Glyfosatbaserte produkter (GBP) er de vanligste bredspektrede ugressmidlene over hele verden. I denne artikkelen innfører vi generelle retningslinjer for å kvantifisere effekten av GBP på mikrobiomer, fra felteksperimenter til bioinformatikkanalyser.
Glyfosatbaserte produkter (GBP) er de vanligste bredspektrede ugressmidlene over hele verden. Målet for glyfosat er enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfatsyntase (EPSPS) i shikimatebanen, som er praktisk talt universell i planter. Hemmingen av enzymet stopper produksjonen av tre essensielle aminosyrer: fenylalanin, tyrosin og tryptofan. EPSPS er også til stede i sopp og prokaryoter, som arkaea og bakterier; Dermed kan bruken av GBP ha innvirkning på mikrobiomsammensetningen av jord, planter, plantelevende dyr og sekundære forbrukere. Denne artikkelen tar sikte på å presentere generelle retningslinjer for å vurdere effekten av GBP på mikrobiomer fra felteksperimenter til bioinformatikkanalyser og gi noen testbare hypoteser. To felteksperimenter presenteres for å teste GBP på ikke-målorganismer. For det første prøves og analyseres planterelaterte mikrober fra 10 replikerte kontroll- og GBP-behandlingsplott som simulerer no-till beskjæring. I det andre eksperimentet ble det oppnådd prøver fra eksperimentelle tomter befruktet av enten fjærfegjødsel som inneholder glyfosatrester eller ikke-behandlet kontrollgjødsel. Bioinformatikkanalyse av EPSPS proteinsekvenser brukes til å bestemme mikrobers potensielle følsomhet for glyfosat. Det første trinnet i å estimere effekten av GBP på mikrobiomer er å bestemme deres potensielle følsomhet for målenzymet (EPSPS). Mikrobielle sekvenser kan fås enten fra offentlige depoter eller ved hjelp av PCR-forsterkning. I de fleste feltstudier er imidlertid mikrobiomesammensetningen bestemt basert på universelle DNA-markører som 16S rRNA og den interne transkriberte avstandsstykken (ITS). I disse tilfellene kan følsomhet for glyfosat bare estimeres gjennom en probabilistisk analyse av EPSPS-sekvenser ved hjelp av nært beslektede arter. Kvantifiseringen av organismenes potensielle følsomhet for glyfosat, basert på EPSPS-enzymet, gir en robust tilnærming for videre eksperimenter for å studere mål- og ikke-målbestandige mekanismer.
Den tunge bruken av plantevernmidler i moderne landbruk er helt klart en stor bidragsyter til nedgangen i biologisk mangfold1. Dette papiret fokuserer på glyfosat fordi glyfosatbaserte produkter (GBPer) har blitt de mest brukte plantevernmidlene globalt på grunn av deres effektivitet og rimelige pris 2,3. I tillegg til å drepe ugress i jordbruksmarker, brukes GBP-er ofte i silvikultur, urbane miljøer og hager; I tillegg har de blitt proklamert som ikke-giftige for ikke-målrettede organismer hvis de brukes i samsvar med produsentens instruksjoner. Imidlertid har et økende antall nyere studier avslørt at rester av glyfosat og dets nedbrytningsprodukter kan beholdes og transporteres i jord, og dermed ha kaskadeeffekter på ikke-målorganismer 4,5,6,7,8 . Effekten av glyfosat er ikke bare begrenset til planter – shikimate-banen er også til stede i mange sopp og prokaryoter. Glyfosat retter seg mot enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfatsyntase (EPSPS) i shikimate-banen, også kjent som aroA9. Dette enzymet er i sentrum av shikimate-banen i syntesen av de tre essensielle aromatiske aminosyrene (fenylalanin, tyrosin og tryptofan), og det er til stede i de fleste prokaryoter, planter og sopp10,11. Noen mikrobielle arter har utviklet delvis eller absolutt motstand mot glyfosat ved hjelp av flere mekanismer, inkludert mutasjoner i EPSPS-sekvensene. Dermed har det blitt antydet at bruk av GBPs kan ha en direkte effekt på plante- og dyremikrobiomer, inkludert det menneskelige tarmmikrobiomet 12,13,14. Likevel kan bruk av GBP ha en negativ innvirkning på praktisk talt alle økosystemfunksjoner og tjenester som er avhengige av mikrober og mikrobe-tilrettelagte prosesser. De påfølgende truslene kan gjelde biokjemiske jordprosesser, pollineringsbiologi og dyre- og menneskelig velvære. Dette krever en mer omfattende forståelse av hvordan glyfosat påvirker shikimate veier og metoder for å vurdere mikrobers følsomhet for glyfosat.
I denne protokollen presenterer vi en rørledning for å teste effekten av glyfosat og GBP på mikrobiomet, fra felteksperimenter til bioinformatikkanalyser. Vi beskriver i detalj en nylig publisert bioinformatikkmetode som kan brukes til å bestemme organismenes potensielle følsomhet for glyfosat12. Så vidt forskerne vet, er dette det første og hittil eneste bioinformatikkverktøyet som vurderer den iboende følsomheten til enzymet EPSPS til den aktive komponenten av GBP-er. Denne bioinformatikkmetoden er basert på påvisning av kjente aminosyremarkører i glyfosatmålenzymet (EPSPS)12. Rørledningen er delt inn i fem hovedarbeidsfaser (figur 1): 1) en kort innføring i to feltforsøk for å teste effekten av GBP-er, 2) en kort oppsummering av mikrobiomeanalyser (16S rRNA, ITS og EPSPS gen), 3) innsamling av EPSPS-sekvenser fra offentlige depoter, 4) som bestemmer organismenes potensielle følsomhet for glyfosat, og 5) vurdering av EPSPS-klassen fra universelle mikrobielle markører (16S rRNA og ITS).
Denne protokollen gir generell veiledning om hvordan du kvantifiserer effekten av GBP på mikrobiomer basert på analysen av EPSPS-proteinet. Protokollen har tre viktige kritiske trinn: (i) Kvantifisering av EPSPS-proteinet fra mikrobiomedata. Dette trinnet er kritisk fordi EPSPS er det direkte målenzymet til herbicidet. Dermed kan arter som har en kopi av EPSPS-genet bli påvirket av bruk av GBP. Likevel kan selv arter som mangler en kopi av EPSPS-genet bli påvirket av herbicidet gjennom alternative ikke-målmekanismer43,44. (ii) Hvis analysen av EPSPS-genet ikke er inkludert i utformingen av studien, er det mulig å få et godt estimat ved å analysere 16S rRNA (bakterier) eller ITS (sopp). I dette tilfellet er det viktig å stole på en omfattende referansetabell (f.eks. at ATGC-databasen gir sekvenser av EPSPS-proteinet fra flere nært beslektede arter). (iii) EPSPS-proteinet er delt inn i potensielt følsomt eller motstandsdyktig mot glyfosat avhengig av visse aminosyrerester av det aktive stedet til EPSPS. Mutasjoner som påvirker en enkelt aminosyre kan imidlertid endre denne klassifiseringen45, og overganger mellom klasser kan forekomme på relativt kort tid14.
Den potensielle følsomheten til organismer for glyfosat kan bestemmes av referansegenomer, aminosyremarkører og sekvensjusteringer. (i) Referansegenomer: EPSPS-enzymet kan klassifiseres som potensielt følsomt (klasse I [alfa eller beta]46,47) eller resistent (klasse II48,49, III50 og IV51) til glyfosat basert på tilstedeværelsen av aminosyremarkører og motiver (når det gjelder klasse III). Disse aminosyremarkørene og motivene er basert på plasseringen av aminosyrerester i EPSPS-proteinet til Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III) og Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (ii) Aminosyremarkører: Glyfosat interagerer med EPSPS-enzymet og konkurrerer med fosfoenolpyruvat (PEP, det andre substratet av EPSPS-enzymet)52,53. I visse arter gir små aminosyreendringer i EPSPS-sekvensen en høyere affinitet for PEP og en motstand mot glyfosat 12,14,52,54,55. I andre sekvenser binder glyfosat EPSPS-sekvensen i en ikke-hemmende konformasjon 45. Selv om mange motstandsdyktige 12,14,48,49,52,54,55 og tolerante 56,57 EPSP-sekvenser til glyfosat er beskrevet, er det nåværende klassifikasjonssystemet for EPSPS delt inn i fire hovedklasser (I-IV )12 (tabell 5 ). (iii) Sekvensjusteringer: For å klassifisere et EPSPS-enzym utførte vi parvise justeringer, med flere sekvensjusteringsprogram-standardparametere35-, av spørringssekvensen mot hver av referansesekvensene (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS og sdEPSPS). Disse justeringene er nødvendige for å identifisere posisjonene til aminosyremarkørene i spørringssekvensen. Som et resultat er et enzym klassifisert som beskrevet12-klasse I, II og / eller IV basert på tilstedeværelsen av aminosyremarkører og klasse III-baserte motivmarkører.
Protokollen er basert på fire kjente typer EPSPS: den ene typen er følsom, de tre andre er motstandsdyktige). Imidlertid er omtrent 10% av EPSPS-sekvensene i prokaryoter ennå uklassifisert (16% i arkaea og 8% i bakterier)12. Dermed bør videre forskning analysere disse sekvensene for å bestemme glyfosatfølsomhet. EPSPSClass-serveren gir et alternativ for å teste nye genetiske markører. Identifiseringen av kjente klasser av EPSPS er enkel, som vist i avsnitt 4.4. og figur 5. Videre, i de tilfellene der brukerne ønsker å sammenligne sine egne spørrings- og referanseproteiner, gir serveren et alternativ for å manuelt inkludere en referansesekvens og et sett med aminosyremarkører (figur 11). Dette alternativet kan brukes til å identifisere nye klasser av EPSPS, samt å teste andre ugressmidler og målsekvenser.
Analysen av EPSPS-klassen bestemmes av sekvensanalyse og tilstedeværelse/fravær av aminosyremarkører. Dette er et foreløpig anslag som kan brukes til hypotesetesting i felten. Aminosyremarkører er bestemt i litteraturen basert på empiriske og observasjonsstudier 46,47,48,49,50,51. Referanseproteinsekvenser for å bestemme EPSPS-klassen har imidlertid bare blitt testet i et begrenset antall arter og kan av og til unnlate å forklare motstand mot glyfosat. Effekten av kompenserende mutasjoner og EPSPS-tilknyttede domener (for det meste i sopp) kan også påvirke følsomheten for glyfosat58. Denne artikkelens analyse er basert på fire EPSPS-klasser. En undersøkelse av bakterier i det menneskelige tarmmikrobiomet viste at rundt 30% av dem var uklassifiserte (dvs. EPSPS-proteiner fra disse artene tilhører ikke noen av de kjente klassene), og ytterligere studier er nødvendige for å identifisere andre EPSPS-klasser. Det skal også be merkes at EPSPS-proteinsekvensen i bakterier og planter er unidomain, mens sopp EPSPS-proteiner inneholder flere domener59. Dermed kan en proteinfolding i sopp føre til en annen respons av EPSPS-enzymet til glyfosat. Videre vurderes ikke ytterligere ikke-målmekanismer for resistens (f.eks. effluxpumper og overtrykk av EPSPS-genet 13) eller følsomhet for glyfosat (f.eks. effekten av glyfosat på mitokondrietransportkjeden12).
Selv om GBP-er har eksistert som et herbicid siden 1974 og har blitt mye brukt siden 1991, er dette den første bioinformatikkmetoden for å bestemme organismenes potensielle følsomhet for glyfosat. Metoden er basert på identifisering av kjente aminosyrerester i målsekvensen. Dermed gir vår metode et grunnleggende estimat av den potensielle effekten av glyfosat på arten. I nær fremtid bør nye bioinformatikkmetoder inkludere tilleggsklasser av EPSPS-proteinet for å bestemme potensiell følsomhet for glyfosat av uklassifiserte sekvenser 12,54,55. I tillegg, gitt at den eksakte oppførselen til EPSPS-enzymet kan variere ved enkelt aminosyreforandringer 12,14,52,54,55, bør ytterligere i silico-eksperimenter ta hensyn til små variasjoner i folding av EPSPS-proteinet, samt effekten av EPSPS-tilknyttede domener på proteinstrukturen i sopp 58 . Videre har det vist seg at toleranse for glyfosat kan produseres ved overtrykk av EPSPS-proteinet56,57; Bioinformatikkanalyser basert på ameliorering av codonbruk60 kan derfor brukes til å identifisere nye EPSPS-sekvenser som maksimerer eller minimerer genuttrykk.
Bønder, politikere og beslutningstakere trenger raskt en grundig forståelse av risikoen forbundet med tung bruk av plantevernmidler. Dermed er det nødvendig med både bioinformatiske verktøy som avslører organismenes potensielle følsomhet overfor plantevernmidler og velrepliserte, randomiserte og feltrealistiske eksperimentelle studier utført i forskjellige miljøer. Den presenterte bioinformatiske metoden designet for å undersøke organismenes følsomhet for glyfosat kan moduleres for andre plantevernmidler. På samme måte kan metodene for eksperimentell økologi brukes til å studere relaterte økologiske spørsmål. Sammen kan metodene brukes til å demonstrere tap mellom feltobservasjoner, genomiske data og bruk av plantevernmidler. Alle presenterte metoder er uvurderlige i risikovurdering. Bioinformatiske metoder kan for eksempel brukes til å overvåke mikrobielle tilpasninger til agrokjemikalier og for å gi en kvantitativ metode for å teste potensielle andre tilknyttede risikoer, for eksempel en økning i resistens av patogener mot agrokjemikalier, negative effekter på mikrober som brukes som biologiske kontrollmidler i integrert skadedyrshåndtering (IPM) og antibiotikaresistens hos bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Finlands akademi (tilskuddsnr. 311077 til Marjo Helander).
2100 Bioanalyzer Instrument | INVITEK Molecular | 1037100300 | Genomic DNA extraction from plant tissues |
dNTP mix (10 mM each) | BIO-RAD | 1852196 | For PCR reactions |
GoTaq G2 DNA Polymerase kit | Promega | M7848 | PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification |
Invisorb Spin Plant Mini Kit | Agilent | G2939B | To check the concentration and quality of PCR products |
Ion Chip Minifuge | sage science | PIP0001 | For size fractionation of PCR amplicons |
Ion PGM System | ThermoFisher Scientific | 4462921 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Ion PGM Torrent Server | ThermoFisher Scientific | 4483643 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pippinprep | ThermoFisher Scientific | 4479672 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pressure tank | Berthoud | 102140 | For sprayin glyphosate based products in field |
Primers | ThermoFisher Scientific | R0192 | For PCR amplification |
Rotary tiller | Grillo | 984511 | For tilling the soil in experimental plots |
S1000 ThermalCycler | Sigma-Aldrich | Custom-made | For PCR amplification |