या; r: संभावित प्रतिरोधी अनुक्रमों की संख्या; u: अवर्गीकृत अनुक्रमों की संख्या) सार्वजनिक डेटाबेस में ज्ञात EPSPS अनुक्रमों से गणना की जाती है।
    नोट:: यह स्कोर 0 (कोई संवेदनशील EPSPS अनुक्रम एक taxon में पाए जाते हैं) से 1 (एक taxon में सभी अनुक्रम ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशील हैं) (चित्रा 8) से लेकर है। इसके अलावा, मूल्यों के बीच में हैं- यानी, संवेदनशील, प्रतिरोधी या अज्ञात उपभेदों के साथ प्रजातियां।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक सामान्य पाइपलाइन प्रदान करना है, क्षेत्र प्रयोगों से लेकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तक, जो हर्बिसाइड ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करता है। प्रयोग 2 में बटेर फ़ीड में औसत ग्लाइफोसेट सांद्रता 164 मिलीग्राम / किलोग्राम थी और मल-मूत्र के नमूनों (मूत्र और फेकल पदार्थ संयुक्त) की औसत ग्लाइफोसेट एकाग्रता 199 मिलीग्राम / किग्रा थी। GBP-दूषित फ़ीड के साथ खिलाए गए बटेर से एकत्र किए गए बिस्तरों में औसतन, 158 मिलीग्राम / किलोग्राम और 0.17 मिलीग्राम / किलोग्राम ग्लाइफोसेट (तालिका 3) को मापने वाले नियंत्रण बेडिंग थे। क्षेत्र प्रयोगों में, पौधों की प्रजातियों ने मिट्टी में ग्लाइफोसेट अवशेषों के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया व्यक्त की (खंड 1)। जई और शलजम बलात्कार का बायोमास GBP-उपचारित मिट्टी की तुलना में नियंत्रण मिट्टी में अधिक था। हालांकि, फैबा बीन्स और आलू बढ़ते मौसम15 के अंत में GBP उपचार से लाभान्वित होने के लिए दिखाई दिए। पोल्ट्री खाद में ग्लाइफोसेट ने घास (फेस्टुका प्रैटेंसिस) और स्ट्रॉबेरी (फ्रैगरिया एक्स वेस्काना) (खंड 1) में पौधे की वृद्धि को कम कर दिया। क्षेत्र प्रयोगों से माइक्रोबायोटा विश्लेषण अभी तक पूरी तरह से विश्लेषण नहीं किया गया है और यहां प्रस्तुत नहीं किया गया है (खंड 2)। इस प्रोटोकॉल के परिणाम, जब या तो सीधे (जैसा कि खंड 3 और 4 में दिखाया गया है) या अप्रत्यक्ष रूप से (अनुभाग 5) को पढ़ा जाता है, तो डेटासेट में ग्लाइफोसेट के लिए संभावित संवेदनशील और प्रतिरोधी जीवों के अनुपात का एक उपाय प्रदान करते हैं (चित्रा 9)। इस विधि के उपयोग का परीक्षण कोर मानव आंत माइक्रोबायोम की माइक्रोबियल प्रजातियों से ईपीएसपीएस प्रोटीन अनुक्रमों के संग्रह के साथ किया गया था जो सार्वजनिक भंडार12 से प्राप्त किए गए थे। अध्ययन में, 101 सबसे प्रचुर मात्रा में बैक्टीरिया प्रजातियों के 890 उपभेदों का विश्लेषण संवेदनशील और प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अनुपात को मापने के लिए EPSPSClass विधि के साथ किया गया था। परिणामों से पता चला है कि कोर मानव आंत माइक्रोबायोम में 54% प्रजातियां ग्लाइफोसेट12 के प्रति संभावित रूप से संवेदनशील हैं। यह प्रवृत्ति अधिकांश प्रोकैरियोटिक दुनिया में भी देखी जाती है; इसके अतिरिक्त, यूकेरियोट्स (मुख्य रूप से पौधों और कवक) में, संभावित संवेदनशील प्रजातियों का अनुपात और भी अधिकहै 12। इसके अलावा, हमने इस विधि का उपयोग माइक्रोइवोल्यूशनरी स्तर पर ईपीएसपीएस प्रोटीन में संवेदनशीलता में परिवर्तन को मापने के लिए किया है (चित्रा 10)14। हमने विश्लेषण किए गए प्रोकैरियोट्स के 32 निकटसे संबंधित समूहों में से 12 में संवेदनशीलता की स्थिति में परिवर्तन की पहचान की (तालिका 4)14। इस प्रकार, जीबीपी का निरंतर उपयोग पौधे, जानवरों और मिट्टी के माइक्रोबायोम में माइक्रोबियल डिस्बियोसिस (यानी, संवेदनशील और प्रतिरोधी जीवाणु प्रजातियों का असंतुलन) का उत्पादन कर सकता है। इसके अलावा, यह परिकल्पना की गई है कि ग्लाइफोसेट-प्रतिरोधी बैक्टीरिया में वृद्धि मल्टीड्रग-प्रतिरोधी माइक्रोबायोम14,41,42 को बढ़ावा दे सकती है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल इन सभी परिदृश्यों की व्याख्या पर प्रकाश डालता है, क्योंकि ईपीएसपीएस वर्गीकरण विधि ग्लाइफोसेट के लिए माइक्रोबायोम की आंतरिक संवेदनशीलता का प्रत्यक्ष अनुमान प्रदान करती है। ग्लाइफोसेट के लिए ईपीएसपीएस प्रोटीन की आंतरिक संवेदनशीलता के कारण फाइलोजेनेटिक रूप से संरक्षित14 है, मौजूदा डेटासेट से परिणामों को अज्ञात माइक्रोबायोम (चित्रा 8) में एक्सट्रपलेशन करना संभव है।

Figure 1
चित्रा 1: सामान्य पाइपलाइन यह क्षेत्र प्रयोगों से जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए GBP के प्रति संवेदनशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक सामान्य पाइपलाइन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फसल पौधे से जुड़े रोगाणुओं पर GBP अवशेषों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए क्षेत्र प्रयोग 1। प्रयोगात्मक क्षेत्र में बारी-बारी से 10 नियंत्रण भूखंड और 10 GBP उपचार भूखंड (23 मीटर x 1.5 मीटर) भूखंडों के बीच 1.5 मीटर बफर स्ट्रिप्स होते हैं। 2014 के बाद से साल में दो बार, GBP भूखंडों को वाणिज्यिक GBP (ग्लाइफोसेट एकाग्रता 450 ग्राम एल -1, आवेदन दर 6.4 एल हेक्टेयर -1 प्रति भूखंड नल के पानी के 5 एल में) और ग्लाइफोसेट के बिना नल के पानी की समान मात्रा के साथ नियंत्रण भूखंडों के साथ इलाज किया गया था। उपचार को उपचार भूखंडों के बाहर फैलने से जीबीपी की रक्षा करने के लिए स्प्रिंकलर टिप में एक प्लास्टिक हुड का उपयोग करके हाथ से संचालित दबाव टैंक के साथ लागू किया गया था। GBP आवेदन के बाद दो सप्ताह की सुरक्षा अवधि के बाद, जई (Avena sativa), faba बीन्स (Vicia faba), और शलजम बलात्कार (Brasica rapa subsp. oleifera) बोया गया था, और आलू (सोलनम ट्यूबरोसम) भूखंडों में लगाए गए थे। अध्ययन किए गए फसल पौधों, पत्तियों और जड़ों से माइक्रोबायोटा के नमूने, 2014 में प्रयोग की शुरुआत के बाद से कई बार एकत्र किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: क्षेत्र प्रयोग 2 ने दो बारहमासी फसलों और उनके संबंधित माइक्रोबायोटा के लिए खाद उर्वरक में GBP अवशेषों के परिणामों का परीक्षण किया। नियंत्रण या GBP-दूषित फ़ीड के साथ खिलाए गए जापानी बटेर के साथ 12 महीने के एवियरी प्रयोग से एकत्र किए गए बिस्तरों का उपयोग क्षेत्र प्रयोग में खाद उर्वरक के रूप में किया गया था। प्रयोगात्मक क्षेत्र में 18 नियंत्रण और 18 GBP भूखंड (1 मीटर x 1 मीटर) शामिल थे जो 6 x 6 शतरंज के ग्रिड में व्यवस्थित थे। बिस्तरों को अगस्त 2018 और मई 2019 (25 एल / प्लॉट) में दो बार प्रयोगात्मक क्षेत्र में फैलाया गया था। नियंत्रण भूखंडों को नियंत्रण फ़ीड के साथ खिलाए गए बटेर से एकत्र किए गए बिस्तरों के साथ निषेचित किया गया था और GBP-दूषित फ़ीड के साथ खिलाए गए बटेर से बिस्तरों के साथ GBP भूखंडों को खिलाया गया था। नियंत्रण बिस्तरों में ग्लाइफोसेट अवशेष 0.17 मिलीग्राम / किलोग्राम ग्लाइफोसेट थे और जीबीपी-बिस्तर में, मात्रा 158 मिलीग्राम / किलोग्राम ग्लाइफोसेट थी। दो एंडोफाइट-सहजीवी (ई +), दो एंडोफाइट-मुक्त (ई-) फेस्टुका प्रैटेंसिस, और दो फ्रैगारिया एक्स वेस्काना को सितंबर 2018 में प्रति प्लॉट लगाया गया था, पहले बिस्तर के प्रसार के लगभग एक महीने बाद। पौधे के प्रदर्शन और फिटनेस के माप के साथ-साथ जड़-और पत्ती से जुड़े माइक्रोबायोटा के लिए नमूनाकरण लगातार दो बढ़ते मौसमों (2019 और 2020) के दौरान आयोजित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: 16S rRNA जीन/ITS क्षेत्र का उपयोग करके माइक्रोबियल टैक्सा का विश्लेषण और EPSPS जीन का उपयोग करके ग्लाइफोसेट करने के लिए माइक्रोबायोम की संवेदनशीलता। (A) माइक्रोबियल टैक्सा की पहचान करने के लिए 16S rRNA या ITS अनुक्रमों का विश्लेषण। (बी) ग्लाइफोसेट के लिए रोगाणुओं की संवेदनशीलता की पहचान करने के लिए ईपीएसपीएस अनुक्रमों का विश्लेषण (जीएस-ग्लाइफोसेट संवेदनशील / जीआर-ग्लाइफोसेट प्रतिरोधी) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ईपीएसपीएस प्रोटीन अनुक्रमों के वर्ग की पहचान करने के लिए एल्गोरिथ्म। इनपुट फास्टा प्रारूप में एक EPSPS प्रोटीन अनुक्रम है। एल्गोरिथ्म संदर्भ प्रोटीन अनुक्रमों में ज्ञात अमीनो एसिड मार्करों के साथ तुलना करता है जो ग्लाइफोसेट के लिए संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करता है। एल्गोरिथ्म को स्वतंत्र रूप से सुलभ वेब सर्वर EPSPSClass29 पर लागू किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: बुनियादी इनपुट और EPSPSClass वेब सर्वर के outputs. (ए) इनपुट: फास्टा प्रारूप में एक ईपीएसपीएस प्रोटीन अनुक्रम। (बी) आउटपुट 1 - पहचान: क्वेरी अनुक्रमों (कक्षा I-IV) और रूपांकनों (कक्षा III) में मौजूद अमीनो एसिड मार्करों का अंश। (सी) आउटपुट 2 - पहचान: क्वेरी और संदर्भ अनुक्रमों के संरेखण। (डी) आउटपुट 3 - क्वेरी और संदर्भ अनुक्रमों के युग्मवार संरेखण। (ई) संदर्भ EPSPS अनुक्रम: Vibrio cholerae (vcEPSPS, वर्ग I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, वर्ग II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, वर्ग III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, वर्ग IV)। (एफ) इसके अलावा ब्लास्टप खोजों और संरक्षित डोमेन की पहचान करने के लिए लिंक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: EPSPS अनुक्रमों के पूर्व-परिकलित डेटासेट तक पहुँच. EPSPS अनुक्रमों के पूर्व-परिकलित डेटासेट तक पहुँचने के लिए आकृति में संकेतों का पालन करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: EPSPS अनुक्रमों के बिना माइक्रोबायोम परियोजनाओं में संभावित संवेदनशीलता का अनुमान लगाने के तरीके का उदाहरण। उदाहरण संरेखित तंग जीनोमिक क्लस्टर30 के डेटाबेस से मानों का उपयोग करता है, जिसमें प्रोकैरियोटिक प्रजातियों के अनुक्रम शामिल हैं। एक माइक्रोबायोम परियोजना से काल्पनिक प्रजातियां Staphylococcus aureus, Corynebacterium dipthheriae, Campylobacter jejuni, Clamydia psittaci और Sulfolobus islandicus हैं। ग्लाइफोसेट के लिए संवेदनशीलता स्कोर की गणना Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences के रूप में की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र9: इस प्रोटोकॉल और काल्पनिक विकासवादी परिदृश्यों के परिणामों की व्याख्या की योजना। (A) एक माइक्रोबायोम में, संभावित संवेदनशीलता (हरे रंग में) और प्रतिरोध (लाल रंग में) बैक्टीरिया का अनुपात लगभग 50:50 है। काले डॉट्स अवर्गीकृत माइक्रोबियल प्रजातियों को दर्शाते हैं; इस प्रकार, ग्लाइफोसेट के प्रति उनकी संवेदनशीलता अज्ञात है। कुछ माइक्रोबायोम में, संवेदनशील बैक्टीरिया का अनुपात थोड़ा अधिक होता है, जैसा कि मानव आंत माइक्रोबायोम12 में होता है। (बी) समय के साथ, ग्लाइफोसेट के उपयोग से माइक्रोबियल डिस्बिओसिस (यानी, संवेदनशील और प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अनुपात में असंतुलन) हो सकता है जो विभिन्न काल्पनिक परिदृश्यों के लिए अग्रणी हो सकता है। (सी) काल्पनिक मामला 1 (कोई चयन नहीं): ग्लाइफोसेट का उपयोग माइक्रोबायोम को प्रभावित नहीं करता है; इस प्रकार, संवेदनशील और प्रतिरोधी बैक्टीरिया का अनुपात स्थिर रहता है। (डी) काल्पनिक मामला 2: ग्लाइफोसेट का उपयोग आबादी से ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशील बैक्टीरिया को हटा देता है। हम अनुमान लगाते हैं कि यह परिदृश्य खुराक-निर्भर हो सकता है। (ई) काल्पनिक मामला 3: ग्लाइफोसेट के उपयोग से चयन दबाव ईपीएसपीएस जीन में उत्परिवर्तन को बढ़ाता है जो बैक्टीरिया की संवेदनशीलता की स्थिति को बदलदेता है। इस प्रकार, पूरी माइक्रोबियल आबादी ग्लाइफोसेट के लिए प्रतिरोधी हो जाती है। इसके अलावा, इस परिदृश्य में, मल्टीड्रग-प्रतिरोधी बैक्टीरिया में वृद्धि हो सकती है। (एफ) काल्पनिक मामला 4: ग्लाइफोसेट का उपयोग कुछ जीवाणु प्रजातियों की संरचना को बदल देता है, जिससे प्रतिरोधी बैक्टीरिया के प्रति असंतुलन पैदा होता है, जबकि कुछ जीवाणु प्रजातियां अपरिवर्तित रहती हैं, संभवतः अतिरिक्त प्रतिरोधी तंत्र जैसे कि एफीलेक्स पंप या ईपीएसपीएस जीन13 के ओवरएक्सप्रेशन के कारण। यह परिदृश्य ग्लाइफोसेट-प्रतिरोधी बैक्टीरिया में वृद्धि के साथ-साथ अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं के लिए जीवाणु प्रतिरोध में वृद्धि का कारण भी बन सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: प्रजातियों के पेड़ भर में ग्लाइफोसेट के लिए अनुमानित संवेदनशीलता का वितरण। पाई चार्ट उन प्रजातियों के अनुपात को इंगित करते हैं जो ग्लाइफोसेट के लिए संवेदनशील (हरे) या प्रतिरोधी (लाल) हैं, और अवर्गीकृत (काले)। इस आंकड़े को Rainio et al.14 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11: उपयोगकर्ता के स्वयं के संदर्भ अनुक्रम का परीक्षण करने के लिए EPSPSClass वेबसर्वर के इनपुट और आउटपुट. (A) इनपुट 1: क्वेरी अनुक्रम. (बी) इनपुट 2: संदर्भ अनुक्रम। (सी) इनपुट 3: संदर्भ अनुक्रमों में अमीनो एसिड मार्कर। (डी) आउटपुट: पहचान: क्वेरी अनुक्रमों में अमीनो एसिड मार्करों का अंश (कक्षा I-IV और उपयोगकर्ता के अपने संदर्भ अनुक्रम)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: माइक्रोबायोम विश्लेषण में 16S rRNA जीन और ITS क्षेत्र के पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्राइमरों की सूची कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: एंजाइम के कोड 5-enolpyruvylshikimate-3-फॉस्फेट सिंथेज़ (EPSPS) विभिन्न डेटाबेस में कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: औसत ग्लाइफोसेट एकाग्रता कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 4: ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशील / प्रतिरोधी प्रजातियों के प्रतिशत की सारांश तालिका। इस तालिका को Rainio et al.14 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 5: संदर्भ अनुक्रमों में अमीनो एसिड मार्करों की स्थिति कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल EPSPS प्रोटीन के विश्लेषण के आधार पर माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव को मापने के तरीके पर सामान्य मार्गदर्शन प्रदान करता है। प्रोटोकॉल में तीन प्रमुख महत्वपूर्ण चरण हैं: (i) माइक्रोबायोम डेटा से ईपीएसपीएस प्रोटीन का परिमाणीकरण। यह चरण महत्वपूर्ण है क्योंकि EPSPS हर्बिसाइड का प्रत्यक्ष लक्ष्य एंजाइम है। इस प्रकार, जिन प्रजातियों में ईपीएसपीएस जीन की एक प्रति है, वे GBP के उपयोग से प्रभावित हो सकते हैं। फिर भी, यहां तक कि जिन प्रजातियों में ईपीएसपीएस जीन की एक प्रति की कमी होती है, उन्हें वैकल्पिक गैर-लक्ष्य तंत्र43,44 के माध्यम से हर्बिसाइड द्वारा प्रभावित किया जा सकता है। (ii) यदि ईपीएसपीएस जीन के विश्लेषण को अध्ययन के डिजाइन में शामिल नहीं किया गया है, तो 16 एस आरआरएनए (बैक्टीरिया) या आईटीएस (कवक) का विश्लेषण करके एक अच्छा अनुमान प्राप्त करना संभव है। इस मामले में, एक व्यापक संदर्भ तालिका पर भरोसा करना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, एटीजीसी डेटाबेस कई निकटता से संबंधित प्रजातियों से ईपीएसपीएस प्रोटीन के अनुक्रम प्रदान करता है)। (iii) ईपीएसपीएस प्रोटीन को ईपीएसपीएस के सक्रिय स्थल के कतिपय अमीनो एसिड अवशेषों के आधार पर ग्लाइफोसेट के लिए संभावित रूप से संवेदनशील या प्रतिरोधी में विभाजित किया जाता है। हालांकि, एक एकल अमीनो एसिड को प्रभावित करने वाले उत्परिवर्तन इस वर्गीकरण को बदल सकते हैं45 और कक्षाओं के बीच संक्रमण अपेक्षाकृत कम समय14 में हो सकता है।

ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता को संदर्भ जीनोम, अमीनो एसिड मार्करों और अनुक्रम संरेखण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। (i) संदर्भ जीनोम: ईपीएसपीएस एंजाइम को संभावित रूप से संवेदनशील (वर्ग I [अल्फा या बीटा]46,47) या प्रतिरोधी (कक्षा II48,49, III 50 और IV51) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है ताकि अमीनो एसिड मार्करों और रूपांकनों (कक्षा III के मामले में) की उपस्थिति के आधार पर ग्लाइफोसेट किया जा सके। ये अमीनो एसिड मार्कर और रूपांकनों Vibrio cholerae (vcEPSPS, वर्ग I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, वर्ग II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, वर्ग III), और Streptomyces davawensis (sdEPSPS, वर्ग IV) के EPSPS प्रोटीन में अमीनो एसिड अवशेषों के स्थान पर आधारित हैं। (ii) अमीनो एसिड मार्कर: ग्लाइफोसेट ईपीएसपीएस एंजाइम के साथ बातचीत करता है और फॉस्फोएनॉलपाइरूवेट (पीईपी, ईपीएसपीएस एंजाइम का दूसरा सब्सट्रेट) 52,53 के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। कुछ प्रजातियों में, EPSPS अनुक्रम में छोटे अमीनो एसिड परिवर्तन पीईपी के लिए एक उच्च आत्मीयता प्रदान करते हैं औरग्लाइफोसेट 12,14,52,54,55 के लिए प्रतिरोध प्रदान करते हैं। अन्य अनुक्रमों में, ग्लाइफोसेट ईपीएसपीएस अनुक्रम को एक गैर-निरोधात्मक संरचना 45 में बांधता है। यद्यपि ग्लाइफोसेट के लिए कई प्रतिरोधी 12,14,48,49,52,54,55 और सहिष्णु 56,57 EPSP अनुक्रमों का वर्णन किया गया है, EPSPS के लिए वर्तमान वर्गीकरण प्रणाली को चार प्रमुख वर्गों (I-IV) 12 (तालिका 5) में विभाजित किया गया है। ). (iii) अनुक्रम संरेखण: एक EPSPS एंजाइम को वर्गीकृत करने के लिए, हमने संदर्भ अनुक्रमों (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS और sdEPSPS) में से प्रत्येक के खिलाफ क्वेरी अनुक्रम के एकाधिक अनुक्रम संरेखण प्रोग्राम-डिफ़ॉल्ट पैरामीटर35-, के साथ युग्मवार संरेखण किया। क्वेरी अनुक्रम में अमीनो एसिड मार्करों की स्थिति की पहचान करने के लिए ये संरेखण आवश्यक हैं। नतीजतन, एक एंजाइम को अमीनो एसिड मार्करों और वर्ग III आधारित आकृति मार्करों की उपस्थिति के आधार पर12-वर्ग I, II और / या IV के रूप में वर्णित के रूप में वर्गीकृत किया जाता है।

प्रोटोकॉल ईपीएसपीएस के चार ज्ञात प्रकारों पर आधारित है: एक प्रकार संवेदनशील है, अन्य तीन प्रतिरोधी हैं)। हालांकि, प्रोकैरियोट्स में ईपीएसपीएस अनुक्रमों का लगभग 10% अभी तक अवर्गीकृत नहीं है (आर्किया में 16% और बैक्टीरिया में 8%) 12। इस प्रकार, आगे के शोध को ग्लाइफोसेट संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए उन अनुक्रमों का विश्लेषण करना चाहिए। EPSPSClass सर्वर नए आनुवंशिक मार्करों का परीक्षण करने के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। EPSPS के ज्ञात वर्गों की पहचान सीधी है, जैसा कि अनुभाग 4.4 में दिखाया गया है। और चित्रा 5। इसके अलावा, उन मामलों में जहां उपयोगकर्ता अपनी क्वेरी और संदर्भ प्रोटीन की तुलना करना चाहते हैं, सर्वर मैन्युअल रूप से एक संदर्भ अनुक्रम और अमीनो एसिड मार्करों का एक सेट (चित्रा 11) शामिल करने का विकल्प प्रदान करता है। इस विकल्प का उपयोग ईपीएसपीएस के उपन्यास वर्गों की पहचान करने के साथ-साथ अन्य जड़ी-बूटियों और लक्ष्य अनुक्रमों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

EPSPS वर्ग का विश्लेषण अनुक्रम विश्लेषण और अमीनो एसिड मार्करों की उपस्थिति / अनुपस्थिति द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह एक प्रारंभिक अनुमान है जिसका उपयोग क्षेत्र में परिकल्पना परीक्षण के लिए किया जा सकता है। एमिनो एसिड मार्करों को अनुभवजन्य और अवलोकन संबंधीअध्ययनों के आधार पर साहित्य में निर्धारित किया गया है 46,47,48,49,50,51। हालांकि, ईपीएसपीएस वर्ग को निर्धारित करने के लिए संदर्भ प्रोटीन अनुक्रमों का परीक्षण केवल सीमित संख्या में प्रजातियों में किया गया है और कभी-कभी ग्लाइफोसेट के प्रतिरोध की व्याख्या करने में विफल हो सकता है। प्रतिपूरक उत्परिवर्तन का प्रभाव, और ईपीएसपीएस-संबद्ध डोमेन (ज्यादातर कवक में) ग्लाइफोसेट58 के प्रति संवेदनशीलता को भी प्रभावित कर सकता है। इस पेपर का विश्लेषण चार ईपीएसपीएस कक्षाओं पर आधारित है। मानव आंत माइक्रोबायोम में बैक्टीरिया के एक सर्वेक्षण से पता चला है कि उनमें से लगभग 30% अवर्गीकृत थे (यानी, इन प्रजातियों के ईपीएसपीएस प्रोटीन किसी भी ज्ञात वर्गों से संबंधित नहीं हैं), और अन्य ईपीएसपीएस कक्षाओं की पहचान करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बैक्टीरिया और पौधों में ईपीएसपीएस प्रोटीन अनुक्रम यूनिडोमेन है, जबकि फंगल ईपीएसपीएस प्रोटीन में कई डोमेन59 होते हैं। इस प्रकार, कवक में एक प्रोटीन तह ग्लाइफोसेट के लिए ईपीएसपीएस एंजाइम की एक अलग प्रतिक्रिया का कारण बन सकता है। इसके अलावा, प्रतिरोध के अतिरिक्त गैर-लक्ष्य तंत्र (उदाहरण के लिए, एफीलैक्स पंप और ईपीएसपीएस जीन13 के ओवरएक्सप्रेशन) या ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशीलता (उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन श्रृंखला12 पर ग्लाइफोसेट का प्रभाव) पर विचार नहीं किया जाता है।

हालांकि जीबीपी 1974 के बाद से एक हर्बीसाइड के रूप में रहे हैं और 1991 के बाद से व्यापक रूप से उपयोग किए गए हैं, यह ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए पहली जैव सूचना विज्ञान विधि है। विधि लक्ष्य अनुक्रम में ज्ञात अमीनो एसिड अवशेषों की पहचान पर आधारित है। इस प्रकार, हमारी विधि प्रजातियों पर ग्लाइफोसेट के संभावित प्रभाव का एक आधारभूत अनुमान प्रदान करती है। निकट भविष्य में, उपन्यास जैव सूचना विज्ञान विधियों में ईपीएसपीएस प्रोटीन के अतिरिक्त वर्गों को शामिल किया जाना चाहिए ताकि अवर्गीकृत अनुक्रमों के ग्लाइफोसेट के लिए संभावित संवेदनशीलता निर्धारित की जा सके 12,54,55। इसके अलावा, यह देखते हुए कि EPSPS एंजाइम का सटीक व्यवहार एकल अमीनो एसिड परिवर्तन12,14,52,54,55 द्वारा भिन्न हो सकता है, आगे सिलिको प्रयोगों में EPSPS प्रोटीन की तह में छोटी भिन्नताओं को ध्यान में रखना चाहिए, साथ ही साथ कवक58 में प्रोटीन संरचना पर EPSPS से जुड़े डोमेन के प्रभाव को भी ध्यान में रखना चाहिए। . इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि ग्लाइफोसेट के लिए सहिष्णुता ईपीएसपीएस प्रोटीन56,57 के ओवरएक्सप्रेशन द्वारा उत्पादित की जा सकती है; इस प्रकार कोडोन उपयोग60 के सुधार के आधार पर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण का उपयोग उपन्यास ईपीएसपीएस अनुक्रमों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो जीन अभिव्यक्ति को अधिकतम या कम करते हैं।

किसानों, राजनेताओं और निर्णय निर्माताओं को कीटनाशकों के भारी उपयोग से जुड़े जोखिमों की पूरी तरह से समझ की तत्काल आवश्यकता है। इस प्रकार, दोनों जैव सूचना विज्ञान उपकरण कीटनाशकों के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता का खुलासा करते हैं और विभिन्न वातावरणों में किए गए अच्छी तरह से दोहराए गए, यादृच्छिक और क्षेत्र-यथार्थवादी प्रयोगात्मक अध्ययन आवश्यक हैं। ग्लाइफोसेट के प्रति जीवों की संवेदनशीलता की जांच करने के लिए डिज़ाइन की गई प्रस्तुत जैव सूचना विज्ञान विधि को अन्य कीटनाशकों के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसी तरह, प्रयोगात्मक पारिस्थितिकी के तरीकों को किसी भी संबंधित पारिस्थितिक प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। साथ में, विधियों का उपयोग क्षेत्र टिप्पणियों, जीनोमिक डेटा और कीटनाशक उपयोग के बीच हताहतों को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है। सभी प्रस्तुत विधियां जोखिम मूल्यांकन में अमूल्य हैं। जैव सूचना विज्ञान विधियों का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कृषि रसायनों के लिए माइक्रोबियल अनुकूलन की निगरानी में और संभावित अन्य संबंधित जोखिमों का परीक्षण करने के लिए एक मात्रात्मक विधि प्रदान करने के लिए, जैसे कि एग्रोकेमिकल्स के लिए रोगजनकों के प्रतिरोध में वृद्धि, एकीकृत कीट प्रबंधन (आईपीएम) में जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में उपयोग किए जाने वाले रोगाणुओं पर नकारात्मक प्रभाव, और बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध।

Disclosures

हितों के संघर्ष: कोई नहीं।

Acknowledgments

इस काम को फिनलैंड की अकादमी द्वारा वित्त पोषित किया गया था (मार्जो हेलैंडर को अनुदान संख्या 311077)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939B To check the concentration and quality of PCR products
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192 For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit Promega M7848 PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit INVITEK Molecular 1037100300 Genomic DNA extraction from plant tissues
Ion Chip Minifuge ThermoFisher Scientific 4479672 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM System ThermoFisher Scientific 4462921 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server ThermoFisher Scientific 4483643 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep SageScience PIP0001 For size fractionation of PCR amplicons
Pressure tank Berthoud 102140 For sprayin glyphosate based products in field
Primers Sigma Aldrich Custom-made For PCR amplification
Rotary tiller Grillo 984511 For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler BIO-RAD 1852196 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422 (2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway--a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556 (2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653 (2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349 (2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , John Wiley & Sons. New York. 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360 (2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. JoVE Supplementary Material. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021).
  24. Alignments Conserved Positions. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021).
  25. Protein Families. , Available from: http://pfam.xfam.org (2021).
  26. NCBI GenBank. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021).
  27. COG Database. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021).
  28. Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org (2021).
  29. EPSPSClass. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021).
  30. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  31. ATG_NCBI. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/kristensen/ATGC/atgc_home.html (2021).
  32. COG2020. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/COG/COG2020/data (2021).
  33. CSC - IT CENTER FOR SCIENCE LTD. , Available from: https://www.csc.fi (2021).
  34. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  36. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  37. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  38. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  39. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 261-269 (2015).
  40. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  41. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  42. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  43. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  44. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  45. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  46. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  47. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  48. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , US5627061A (1997).
  49. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  50. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , REP. WO2006US13161 (2006).
  51. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , US20130217577A1 (2013).
  52. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  53. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  54. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  55. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  56. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  57. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133 (2019).
  58. Tall, T. A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  59. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6 (2020).
  60. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, Web server issue 126-131 (2007).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 179
माइक्रोबायोम पर ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पादों के संभावित प्रभाव का परिमाणीकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, … More

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Helander, M., Puigbò, P. Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes. J. Vis. Exp. (179), e63109, doi:10.3791/63109 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter