Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kvantifisering av den potensielle effekten av glyfosatbaserte produkter på mikrobiomer

Published: January 10, 2022 doi: 10.3791/63109
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2,3,4
1Biodiversity Unit, University of Turku, 2Department of Biology, University of Turku, 3Nutrition and Health Unit, Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology, Rovira i Virgili University

Summary

Glyfosatbaserte produkter (GBP) er de vanligste bredspektrede ugressmidlene over hele verden. I denne artikkelen innfører vi generelle retningslinjer for å kvantifisere effekten av GBP på mikrobiomer, fra felteksperimenter til bioinformatikkanalyser.

Abstract

Glyfosatbaserte produkter (GBP) er de vanligste bredspektrede ugressmidlene over hele verden. Målet for glyfosat er enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfatsyntase (EPSPS) i shikimatebanen, som er praktisk talt universell i planter. Hemmingen av enzymet stopper produksjonen av tre essensielle aminosyrer: fenylalanin, tyrosin og tryptofan. EPSPS er også til stede i sopp og prokaryoter, som arkaea og bakterier; Dermed kan bruken av GBP ha innvirkning på mikrobiomsammensetningen av jord, planter, plantelevende dyr og sekundære forbrukere. Denne artikkelen tar sikte på å presentere generelle retningslinjer for å vurdere effekten av GBP på mikrobiomer fra felteksperimenter til bioinformatikkanalyser og gi noen testbare hypoteser. To felteksperimenter presenteres for å teste GBP på ikke-målorganismer. For det første prøves og analyseres planterelaterte mikrober fra 10 replikerte kontroll- og GBP-behandlingsplott som simulerer no-till beskjæring. I det andre eksperimentet ble det oppnådd prøver fra eksperimentelle tomter befruktet av enten fjærfegjødsel som inneholder glyfosatrester eller ikke-behandlet kontrollgjødsel. Bioinformatikkanalyse av EPSPS proteinsekvenser brukes til å bestemme mikrobers potensielle følsomhet for glyfosat. Det første trinnet i å estimere effekten av GBP på mikrobiomer er å bestemme deres potensielle følsomhet for målenzymet (EPSPS). Mikrobielle sekvenser kan fås enten fra offentlige depoter eller ved hjelp av PCR-forsterkning. I de fleste feltstudier er imidlertid mikrobiomesammensetningen bestemt basert på universelle DNA-markører som 16S rRNA og den interne transkriberte avstandsstykken (ITS). I disse tilfellene kan følsomhet for glyfosat bare estimeres gjennom en probabilistisk analyse av EPSPS-sekvenser ved hjelp av nært beslektede arter. Kvantifiseringen av organismenes potensielle følsomhet for glyfosat, basert på EPSPS-enzymet, gir en robust tilnærming for videre eksperimenter for å studere mål- og ikke-målbestandige mekanismer.

Introduction

Den tunge bruken av plantevernmidler i moderne landbruk er helt klart en stor bidragsyter til nedgangen i biologisk mangfold1. Dette papiret fokuserer på glyfosat fordi glyfosatbaserte produkter (GBPer) har blitt de mest brukte plantevernmidlene globalt på grunn av deres effektivitet og rimelige pris 2,3. I tillegg til å drepe ugress i jordbruksmarker, brukes GBP-er ofte i silvikultur, urbane miljøer og hager; I tillegg har de blitt proklamert som ikke-giftige for ikke-målrettede organismer hvis de brukes i samsvar med produsentens instruksjoner. Imidlertid har et økende antall nyere studier avslørt at rester av glyfosat og dets nedbrytningsprodukter kan beholdes og transporteres i jord, og dermed ha kaskadeeffekter på ikke-målorganismer 4,5,6,7,8 . Effekten av glyfosat er ikke bare begrenset til planter - shikimate-banen er også til stede i mange sopp og prokaryoter. Glyfosat retter seg mot enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfatsyntase (EPSPS) i shikimate-banen, også kjent som aroA9. Dette enzymet er i sentrum av shikimate-banen i syntesen av de tre essensielle aromatiske aminosyrene (fenylalanin, tyrosin og tryptofan), og det er til stede i de fleste prokaryoter, planter og sopp10,11. Noen mikrobielle arter har utviklet delvis eller absolutt motstand mot glyfosat ved hjelp av flere mekanismer, inkludert mutasjoner i EPSPS-sekvensene. Dermed har det blitt antydet at bruk av GBPs kan ha en direkte effekt på plante- og dyremikrobiomer, inkludert det menneskelige tarmmikrobiomet 12,13,14. Likevel kan bruk av GBP ha en negativ innvirkning på praktisk talt alle økosystemfunksjoner og tjenester som er avhengige av mikrober og mikrobe-tilrettelagte prosesser. De påfølgende truslene kan gjelde biokjemiske jordprosesser, pollineringsbiologi og dyre- og menneskelig velvære. Dette krever en mer omfattende forståelse av hvordan glyfosat påvirker shikimate veier og metoder for å vurdere mikrobers følsomhet for glyfosat.

I denne protokollen presenterer vi en rørledning for å teste effekten av glyfosat og GBP på mikrobiomet, fra felteksperimenter til bioinformatikkanalyser. Vi beskriver i detalj en nylig publisert bioinformatikkmetode som kan brukes til å bestemme organismenes potensielle følsomhet for glyfosat12. Så vidt forskerne vet, er dette det første og hittil eneste bioinformatikkverktøyet som vurderer den iboende følsomheten til enzymet EPSPS til den aktive komponenten av GBP-er. Denne bioinformatikkmetoden er basert på påvisning av kjente aminosyremarkører i glyfosatmålenzymet (EPSPS)12. Rørledningen er delt inn i fem hovedarbeidsfaser (figur 1): 1) en kort innføring i to feltforsøk for å teste effekten av GBP-er, 2) en kort oppsummering av mikrobiomeanalyser (16S rRNA, ITS og EPSPS gen), 3) innsamling av EPSPS-sekvenser fra offentlige depoter, 4) som bestemmer organismenes potensielle følsomhet for glyfosat, og 5) vurdering av EPSPS-klassen fra universelle mikrobielle markører (16S rRNA og ITS).

Protocol

1. To felteksperimenter for å teste effekten av GBP-er

MERK: Denne protokollen presenterer to eksempler på felteksperimentelle design for å teste effekten av GBPer på planterelaterte mikrober. Begge eksperimentene ble utført i set-side felt uten tidligere historie med herbicid eller landbruksbruk ved Universitetet i Turku Ruissalo Botaniske Hage i Finland (60º26'N, 22º10'E). Jorden er sandleire med en høy andel organisk materiale.

  1. Eksperiment 1
    MERK: Dette eksperimentet ble designet for å simulere den generelle landbrukspraksisen til no-till landbruk med GBP-applikasjoner før og etter vekstsesongen for å bekjempe ugress.
    1. Del det eksperimentelle feltet i 10 replikerte kontroll- og GBP-behandlingsplott (23 m x 1,5 m) med bufferstrimler av vegetasjon mellom tomtene ( i denne studien våren 201415) (figur 2).
    2. Pass på at tomtene er tilledet med en roterende styrekult til en dybde på 5 cm og behandlet to ganger i året. Her ble tomtene behandlet i begynnelsen (mai) og slutten (oktober) av vekstsesongen.
    3. Behandle kontrollplottene med vann fra springen (5 L/plott) og GBP-tomtene med kommersiell GBP (glyfosatkonsentrasjon 450 g· L-1, søknadshastighet 6,4 L·ha-1 i 5 L vann fra springen per tomt) for å etterligne maksimal tillatt glyfosatdose i landbrukspraksis (3 kg·ha-1).
    4. Påfør behandlingene med en håndoperert trykktank som har en manuell sprøyter. To uker etter GBP-søknaden, så havre (Avena sativa), faba bønner (Vicia faba), rogn voldtekter (Brassica rapa subsp. oleifera), og plante poteter (Solanum tuberosum) i tomtene i henhold til landbrukspraksis.
    5. I vekstsesongen, hånd-luke tomtene for å holde plantekonkurransen og jordstrukturen så lik som mulig i kontroll og GBP-behandlede tomter.
    6. Prøv mikrobiota fra eksperimentelle planter. I denne studien ble mikrobiota prøvet fortløpende fra 2017 til 2020 i både GBP-behandlede og kontrollbehandlingsplott en gang per vekstsesong i løpet av studien.
    7. Samle ti replikeringer av planteprøvene (rot og blad) fra feltet, legg dem umiddelbart på is, og ta dem med til laboratoriet for videre behandling, som beskrevet i avsnitt 2.1.
  2. Eksperiment 2
    MERK: Dette eksperimentet ble designet for å teste risikoer forbundet med den sirkulære matøkonomien; Nærmere bestemt ble den designet for å undersøke konsekvensene av GBP-rester i gjødsel påført som gjødsel til avlingsplanter2 (figur 3).
    1. Samle sengetøy, inkludert trespon, avføring og noe sølt fôr, fra vaktler matet på GBP-forurenset eller kontrollfôr i et 12-måneders aviary eksperiment16,17.
      MERK: Den GBP-forurensede fôret besto av organisk fôr til legging av kyllinger kombinert med tilsvarende 160 mg glyfosat/kg, som tilsvarer et daglig inntak på 12-20 mg glyfosat per kilo kroppsmasse hos voksne japanske vaktler 16,17.
    2. For validering, send prøvene til et akkreditert laboratorium for glyfosatkonsentrasjonsmålinger i seks grupper av fôr.
    3. I tillegg måler du glyfosatrester i vaktelekskretaprøver etter 12 måneders eksponering. Kontrollgruppen ble matet med samme organiske fôr uten GBP-tilsetning16,17.
    4. Under aviary eksperimentet, endre sengetøy bi-ukentlig. Samle de brukte sengetøy regelmessig fra 8-12 måneders eksponering fra GBP behandling og kontroller, basseng per behandling, og lagre i lukkede beholdere i et tørt, mørkt oppbevaringsrom ved 6 °C før bruk som gjødsel.
    5. Spred 12 L av sengetøy manuelt på hver av de 18 GBP og 18 kontrollplottene (størrelse 1 m x 1 m) i et 6 x 6 sjakkbrettrutenett i det eksperimentelle feltet på to tidspunkter. I denne studien ble sengetøyene spredt i august 2018 og i mai 2019.
    6. Send sengetøysprøvene til et akkreditert laboratorium for glyfosatkonsentrasjonsmålingene rett etter spredning (i denne studien i mai 2019).
    7. Plante flerårig gress og jordbærplanter i hvert tomt for å studere deres rot og bladmikrobiota.
      MERK: I denne studien ble fire flerårige gressplanter (Festuca pratensis), og to jordbærplanter (Fragaria x vescana) plantet til hver tomt og studert for rot- og bladmikrobiota.

2. Mikrobiomeanalyser (16S rRNA, ITS og EPSPS gen)

MERK: De fleste mikrobiomestudiene er basert på analysen av 16S rRNA-genet for bakterielle og interne transkriberte romferdsregioner (ITS) for soppsamfunn ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsteknologier. Dermed har ikke papiret informasjon om typen EPSPS. EPSPS-sekvenser fra tusenvis av arter er tilgjengelige i offentlige repositorier (protokolldel 3) (figur 4).

  1. 16S rRNA-gen
    1. Fra frittliggende blad- og rotprøver samlet inn i forsøkene beskrevet ovenfor, identifiser de endofytiske mikrober (dvs. mikrober som bor inne i plantevev).
    2. Vask planteprøvene med vann fra springen og steriliser dem deretter for å fjerne de epifytiske mikrober (dvs. mikrober på overflaten av plantevev). Steriliser med 3% blekemiddel i 3 min, etterfulgt av en 70% etanoloppløsning i 1 min, og vask tre ganger med autoklavert ultrarent vann i 1 min hver.
    3. Frys prøvene ved -80 °C til genomisk DNA-ekstraksjon.
    4. Utfør genomisk DNA-ekstraksjon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig dna-ekstraksjonssett for anlegg etter produsentens protokoll.
    5. Målrett mot de variable områdene V6-V8 av 16S rRNA-genet fra ekstraherte DNA-prøver ved hjelp av en nestet tilnærming med diskriminerende primere som binder seg spesielt til bakteriell DNA18, og dermed minimere forsterkningen fra vertsplante-DNA.
    6. Etter tre runder med polymerasekjedereaksjon (PCR), merk målgenet med strekkode- og adaptersekvenser for å forberede det som mal for sekvensering. Følg trinn 2.1.7- 2.1.11 for PCR-forsterkning
    7. Forbered PCR-masterblandingen for det nødvendige antallet prøver, slik at hver reaksjon har 30 μLof totalt volum og består av 30 ng DNA, 1x PCR-buffer, 0,2 mM dNTPer, 0,3 μM av hver primer og 2000 U / ml DNA-polymerase. Følg det samme trinnet for andre og tredje runde av PCR.
    8. For første runde med PCR, bruk primere 799F19 og 1492R (modifisert fra20) (tabell 1). Sett opp forsterkningsprofilen på termosykleren (3 minutter innledende denaturering ved 95 °C, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 95 °C i 45 s, gløding ved 54 °C i 45 s og forlengelse ved 72 °C i 1 min). Utfør den endelige forlengelsen ved 72 °C i 5 minutter.
    9. Som mal for andre runde av PCR, kontroller forsterkning ved elektroforese (5 μL av PCR-produktene på 1,5% agarose gel) og fortynn deretter resten 25 μL av PCR-produktet i autoklavert ultrarent vann i forholdet 1:10.
    10. Gjenta PCR med de fortynnede PCR-malene og primerne uni-1062F21 og uni-1390R22 (tabell 1). Oppretthold de samme PCR-reaksjonsbetingelsene og forsterkningsprofilen (trinn 2.1.8), bortsett fra å redusere antall sykluser til 25.
    11. Fortynn de resulterende PCR-produktene i autoklavert ultrarent vann i forholdet 1:1. Utfør den tredje runden med PCR for å merke produktene med strekkodene og P1-adaptersekvensen med 8 sykluser av samme PCR-profil som nevnt i trinn 2.1.8.
  2. Klargjøring av bibliotek
    1. Kontroller konsentrasjonen og kvaliteten på PCR-produkter på en bioanalyse og samle volumene som utgjør 30 ng DNA fra hver prøve i et 1,5 ml rør for å forberede et equimolarbibliotek.
    2. Velg amlikonene i størrelse 350-550 bp etter størrelsesfraksjonering ved hjelp av et automatisert DNA-størrelsesvalgsystem på en agarose gelkassett. Vær oppmerksom på at dette også eliminerer ikke-spesifikke amlikoner og PCR-reagenser fra biblioteket. Samle elute bestående av amplikoner av den angitte størrelsen i et hetteglass i kassetten, noe som resulterer i et renset 16S rRNA genbibliotek.
    3. Rør ut elutten i et 1,5 ml rør og kontroller renheten og konsentrasjonen på bioanalysen. Fortynn DNA-biblioteket ved hjelp av autoklavert ultrarent vann til en endelig konsentrasjon på 26 pM; Prøven er klar for sekvensering.
  3. DENS
    MERK: ITS-regionen forsterkes ved hjelp av ITS-spesifikke primere (tabell 1), og det resulterende PCR-produktet er merket med strekkoder og en P1-adaptersekvens for sekvensering.
    1. Forbered PCR-hovedmiksen i henhold til samme protokoll som nevnt i avsnitt 2.1 med ITS primere .
    2. Sett forsterkningsprofilen på termosykleren som 5-min innledende denaturering ved 95 °C etterfulgt av 35 sykluser med denaturering, annealing og forlengelse ved 95 °C i 30 s, 55 °C i henholdsvis 30 s, 72 °C i 1 min og endelig forlengelse 72 °C i 7 minutter.
    3. Analyser 5 μL av PCR-produktet på 1,5 % agarosegel og fortynn de resterende 25 μL til 1:10 ved hjelp av autoklavert ultrarent vann. Bruk det fortynnede PCR-produktet som mal for andre runde av PCR.
    4. Forbered PCR-hovedmiks for det nødvendige antallet prøver (se trinn 2.1.6) med strekkodemerkede fremoverprimere og P1-adaptermerkede omvendte primere. Forsterk med samme forsterkningsprofil som i trinn 2.3.2, bortsett fra å bruke 8 sykluser.
    5. Klargjør de resulterende PCR-produktene for sekvensering i henhold til protokollene som er nevnt i avsnitt 2.2.
  4. EPSPS-gen
    1. Sekvenser og analyser EPSPS-genene til mikrober.
      MERK: Av hensyn til å finne ut om GBP-eksponering endret sammensetningen av glyfosatfølsomme og resistente mikrober i samfunnet, må EPSPS-genene til mikroberene sekvenseres og analyseres. Dermed ble 353 sekvenser av EPSPS-gener fra en bred samling av mikrobiell taxa i ATGC-databasen (Alignable Tight Genomic Clusters) samlet, og alle proteinsekvenser ble justert22. Disse justeringene er tilgjengelige i ATGC database23 og kan brukes til å generere primere fra konserverte regioner. Et brukervennlig bioinformatikkverktøy er designet for å identifisere bevarte regioner fra en flersekvensjustering, og dette er tilgjengelig på Pere Puigbo forskningsside24. Det er imidlertid utenfor denne publikasjonens virkeområde å gi en detaljert beskrivelse av denne webserveren. Likevel er en prospektiv protokoll for å utnytte disse primerne til forsterkning av EPSPS-genet for å finne mikrobiomets følsomhet for glyfosat gitt i figur 4.

3. Innsamling av EPSPS proteinsekvenser fra offentlige depoter

  1. EPSPS-sekvenser som skal brukes i makroevolusjonsstudier
    1. Samle EPSPS-proteiner fra offentlige depoter som PFAM23 (en database med proteinfamilier25), GenBank24 (en database med gener, genomer og proteiner26 ), COG25 (Klynger av orthologous Groups27; en database med ortopediske proteiner fra arkaea og bakterier); og PDB26 (Protein Data Bank28; en database med proteinstrukturer).
      MERK: En fersk studie utført av forskerne viste at disse proteinene kunne brukes til å utføre mikroevolusjonære og komparative analyser av den potensielle effekten av glyfosat på organismer som har shikimatebanen12. Forfatterne har utviklet et brukervennlig nettsted som samler informasjon om titusenvis av EPSPS proteinsekvenser29, inkludert et manuelt kuratert datasett av proteiner fra den menneskelige tarmmikrobiomet12. Informasjonen i disse forhåndsberegnete datasettene inkluderer den nåværende EPSPS-klassifiseringen til putativ sensitiv og motstandsdyktig mot glyfosat, taksonomisk informasjon om arter, merknader fra EPSPS aktive nettsted og lenker til PDB- og NCBI-databaser. Videre inkluderer webserveren ID-kodene til EPSPS og lenker til flere eksterne databaser (tabell 2).
  2. EPSPS-sekvenser som skal brukes i mikroevolusjonsstudier ATGC
    MERK: Generelle depoter av proteinsekvenser er nyttige for å gjennomføre komparative studier blant relativt fjerne organismer; Imidlertid er den potensielle effekten av glyfosat relativt nylig fra et evolusjonært synspunkt. I noen studier er det derfor nødvendig å sammenligne nært beslektede arter (f.eks. forskjellige stammer fra samme bakteriearter) for å bestemme effekten av glyfosat14. I disse tilfellene er databasen over justerbare tette genomklynger (ATGC)30, som inneholder en omfattende liste over nært beslektede arkaeale og bakterielle genomer, en mer egnet ressurs. ATGC-databasen inneholder informasjon om flere millioner proteiner fra tusenvis av genomer organisert i hundrevis av klynger30. Hver genomklynge er justerbar (genomer deler synteny over ≥85% av lengdene) og stramt (har en synonym substitusjonsrate under metning). Forskerne brukte ATGC-datasettet i en nylig studie for å analysere mikroevolusjonære endringer i EPSPS-proteiner14. Følgende trinn er nødvendige for å identifisere EPSPS proteinsekvens i ATGC:
    1. Last ned hele databasen med ATGCer fra lenken31 og alle proteiner i COG0128 (kode som tilsvarer EPSPS-proteiner i databasen)32 til et lokalt prosjekt.
      MERK: Hvis forskerne/eksperimentene er basert i Finland, tilbyr CSC-IT Center for Science33 lagrings- og programvarefasiliteter. Det er viktig å samle alle sekvenser i FASTA-format.
    2. Bygget en eksplosjonsdatabase av COG0128 som inneholder ortologer av EPSPS-proteinet i et representativt sett av arter av prokaryoter. CSC har sprengningsprogrammet34 forhåndsinstallert, slik at bruk av kommandoen makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot for å opprette en referansedatabase med EPSPS-sekvenser.
    3. Kartlegg ATGC-databasen til COG0128.fa (EPSPS-proteiner) ved hjelp av et iterativt eksplosjonssøk med kommandoen blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150.
    4. Som et resultat oppretter det et datasett av EPSPS proteinsekvenser i hver. Et forhåndsberegnet datasett med nært beslektede EPSPS-proteinsekvenser fra ATGC-databasen er tilgjengelig29.

4. Algoritme for å bestemme organismenes potensielle følsomhet for glyfosat (EPSPSClass webserver: innganger, prosessering og utganger)

MERK: Forskerne har implementert en brukervennlig server som er fritt tilgjengelig på 29 for å bestemme klassen av EPSPS proteinsekvenser12,35. Serveren krever bare en inngang av proteinsekvens i FASTA-format for å bestemme identitetsprosenten til hver av EPSPS-klassene og deres potensielle følsomhet for glyfosat. Videre kan brukere bruke webserveren til å teste sine egne referansesekvenser og aminosyremarkører. Først justerer algoritmen (figur 5) spørringssekvenser og referansesekvenser ved hjelp av et multippel sekvensjusteringsprogram35 for å bestemme aminosyreposisjoner. Deretter søker den etter tilstedeværelsen av aminosyremarkører for å identifisere EPSPS-klassen (I, II, III eller IV) i spørringssekvensen.

  1. Introduser en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format i inndatatekstboksen for å identifisere enzymets klasse (figur 6A), og trykk Send.
  2. Vurder den potensielle følsomheten til spørringssekvensen for glyfosat (figur 6B-E) fra de angitte utdataene for serveren:
    Utgang 1: Brøkdel av aminosyremarkører (dvs. identitet) som finnes i spørringssekvensene (klasse I, II og IV), og antall motiver (klasse III).
    Utgang 2: Justeringer av spørringen og referansesekvensene basert på markørrester.
    Utdata 3: Fullstendige parvise justeringer av spørrings- og referansesekvensene.
    Utgang 4: EPSPS-referansesekvenser: Vibrio cholerae(vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii(cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis(bvEPSPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis(sdEPSPS, klasse IV).
  3. På slutten av utdatasiden finner du koblinger til eksterne verktøy som sprengning og konserverte domener for å analysere EPSPS-sekvensen for spørringen ytterligere (figur 6F).

5. Vurdering av EPSPS-klassen fra universelle mikrobielle markører (16S rRNA og ITS )

MERK: De fleste mikrobiomestudier er basert på analysen av 16S rRNA og/eller ITS36. I slike tilfeller er det ikke mulig å utføre en direkte analyse av EPSPS-sekvensen. Dermed er det nødvendig med en probabilistisk tilnærming for å estimere organismenes potensielle følsomhet for glyfosat. Denne analysen er enkel og gir et rimelig estimat av typen EPSPS-sekvenser i et mikrobiomeprosjekt. Prosessen er delt inn i 3 trinn (figur 7 og figur 8):

  1. Identifiser EPSPS-sekvenser fra offentlige repositorier. EPSPS-klassen for et omfattende datasett av representative sekvenser er kompilert og forhåndsberegnet fra PFAM37, GenBank38, COG39, PDB40, ATGC30. Få tilgang til disse datasettene fra EPSPSClass-serverens hovedside, som inneholder taksonomisk informasjon og EPSPS-klassen på over 50 000 sekvenser (figur 7).
  2. Mål høyden på de eksperimentelle plantene to uker i vekstsesongen, og vei ovennevnte biomasse av plantene på slutten av feltsesongen for å sammenligne veksten av plantene i GBP og kontrollplott.
    MERK: Mikrobiotaanalysene fra felteksperimentene er ennå ikke fullstendig analysert.
  3. Bruk et regneark til å kartlegge bakterielle OTUer (basert på 16S rRNA eller ITS) fra mikrobiomeeksperimenter til forhåndsberegnet datasett.
    MERK: Tidligere studier har vist at EPSPS-klassen (dvs. den indre følsomheten for glyfosat) er sterkt bevart i en fylogenetisk gruppe14. Det er derfor relativt trygt å anta at nært beslektede arter fra høyt konserverte taksoner kan ha lignende EPSPS-responser på glyfosat (figur 8).
  4. I samme regneark beregner du den indre følsomheten for glyfosat, basert på en probabilistisk poengsum (S = s / (s + r + u) der S: Sensitivitetspoeng; s: antall potensielt sensitive sekvenser; r: antall potensielt motstandsdyktige sekvenser; u: antall uklassifiserte sekvenser) beregnet fra kjente EPSPS-sekvenser i offentlige databaser.
    MERK: Denne poengsummen varierer fra 0 (ingen sensitive EPSPS-sekvenser finnes i en takson) til 1 (alle sekvenser i en takson er følsomme for glyfosat) (figur 8). Videre er det mellom verdier-dvs.

Representative Results

Målet med denne protokollen er å gi en generell rørledning, fra feltforsøk til bioinformatikkanalyser, som kvantifiserer organismenes potensielle følsomhet overfor herbicidglyfosat. I eksperiment 2 var den gjennomsnittlige glyfosatkonsentrasjonen i vaktelfôret 164 mg/kg, og den gjennomsnittlige glyfosatkonsentrasjonen av ekskretaprøvene (urin og fekal materie til sammen) var 199 mg/kg. Sengetøy samlet fra vaktler matet med GBP-forurenset fôr hadde i gjennomsnitt 158 mg/kg og kontroll sengetøy som måler 0,17 mg/kg glyfosat (tabell 3). I felteksperimentene reagerte plantearter forskjellig på glyfosatrester i jorda (avsnitt 1). Biomasse av havre- og rognvoldtekt var større i kontrolljord sammenlignet med GBP-behandlet jord. Faba bønner og potet så imidlertid ut til å dra nytte av GBP-behandling på slutten av vekstsesongen15. Glyfosat i fjærfegjødsel reduserte planteveksten i gresset (Festuca pratensis) og jordbær (Fragaria x vescana) (avsnitt 1). Mikrobiotaanalysene fra felteksperimentene er ennå ikke fullstendig analysert og presenteres ikke her (§ 2). Resultatene av denne protokollen, når den leses direkte (som vist i avsnitt 3 og 4) eller indirekte (avsnitt 5), gir et mål på andelen potensielt følsomme og resistente organismer for glyfosat i et datasett (figur 9). Bruken av denne metoden ble testet med en samling EPSPS proteinsekvenser fra mikrobielle arter av kjernen human tarmmikrobiom som ble hentet fra offentlige depoter12. I studien ble 890 stammer fra de 101 mest tallrike bakterieartene analysert med EPSPSClass-metoden for å kvantifisere andelen følsomme og resistente bakterier. Resultatene viste at 54% av artene i kjernemikrobiomet i tarmen er potensielt følsomme for glyfosat12. Denne trenden observeres også i det meste av den prokaryote verden; I tillegg, i eukaryoter (hovedsakelig planter og sopp), er andelen potensielt følsomme arter enda høyere12. Videre har vi brukt denne metoden for å kvantifisere endringer i følsomhet i EPSPS-proteinet på mikro evolusjonært nivå (figur 10)14. Vi identifiserte endringer i sensitivitetsstatus i 12 av 32 nært beslektede grupper av prokaryoter analysert (tabell 4)14. Dermed kan kontinuerlig bruk av GBP-ene produsere mikrobiell dysbiose (dvs. en ubalanse av følsomme og resistente bakteriearter) i plante-, dyre- og jordmikrobiomer. Videre har det blitt hypoteset at en økning i glyfosatresistente bakterier kan fremme multidrug-resistente mikrobiomer 14,41,42. Dermed kaster denne protokollen lys over tolkningen av alle disse scenariene, da EPSPS-klassifiseringsmetoden gir et direkte estimat av mikrobiomers iboende følsomhet for glyfosat. På grunn av den iboende følsomheten til EPSPS-proteinet til glyfosat er fylogentisk bevart14, er det mulig å ekstrapolere resultatene fra eksisterende datasett til ukjente mikrobiomer (figur 8).

Figure 1
Figur 1: Generell rørledning Dette er en generell rørledning for å analysere følsomhet overfor GBP fra felteksperimenter til bioinformatikkanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Felteksperiment 1 for å teste effekten av GBP-rester på avlingsanleggsrelaterte mikrober. Det eksperimentelle feltet består av vekslende 10 kontrollplott og 10 GBP behandlingsplott (23 m x 1,5 m) med 1,5 m bufferstrimler mellom tomter. To ganger i året siden 2014 ble GBP-tomtene behandlet med kommersiell GBP (glyfosatkonsentrasjon 450 g L-1, applikasjonshastighet 6,4 L ha-1 i 5 L vann fra springen per tomt) og kontrollplottene med samme mengde kranvann uten glyfosat. Behandlingene ble påført med en håndoperert trykktank ved hjelp av en plasthette i sprinklerspissen for å beskytte GBP-er mot spredning utenfor behandlingsplottene. Etter en to ukers sikkerhetsperiode etter GBP-søknaden ble havre (Avena sativa), fababønner (Vicia faba) og rognvoldtekter (Brassica rapa subsp. oleifera) sådd, og poteter (Solanum tuberosum) ble plantet i tomtene. Mikrobiotaprøver fra de studerte avlingsplanter, blader og røtter ble samlet flere ganger siden starten av eksperimentet i 2014. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Felteksperiment 2 testet konsekvensene av GBP-rester i gjødselgjødsel for to flerårige avlinger og deres tilhørende mikrobiota. Sengetøy samlet inn fra et 12-måneders aviary eksperiment med japanske vaktler matet med kontroll eller GBP-forurenset fôr ble brukt som gjødselgjødsel i et felteksperiment. Det eksperimentelle feltet besto av 18 kontroll og 18 GBP-tomter (1 m x 1 m) arrangert i et 6 x 6 sjakkbrettrutenett. Sengetøyene ble spredt på eksperimentelt felt to ganger, i august 2018 og mai 2019 (25 L / tomt). Kontrollplott ble befruktet med sengetøy samlet fra vaktler matet med kontrollfôr og GBP-tomter med sengetøy fra vaktler matet med GBP-forurenset fôr. Glyfosatrester i kontroll sengetøy var 0,17 mg/kg glyfosat og i GBP-sengetøy var mengden 158 mg/kg glyfosat. To endofyt-symbiotiske (E+), to endofytfrie (E-) Festuca pratensis, og to Fragaria x vescana ble plantet per tomt i september 2018, omtrent en måned etter spredningen av de første sengetøyene. Målinger av anleggets ytelse og kondisjon samt prøvetaking for rot- og bladrelatert mikrobiota ble utført i løpet av to påfølgende vekstsesonger (2019 og 2020). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyse av mikrobiell taxa ved bruk av 16S rRNA-gen/ITS-region og mikrobiomers følsomhet for glyfosat ved hjelp av EPSPS-genet . (A) Analyse av 16S rRNA eller ITS-sekvenser for å identifisere mikrobiell taxa. (B) Analyse av EPSPS-sekvenser for å identifisere mikrobers følsomhet for glyfosat (GS-glyfosatfølsom/GR-glyfosatbestandig) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Algoritme for å identifisere klassen av EPSPS-proteinsekvenser. Inngangen er en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. Algoritmen utfører sammenligninger med kjente aminosyremarkører i referanseproteinsekvenser som bestemmer den potensielle følsomheten for glyfosat. Algoritmen ble implementert på den fritt tilgjengelige webserveren EPSPSClass29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Grunnleggende innganger og utganger på EPSPSClass-webserveren. (A) Inngang: en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. (B) Utgang 1 - identitet: brøkdel av aminosyremarkører til stede i spørringssekvensene (klasse I-IV) og motiver (klasse III). (C) Utgang 2 - identitet: justeringer av spørrings- og referansesekvensene. (D) Utgang 3 - parvise justeringer av spørrings- og referansesekvensene. (E) Referanse EPSPS sekvenser: Vibrio kolerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (F) Lenker for å utføre ekstra blastp-søk og identifikasjon av konserverte domener Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Tilgang til forhåndsberegnet datasett med EPSPS-sekvenser. Følg indikasjonene i figuren for å få tilgang til det forhåndsberegnet datasettet for EPSPS-sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Eksempel på hvordan man estimerer potensiell sensitivitet i mikrobiomeprosjekter uten EPSPS-sekvenser. Eksemplet bruker verdier fra databasen til Alignable Tight Genomic Clusters30, som inneholder sekvenser fra prokaryote arter. Hypotetiske arter fra et mikrobiomeprosjekt er Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci og Sulfolobus islandicus. Følsomhetspoenget til glyfosat beregnes som Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Ordningen med tolkningen av resultatene fra denne protokollen og hypotetiske evolusjonære scenarier. (A) I et mikrobiom er andelen potensiell følsomhet (i grønt) og resistens (i rødt) bakterier ca. 50:50. Svarte prikker betegner mikrobielle arter uklassifisert; Dermed er deres følsomhet for glyfosat ukjent. I noen mikrobiomer er andelen følsomme bakterier litt høyere, som i den menneskelige tarmmikrobiomet12. (B) Over tid kan bruk av glyfosat føre til mikrobiell dysbiose (dvs. en ubalanse i andelen følsomme og resistente bakterier) som fører til ulike hypotetiske scenarier. (C) Hypotetisk tilfelle 1 (ingen valg): Bruk av glyfosat påvirker ikke mikrobiomet; Dermed forblir andelen følsomme og resistente bakterier konstant. (D) Hypotetisk tilfelle 2: Bruken av glyfosat fjerner bakterier som er følsomme for glyfosat fra befolkningen. Vi spekulerer i at dette scenariet kan være doseavhengig. (E) Hypotetisk tilfelle 3: Seleksjonstrykk ved bruk av glyfosat forbedrer mutasjoner i EPSPS-genet som endrer bakteriens følsomhetsstatus. Dermed blir hele mikrobiell populasjonen motstandsdyktig mot glyfosat. Videre kan det i dette scenariet være en økning i multidrug-resistente bakterier. (F) Hypotetisk tilfelle 4: Bruken av glyfosat endrer sammensetningen av visse bakteriearter, og produserer en ubalanse mot resistente bakterier, mens noen bakteriearter forblir uendret, muligens på grunn av ytterligere resistente mekanismer som effluxpumper eller ved overekspressering av EPSPS-genet 13. Dette scenariet kan også føre til en økning i glyfosatresistente bakterier, samt en økning i bakteriell resistens mot ekstra antibiotika. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Fordeling av den predikerte følsomheten for glyfosat over artstreet. Sektordiagrammer angir andelen arter som er putativt følsomme (grønne) eller motstandsdyktige (røde) mot glyfosat og uklassifisert (svart). Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Rainio et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Innganger og utdata fra EPSPSClass webserver for å teste brukerens egen referansesekvens. (A) Inndata 1: spørringssekvens. (B) Inngang 2: referansesekvens. (C) Inngang 3: aminosyremarkører i referansesekvensene. (D) Utgang: identitet: brøkdel av aminosyremarkører i spørringssekvensene (klasse I-IV og brukerens egne referansesekvenser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Liste over primere for PCR-forsterkning av 16S rRNA-gen og ITS-region i mikrobiomeanalyse Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Koder for enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfatsyntase (EPSPS) i forskjellige databaser Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Gjennomsnittlig glyfosatkonsentrasjon Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Oppsummeringstabell over prosentandelen arter som er følsomme/motstandsdyktige mot glyfosat. Denne tabellen er tilpasset med tillatelse fra Rainio et al.14. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Posisjoner av aminosyremarkørene i referansesekvensene Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Denne protokollen gir generell veiledning om hvordan du kvantifiserer effekten av GBP på mikrobiomer basert på analysen av EPSPS-proteinet. Protokollen har tre viktige kritiske trinn: (i) Kvantifisering av EPSPS-proteinet fra mikrobiomedata. Dette trinnet er kritisk fordi EPSPS er det direkte målenzymet til herbicidet. Dermed kan arter som har en kopi av EPSPS-genet bli påvirket av bruk av GBP. Likevel kan selv arter som mangler en kopi av EPSPS-genet bli påvirket av herbicidet gjennom alternative ikke-målmekanismer43,44. (ii) Hvis analysen av EPSPS-genet ikke er inkludert i utformingen av studien, er det mulig å få et godt estimat ved å analysere 16S rRNA (bakterier) eller ITS (sopp). I dette tilfellet er det viktig å stole på en omfattende referansetabell (f.eks. at ATGC-databasen gir sekvenser av EPSPS-proteinet fra flere nært beslektede arter). (iii) EPSPS-proteinet er delt inn i potensielt følsomt eller motstandsdyktig mot glyfosat avhengig av visse aminosyrerester av det aktive stedet til EPSPS. Mutasjoner som påvirker en enkelt aminosyre kan imidlertid endre denne klassifiseringen45, og overganger mellom klasser kan forekomme på relativt kort tid14.

Den potensielle følsomheten til organismer for glyfosat kan bestemmes av referansegenomer, aminosyremarkører og sekvensjusteringer. (i) Referansegenomer: EPSPS-enzymet kan klassifiseres som potensielt følsomt (klasse I [alfa eller beta]46,47) eller resistent (klasse II48,49, III50 og IV51) til glyfosat basert på tilstedeværelsen av aminosyremarkører og motiver (når det gjelder klasse III). Disse aminosyremarkørene og motivene er basert på plasseringen av aminosyrerester i EPSPS-proteinet til Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III) og Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (ii) Aminosyremarkører: Glyfosat interagerer med EPSPS-enzymet og konkurrerer med fosfoenolpyruvat (PEP, det andre substratet av EPSPS-enzymet)52,53. I visse arter gir små aminosyreendringer i EPSPS-sekvensen en høyere affinitet for PEP og en motstand mot glyfosat 12,14,52,54,55. I andre sekvenser binder glyfosat EPSPS-sekvensen i en ikke-hemmende konformasjon 45. Selv om mange motstandsdyktige 12,14,48,49,52,54,55 og tolerante 56,57 EPSP-sekvenser til glyfosat er beskrevet, er det nåværende klassifikasjonssystemet for EPSPS delt inn i fire hovedklasser (I-IV )12 (tabell 5 ). (iii) Sekvensjusteringer: For å klassifisere et EPSPS-enzym utførte vi parvise justeringer, med flere sekvensjusteringsprogram-standardparametere35-, av spørringssekvensen mot hver av referansesekvensene (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS og sdEPSPS). Disse justeringene er nødvendige for å identifisere posisjonene til aminosyremarkørene i spørringssekvensen. Som et resultat er et enzym klassifisert som beskrevet12-klasse I, II og / eller IV basert på tilstedeværelsen av aminosyremarkører og klasse III-baserte motivmarkører.

Protokollen er basert på fire kjente typer EPSPS: den ene typen er følsom, de tre andre er motstandsdyktige). Imidlertid er omtrent 10% av EPSPS-sekvensene i prokaryoter ennå uklassifisert (16% i arkaea og 8% i bakterier)12. Dermed bør videre forskning analysere disse sekvensene for å bestemme glyfosatfølsomhet. EPSPSClass-serveren gir et alternativ for å teste nye genetiske markører. Identifiseringen av kjente klasser av EPSPS er enkel, som vist i avsnitt 4.4. og figur 5. Videre, i de tilfellene der brukerne ønsker å sammenligne sine egne spørrings- og referanseproteiner, gir serveren et alternativ for å manuelt inkludere en referansesekvens og et sett med aminosyremarkører (figur 11). Dette alternativet kan brukes til å identifisere nye klasser av EPSPS, samt å teste andre ugressmidler og målsekvenser.

Analysen av EPSPS-klassen bestemmes av sekvensanalyse og tilstedeværelse/fravær av aminosyremarkører. Dette er et foreløpig anslag som kan brukes til hypotesetesting i felten. Aminosyremarkører er bestemt i litteraturen basert på empiriske og observasjonsstudier 46,47,48,49,50,51. Referanseproteinsekvenser for å bestemme EPSPS-klassen har imidlertid bare blitt testet i et begrenset antall arter og kan av og til unnlate å forklare motstand mot glyfosat. Effekten av kompenserende mutasjoner og EPSPS-tilknyttede domener (for det meste i sopp) kan også påvirke følsomheten for glyfosat58. Denne artikkelens analyse er basert på fire EPSPS-klasser. En undersøkelse av bakterier i det menneskelige tarmmikrobiomet viste at rundt 30% av dem var uklassifiserte (dvs. EPSPS-proteiner fra disse artene tilhører ikke noen av de kjente klassene), og ytterligere studier er nødvendige for å identifisere andre EPSPS-klasser. Det skal også be merkes at EPSPS-proteinsekvensen i bakterier og planter er unidomain, mens sopp EPSPS-proteiner inneholder flere domener59. Dermed kan en proteinfolding i sopp føre til en annen respons av EPSPS-enzymet til glyfosat. Videre vurderes ikke ytterligere ikke-målmekanismer for resistens (f.eks. effluxpumper og overtrykk av EPSPS-genet 13) eller følsomhet for glyfosat (f.eks. effekten av glyfosat på mitokondrietransportkjeden12).

Selv om GBP-er har eksistert som et herbicid siden 1974 og har blitt mye brukt siden 1991, er dette den første bioinformatikkmetoden for å bestemme organismenes potensielle følsomhet for glyfosat. Metoden er basert på identifisering av kjente aminosyrerester i målsekvensen. Dermed gir vår metode et grunnleggende estimat av den potensielle effekten av glyfosat på arten. I nær fremtid bør nye bioinformatikkmetoder inkludere tilleggsklasser av EPSPS-proteinet for å bestemme potensiell følsomhet for glyfosat av uklassifiserte sekvenser 12,54,55. I tillegg, gitt at den eksakte oppførselen til EPSPS-enzymet kan variere ved enkelt aminosyreforandringer 12,14,52,54,55, bør ytterligere i silico-eksperimenter ta hensyn til små variasjoner i folding av EPSPS-proteinet, samt effekten av EPSPS-tilknyttede domener på proteinstrukturen i sopp 58 . Videre har det vist seg at toleranse for glyfosat kan produseres ved overtrykk av EPSPS-proteinet56,57; Bioinformatikkanalyser basert på ameliorering av codonbruk60 kan derfor brukes til å identifisere nye EPSPS-sekvenser som maksimerer eller minimerer genuttrykk.

Bønder, politikere og beslutningstakere trenger raskt en grundig forståelse av risikoen forbundet med tung bruk av plantevernmidler. Dermed er det nødvendig med både bioinformatiske verktøy som avslører organismenes potensielle følsomhet overfor plantevernmidler og velrepliserte, randomiserte og feltrealistiske eksperimentelle studier utført i forskjellige miljøer. Den presenterte bioinformatiske metoden designet for å undersøke organismenes følsomhet for glyfosat kan moduleres for andre plantevernmidler. På samme måte kan metodene for eksperimentell økologi brukes til å studere relaterte økologiske spørsmål. Sammen kan metodene brukes til å demonstrere tap mellom feltobservasjoner, genomiske data og bruk av plantevernmidler. Alle presenterte metoder er uvurderlige i risikovurdering. Bioinformatiske metoder kan for eksempel brukes til å overvåke mikrobielle tilpasninger til agrokjemikalier og for å gi en kvantitativ metode for å teste potensielle andre tilknyttede risikoer, for eksempel en økning i resistens av patogener mot agrokjemikalier, negative effekter på mikrober som brukes som biologiske kontrollmidler i integrert skadedyrshåndtering (IPM) og antibiotikaresistens hos bakterier.

Disclosures

Interessekonflikter: ingen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Finlands akademi (tilskuddsnr. 311077 til Marjo Helander).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939B To check the concentration and quality of PCR products
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192 For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit Promega M7848 PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit INVITEK Molecular 1037100300 Genomic DNA extraction from plant tissues
Ion Chip Minifuge ThermoFisher Scientific 4479672 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM System ThermoFisher Scientific 4462921 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server ThermoFisher Scientific 4483643 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep SageScience PIP0001 For size fractionation of PCR amplicons
Pressure tank Berthoud 102140 For sprayin glyphosate based products in field
Primers Sigma Aldrich Custom-made For PCR amplification
Rotary tiller Grillo 984511 For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler BIO-RAD 1852196 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422 (2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway--a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556 (2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653 (2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349 (2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , John Wiley & Sons. New York. 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360 (2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. JoVE Supplementary Material. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021).
  24. Alignments Conserved Positions. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021).
  25. Protein Families. , Available from: http://pfam.xfam.org (2021).
  26. NCBI GenBank. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021).
  27. COG Database. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021).
  28. Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org (2021).
  29. EPSPSClass. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021).
  30. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  31. ATG_NCBI. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/kristensen/ATGC/atgc_home.html (2021).
  32. COG2020. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/COG/COG2020/data (2021).
  33. CSC - IT CENTER FOR SCIENCE LTD. , Available from: https://www.csc.fi (2021).
  34. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  36. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  37. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  38. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  39. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 261-269 (2015).
  40. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  41. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  42. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  43. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  44. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  45. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  46. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  47. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  48. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , US5627061A (1997).
  49. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  50. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , REP. WO2006US13161 (2006).
  51. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , US20130217577A1 (2013).
  52. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  53. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  54. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  55. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  56. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  57. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133 (2019).
  58. Tall, T. A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  59. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6 (2020).
  60. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, Web server issue 126-131 (2007).

Tags

Miljøvitenskap utgave 179
Kvantifisering av den potensielle effekten av glyfosatbaserte produkter på mikrobiomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, … More

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Helander, M., Puigbò, P. Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes. J. Vis. Exp. (179), e63109, doi:10.3791/63109 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter