ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पाद (जीबीपी) दुनिया भर में सबसे आम व्यापक स्पेक्ट्रम जड़ी-बूटियों हैं। इस लेख में, हम माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव को मापने के लिए सामान्य दिशानिर्देश पेश करते हैं, क्षेत्र प्रयोगों से लेकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तक।
ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पाद (जीबीपी) दुनिया भर में सबसे आम व्यापक स्पेक्ट्रम जड़ी-बूटियों हैं। ग्लाइफोसेट का लक्ष्य एंजाइम 5-एनोल्पाइरुविलशिकिमेट-3-फॉस्फेट सिंथेज़ (ईपीएसपीएस) है, जो शिकिमेट मार्ग में है, जो पौधों में लगभग सार्वभौमिक है। एंजाइम का निषेध तीन आवश्यक अमीनो एसिड के उत्पादन को रोकता है: फेनिलएलनिन, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन। ईपीएसपीएस कवक और प्रोकैरियोट्स में भी मौजूद है, जैसे कि आर्किया और बैक्टीरिया; इस प्रकार, GBP के उपयोग का मिट्टी, पौधों, शाकाहारी और माध्यमिक उपभोक्ताओं की माइक्रोबायोम संरचना पर प्रभाव पड़ सकता है। इस लेख का उद्देश्य क्षेत्र प्रयोगों से लेकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तक माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव का आकलन करने और कुछ परीक्षण योग्य परिकल्पनाएं प्रदान करने के लिए सामान्य दिशानिर्देश प्रस्तुत करना है। गैर-लक्ष्य जीवों पर GBP का परीक्षण करने के लिए दो क्षेत्र प्रयोग प्रस्तुत किए जाते हैं। सबसे पहले, 10 दोहराए गए नियंत्रण और जीबीपी उपचार भूखंडों से पौधे से जुड़े रोगाणुओं को नो-टिल क्रॉपिंग का अनुकरण करने के लिए नमूना और विश्लेषण किया जाता है। दूसरे प्रयोग में, ग्लाइफोसेट अवशेषों या गैर-उपचारित नियंत्रण खाद युक्त पोल्ट्री खाद द्वारा निषेचित प्रयोगात्मक भूखंडों से नमूने प्राप्त किए गए थे। EPSPS प्रोटीन अनुक्रमों के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण का उपयोग ग्लाइफोसेट के लिए रोगाणुओं की संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव का अनुमान लगाने में पहला कदम लक्ष्य एंजाइम (EPSPS) के लिए उनकी संभावित संवेदनशीलता निर्धारित करना है। माइक्रोबियल अनुक्रमों को या तो सार्वजनिक भंडारों से या पीसीआर प्रवर्धन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, अधिकांश क्षेत्र अध्ययनों में, माइक्रोबायोम संरचना को सार्वभौमिक डीएनए मार्करों जैसे कि 16 एस आरआरएनए और आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) के आधार पर निर्धारित किया गया है। इन मामलों में, ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशीलता का अनुमान केवल निकटसे संबंधित प्रजातियों का उपयोग करके ईपीएसपीएस अनुक्रमों के संभावित विश्लेषण के माध्यम से लगाया जा सकता है। EPSPS एंजाइम के आधार पर ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता का परिमाणीकरण, लक्ष्य और गैर-लक्ष्य प्रतिरोधी तंत्र का अध्ययन करने के लिए आगे के प्रयोगों के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है।
आधुनिक कृषि में कीटनाशकों का भारी उपयोग स्पष्ट रूपसे जैव विविधता की गिरावट में एक प्रमुख योगदानकर्ता है। यह पेपर ग्लाइफोसेट पर केंद्रित है क्योंकि ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पाद (जीबीपी) अपनी दक्षता और सस्ती कीमत 2,3 के कारण वैश्विक स्तर पर सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले कीटनाशक बन गए हैं। कृषि क्षेत्रों में खरपतवारों को मारने के अलावा, जीबीपी आमतौर पर सिल्विकल्चर, शहरी वातावरण और घर के बगीचों में उपयोग किए जाते हैं; इसके अतिरिक्त, उन्हें गैर-लक्षित जीवों के लिए नॉनटॉक्सिक के रूप में घोषित किया गया है यदि निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग किया जाता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चला है कि ग्लाइफोसेट के अवशेषों और इसके क्षरण उत्पादों को मिट्टी में बनाए रखा और ले जाया जा सकता है, जिससे गैर-लक्षित जीवों पर कैस्केडिंग प्रभाव पड़ताहै 4,5,6,7,8। ग्लाइफोसेट के प्रभाव केवल पौधों तक ही सीमित नहीं हैं- शिकिमेट मार्ग कई कवक और प्रोकैरियोट्स में भी मौजूद है। ग्लाइफोसेट एंजाइम 5-एनोलपाइरुविलशिकिमेट-3-फॉस्फेट सिंथेज़ (ईपीएसपीएस) को शिकिमेट मार्ग में लक्षित करता है, जिसे एआरओए9 के रूप में भी जाना जाता है। यह एंजाइम तीन आवश्यक सुगंधित अमीनो एसिड (फेनिलएलनिन, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन) के संश्लेषण में शिकिमेट मार्ग के केंद्र में है, और यह अधिकांश प्रोकैरियोट्स, पौधों और कवक10,11 में मौजूद है। कुछ माइक्रोबियल प्रजातियों ने ईपीएसपीएस अनुक्रमों में उत्परिवर्तन सहित कई तंत्रों के माध्यम से ग्लाइफोसेट के लिए आंशिक या पूर्ण प्रतिरोध विकसित किया है। इस प्रकार, यह सुझाव दिया गया है कि जीबीपी के उपयोग का पौधे और पशु माइक्रोबायोम पर सीधा प्रभाव पड़ सकता है, जिसमें मानव आंत माइक्रोबायोम 12,13,14 शामिल हैं। फिर भी, GBP के उपयोग का लगभग किसी भी पारिस्थितिकी तंत्र समारोह और सेवा पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है जो रोगाणुओं और माइक्रोब-सुविधाजनक प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है। परिणामस्वरूप खतरे जैव रासायनिक मिट्टी प्रक्रियाओं, परागण जीव विज्ञान, और पशु और मानव कल्याण की चिंता कर सकते हैं। यह एक और अधिक व्यापक समझ के लिए कहता है कि ग्लाइफोसेट ग्लाइफोसेट ग्लाइफोसेट के लिए रोगाणुओं की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए शिकिमेट मार्गों और तरीकों को कैसे प्रभावित करता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम माइक्रोबायोम पर ग्लाइफोसेट और जीबीपी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक पाइपलाइन पेश करते हैं, क्षेत्र प्रयोगों से लेकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तक। हम हाल ही में प्रकाशित जैव सूचना विज्ञान विधि का विस्तार से वर्णन करते हैं जिसका उपयोग ग्लाइफोसेट12 के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। शोधकर्ताओं के ज्ञान के लिए, यह पहला और अब तक का है, जीबीपी के सक्रिय घटक के लिए एंजाइम ईपीएसपीएस की आंतरिक संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एकमात्र जैव सूचना विज्ञान उपकरण है। यह जैव सूचना विज्ञान विधि ग्लाइफोसेट लक्ष्य एंजाइम (EPSPS)12 में ज्ञात अमीनो एसिड मार्करों का पता लगाने पर आधारित है। पाइपलाइन को पांच मुख्य कामकाजी चरणों (चित्रा 1) में विभाजित किया गया है: 1) जीबीपी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए दो क्षेत्र प्रयोगों का एक संक्षिप्त परिचय, 2) माइक्रोबायोम विश्लेषण (16 एस आरआरएनए, आईटीएस, और ईपीएसपीएस जीन) का एक संक्षिप्त सारांश, 3) सार्वजनिक भंडारों से ईपीएसपीएस अनुक्रमों को इकट्ठा करना, 4) ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता का निर्धारण करना, और 5) सार्वभौमिक माइक्रोबियल मार्करों (16 एस आरआरएनए और आईटीएस) से ईपीएसपीएस वर्ग का आकलन करना।
यह प्रोटोकॉल EPSPS प्रोटीन के विश्लेषण के आधार पर माइक्रोबायोम पर GBP के प्रभाव को मापने के तरीके पर सामान्य मार्गदर्शन प्रदान करता है। प्रोटोकॉल में तीन प्रमुख महत्वपूर्ण चरण हैं: (i) माइक्रोबायोम डेटा से ईपीएसपीएस प्रोटीन का परिमाणीकरण। यह चरण महत्वपूर्ण है क्योंकि EPSPS हर्बिसाइड का प्रत्यक्ष लक्ष्य एंजाइम है। इस प्रकार, जिन प्रजातियों में ईपीएसपीएस जीन की एक प्रति है, वे GBP के उपयोग से प्रभावित हो सकते हैं। फिर भी, यहां तक कि जिन प्रजातियों में ईपीएसपीएस जीन की एक प्रति की कमी होती है, उन्हें वैकल्पिक गैर-लक्ष्य तंत्र43,44 के माध्यम से हर्बिसाइड द्वारा प्रभावित किया जा सकता है। (ii) यदि ईपीएसपीएस जीन के विश्लेषण को अध्ययन के डिजाइन में शामिल नहीं किया गया है, तो 16 एस आरआरएनए (बैक्टीरिया) या आईटीएस (कवक) का विश्लेषण करके एक अच्छा अनुमान प्राप्त करना संभव है। इस मामले में, एक व्यापक संदर्भ तालिका पर भरोसा करना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, एटीजीसी डेटाबेस कई निकटता से संबंधित प्रजातियों से ईपीएसपीएस प्रोटीन के अनुक्रम प्रदान करता है)। (iii) ईपीएसपीएस प्रोटीन को ईपीएसपीएस के सक्रिय स्थल के कतिपय अमीनो एसिड अवशेषों के आधार पर ग्लाइफोसेट के लिए संभावित रूप से संवेदनशील या प्रतिरोधी में विभाजित किया जाता है। हालांकि, एक एकल अमीनो एसिड को प्रभावित करने वाले उत्परिवर्तन इस वर्गीकरण को बदल सकते हैं45 और कक्षाओं के बीच संक्रमण अपेक्षाकृत कम समय14 में हो सकता है।
ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता को संदर्भ जीनोम, अमीनो एसिड मार्करों और अनुक्रम संरेखण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। (i) संदर्भ जीनोम: ईपीएसपीएस एंजाइम को संभावित रूप से संवेदनशील (वर्ग I [अल्फा या बीटा]46,47) या प्रतिरोधी (कक्षा II48,49, III 50 और IV51) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है ताकि अमीनो एसिड मार्करों और रूपांकनों (कक्षा III के मामले में) की उपस्थिति के आधार पर ग्लाइफोसेट किया जा सके। ये अमीनो एसिड मार्कर और रूपांकनों Vibrio cholerae (vcEPSPS, वर्ग I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, वर्ग II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, वर्ग III), और Streptomyces davawensis (sdEPSPS, वर्ग IV) के EPSPS प्रोटीन में अमीनो एसिड अवशेषों के स्थान पर आधारित हैं। (ii) अमीनो एसिड मार्कर: ग्लाइफोसेट ईपीएसपीएस एंजाइम के साथ बातचीत करता है और फॉस्फोएनॉलपाइरूवेट (पीईपी, ईपीएसपीएस एंजाइम का दूसरा सब्सट्रेट) 52,53 के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। कुछ प्रजातियों में, EPSPS अनुक्रम में छोटे अमीनो एसिड परिवर्तन पीईपी के लिए एक उच्च आत्मीयता प्रदान करते हैं औरग्लाइफोसेट 12,14,52,54,55 के लिए प्रतिरोध प्रदान करते हैं। अन्य अनुक्रमों में, ग्लाइफोसेट ईपीएसपीएस अनुक्रम को एक गैर-निरोधात्मक संरचना 45 में बांधता है। यद्यपि ग्लाइफोसेट के लिए कई प्रतिरोधी 12,14,48,49,52,54,55 और सहिष्णु 56,57 EPSP अनुक्रमों का वर्णन किया गया है, EPSPS के लिए वर्तमान वर्गीकरण प्रणाली को चार प्रमुख वर्गों (I-IV) 12 (तालिका 5) में विभाजित किया गया है। ). (iii) अनुक्रम संरेखण: एक EPSPS एंजाइम को वर्गीकृत करने के लिए, हमने संदर्भ अनुक्रमों (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS और sdEPSPS) में से प्रत्येक के खिलाफ क्वेरी अनुक्रम के एकाधिक अनुक्रम संरेखण प्रोग्राम-डिफ़ॉल्ट पैरामीटर35-, के साथ युग्मवार संरेखण किया। क्वेरी अनुक्रम में अमीनो एसिड मार्करों की स्थिति की पहचान करने के लिए ये संरेखण आवश्यक हैं। नतीजतन, एक एंजाइम को अमीनो एसिड मार्करों और वर्ग III आधारित आकृति मार्करों की उपस्थिति के आधार पर12-वर्ग I, II और / या IV के रूप में वर्णित के रूप में वर्गीकृत किया जाता है।
प्रोटोकॉल ईपीएसपीएस के चार ज्ञात प्रकारों पर आधारित है: एक प्रकार संवेदनशील है, अन्य तीन प्रतिरोधी हैं)। हालांकि, प्रोकैरियोट्स में ईपीएसपीएस अनुक्रमों का लगभग 10% अभी तक अवर्गीकृत नहीं है (आर्किया में 16% और बैक्टीरिया में 8%) 12। इस प्रकार, आगे के शोध को ग्लाइफोसेट संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए उन अनुक्रमों का विश्लेषण करना चाहिए। EPSPSClass सर्वर नए आनुवंशिक मार्करों का परीक्षण करने के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। EPSPS के ज्ञात वर्गों की पहचान सीधी है, जैसा कि अनुभाग 4.4 में दिखाया गया है। और चित्रा 5। इसके अलावा, उन मामलों में जहां उपयोगकर्ता अपनी क्वेरी और संदर्भ प्रोटीन की तुलना करना चाहते हैं, सर्वर मैन्युअल रूप से एक संदर्भ अनुक्रम और अमीनो एसिड मार्करों का एक सेट (चित्रा 11) शामिल करने का विकल्प प्रदान करता है। इस विकल्प का उपयोग ईपीएसपीएस के उपन्यास वर्गों की पहचान करने के साथ-साथ अन्य जड़ी-बूटियों और लक्ष्य अनुक्रमों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
EPSPS वर्ग का विश्लेषण अनुक्रम विश्लेषण और अमीनो एसिड मार्करों की उपस्थिति / अनुपस्थिति द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह एक प्रारंभिक अनुमान है जिसका उपयोग क्षेत्र में परिकल्पना परीक्षण के लिए किया जा सकता है। एमिनो एसिड मार्करों को अनुभवजन्य और अवलोकन संबंधीअध्ययनों के आधार पर साहित्य में निर्धारित किया गया है 46,47,48,49,50,51। हालांकि, ईपीएसपीएस वर्ग को निर्धारित करने के लिए संदर्भ प्रोटीन अनुक्रमों का परीक्षण केवल सीमित संख्या में प्रजातियों में किया गया है और कभी-कभी ग्लाइफोसेट के प्रतिरोध की व्याख्या करने में विफल हो सकता है। प्रतिपूरक उत्परिवर्तन का प्रभाव, और ईपीएसपीएस-संबद्ध डोमेन (ज्यादातर कवक में) ग्लाइफोसेट58 के प्रति संवेदनशीलता को भी प्रभावित कर सकता है। इस पेपर का विश्लेषण चार ईपीएसपीएस कक्षाओं पर आधारित है। मानव आंत माइक्रोबायोम में बैक्टीरिया के एक सर्वेक्षण से पता चला है कि उनमें से लगभग 30% अवर्गीकृत थे (यानी, इन प्रजातियों के ईपीएसपीएस प्रोटीन किसी भी ज्ञात वर्गों से संबंधित नहीं हैं), और अन्य ईपीएसपीएस कक्षाओं की पहचान करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बैक्टीरिया और पौधों में ईपीएसपीएस प्रोटीन अनुक्रम यूनिडोमेन है, जबकि फंगल ईपीएसपीएस प्रोटीन में कई डोमेन59 होते हैं। इस प्रकार, कवक में एक प्रोटीन तह ग्लाइफोसेट के लिए ईपीएसपीएस एंजाइम की एक अलग प्रतिक्रिया का कारण बन सकता है। इसके अलावा, प्रतिरोध के अतिरिक्त गैर-लक्ष्य तंत्र (उदाहरण के लिए, एफीलैक्स पंप और ईपीएसपीएस जीन13 के ओवरएक्सप्रेशन) या ग्लाइफोसेट के प्रति संवेदनशीलता (उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन श्रृंखला12 पर ग्लाइफोसेट का प्रभाव) पर विचार नहीं किया जाता है।
हालांकि जीबीपी 1974 के बाद से एक हर्बीसाइड के रूप में रहे हैं और 1991 के बाद से व्यापक रूप से उपयोग किए गए हैं, यह ग्लाइफोसेट के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए पहली जैव सूचना विज्ञान विधि है। विधि लक्ष्य अनुक्रम में ज्ञात अमीनो एसिड अवशेषों की पहचान पर आधारित है। इस प्रकार, हमारी विधि प्रजातियों पर ग्लाइफोसेट के संभावित प्रभाव का एक आधारभूत अनुमान प्रदान करती है। निकट भविष्य में, उपन्यास जैव सूचना विज्ञान विधियों में ईपीएसपीएस प्रोटीन के अतिरिक्त वर्गों को शामिल किया जाना चाहिए ताकि अवर्गीकृत अनुक्रमों के ग्लाइफोसेट के लिए संभावित संवेदनशीलता निर्धारित की जा सके 12,54,55। इसके अलावा, यह देखते हुए कि EPSPS एंजाइम का सटीक व्यवहार एकल अमीनो एसिड परिवर्तन12,14,52,54,55 द्वारा भिन्न हो सकता है, आगे सिलिको प्रयोगों में EPSPS प्रोटीन की तह में छोटी भिन्नताओं को ध्यान में रखना चाहिए, साथ ही साथ कवक58 में प्रोटीन संरचना पर EPSPS से जुड़े डोमेन के प्रभाव को भी ध्यान में रखना चाहिए। . इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि ग्लाइफोसेट के लिए सहिष्णुता ईपीएसपीएस प्रोटीन56,57 के ओवरएक्सप्रेशन द्वारा उत्पादित की जा सकती है; इस प्रकार कोडोन उपयोग60 के सुधार के आधार पर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण का उपयोग उपन्यास ईपीएसपीएस अनुक्रमों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो जीन अभिव्यक्ति को अधिकतम या कम करते हैं।
किसानों, राजनेताओं और निर्णय निर्माताओं को कीटनाशकों के भारी उपयोग से जुड़े जोखिमों की पूरी तरह से समझ की तत्काल आवश्यकता है। इस प्रकार, दोनों जैव सूचना विज्ञान उपकरण कीटनाशकों के लिए जीवों की संभावित संवेदनशीलता का खुलासा करते हैं और विभिन्न वातावरणों में किए गए अच्छी तरह से दोहराए गए, यादृच्छिक और क्षेत्र-यथार्थवादी प्रयोगात्मक अध्ययन आवश्यक हैं। ग्लाइफोसेट के प्रति जीवों की संवेदनशीलता की जांच करने के लिए डिज़ाइन की गई प्रस्तुत जैव सूचना विज्ञान विधि को अन्य कीटनाशकों के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसी तरह, प्रयोगात्मक पारिस्थितिकी के तरीकों को किसी भी संबंधित पारिस्थितिक प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। साथ में, विधियों का उपयोग क्षेत्र टिप्पणियों, जीनोमिक डेटा और कीटनाशक उपयोग के बीच हताहतों को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है। सभी प्रस्तुत विधियां जोखिम मूल्यांकन में अमूल्य हैं। जैव सूचना विज्ञान विधियों का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कृषि रसायनों के लिए माइक्रोबियल अनुकूलन की निगरानी में और संभावित अन्य संबंधित जोखिमों का परीक्षण करने के लिए एक मात्रात्मक विधि प्रदान करने के लिए, जैसे कि एग्रोकेमिकल्स के लिए रोगजनकों के प्रतिरोध में वृद्धि, एकीकृत कीट प्रबंधन (आईपीएम) में जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में उपयोग किए जाने वाले रोगाणुओं पर नकारात्मक प्रभाव, और बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को फिनलैंड की अकादमी द्वारा वित्त पोषित किया गया था (मार्जो हेलैंडर को अनुदान संख्या 311077)।
2100 Bioanalyzer Instrument | INVITEK Molecular | 1037100300 | Genomic DNA extraction from plant tissues |
dNTP mix (10 mM each) | BIO-RAD | 1852196 | For PCR reactions |
GoTaq G2 DNA Polymerase kit | Promega | M7848 | PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification |
Invisorb Spin Plant Mini Kit | Agilent | G2939B | To check the concentration and quality of PCR products |
Ion Chip Minifuge | sage science | PIP0001 | For size fractionation of PCR amplicons |
Ion PGM System | ThermoFisher Scientific | 4462921 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Ion PGM Torrent Server | ThermoFisher Scientific | 4483643 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pippinprep | ThermoFisher Scientific | 4479672 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pressure tank | Berthoud | 102140 | For sprayin glyphosate based products in field |
Primers | ThermoFisher Scientific | R0192 | For PCR amplification |
Rotary tiller | Grillo | 984511 | For tilling the soil in experimental plots |
S1000 ThermalCycler | Sigma-Aldrich | Custom-made | For PCR amplification |