Glyfosatbaserade produkter (GBP) är de vanligaste bredspektrumherbicider över hela världen. I den här artikeln introducerar vi allmänna riktlinjer för att kvantifiera effekten av GBP på mikrobiom, från fältförsök till bioinformatikanalyser.
Glyfosatbaserade produkter (GBP) är de vanligaste bredspektrumherbicider över hela världen. Målet för glyfosat är enzymet 5-enolpyruvylshikimat-3-fosfatsyntas (EPSPS) i shikimatvägen, som är praktiskt taget universell i växter. Hämningen av enzymet stoppar produktionen av tre essentiella aminosyror: fenylalanin, tyrosin och tryptofan. EPSPS finns också i svampar och prokaryoter, såsom arkéer och bakterier; Således kan användningen av GBP påverka mikrobiomsammansättningen hos jordar, växter, växtätare och sekundära konsumenter. Denna artikel syftar till att presentera allmänna riktlinjer för att bedöma effekten av GBP på mikrobiom från fältförsök till bioinformatikanalyser och ge några testbara hypoteser. Två fältförsök presenteras för att testa GBP på icke-målorganismer. Först samplas och analyseras växtassocierade mikrober från 10 replikerade kontroll- och GBP-behandlingsplottar som simulerar beskärning utan jordbearbetning. I det andra experimentet erhölls prover från experimentella tomter befruktade av antingen fjäderfägödsel innehållande glyfosatrester eller icke-behandlad kontrollgödsel. Bioinformatikanalys av EPSPS-proteinsekvenser används för att bestämma mikrobernas potentiella känslighet för glyfosat. Det första steget i att uppskatta effekten av GBP på mikrobiom är att bestämma deras potentiella känslighet för målenzymet (EPSPS). Mikrobiella sekvenser kan erhållas antingen från offentliga förvar eller med hjälp av PCR-förstärkning. I de flesta fältstudier har emellertid mikrobiomkompositionen bestämts baserat på universella DNA-markörer såsom 16S rRNA och den interna transkriberade distansen (ITS). I dessa fall kan känsligheten för glyfosat endast uppskattas genom en probabilistisk analys av EPSPS-sekvenser med användning av närsläktade arter. Kvantifieringen av organismernas potentiella känslighet för glyfosat, baserat på EPSPS-enzymet, ger en robust metod för ytterligare experiment för att studera mål- och icke-målresistenta mekanismer.
Den stora användningen av bekämpningsmedel i det moderna jordbruket är helt klart en viktig bidragande orsak till minskningen av den biologiska mångfalden1. Detta dokument fokuserar på glyfosat eftersom glyfosatbaserade produkter (GBP) har blivit de mest använda bekämpningsmedlen globalt på grund av deras effektivitet och överkomliga pris 2,3. Förutom att döda ogräs i jordbruksfält används GBP ofta i skogsskötsel, stadsmiljöer och hemträdgårdar; Dessutom har de proklamerats som giftfria för icke-målorganismer om de används i enlighet med tillverkarens anvisningar. Ett ökande antal nyligen genomförda studier har dock visat att rester av glyfosat och dess nedbrytningsprodukter kan behållas och transporteras i marken och därmed ha kaskadeffekter på icke-målorganismer 4,5,6,7,8 . Effekterna av glyfosat är inte bara begränsade till växter – shikimatvägen är också närvarande i många svampar och prokaryoter. Glyfosat riktar sig mot enzymet 5-enolpyruvylshikimat-3-fosfatsyntas (EPSPS) i shikimatvägen, även känd som aroA9. Detta enzym är i mitten av shikimatvägen i syntesen av de tre essentiella aromatiska aminosyrorna (fenylalanin, tyrosin och tryptofan), och det finns i de flesta prokaryoter, växter och svampar10,11. Vissa mikrobiella arter har utvecklat partiell eller absolut resistens mot glyfosat med hjälp av flera mekanismer, inklusive mutationer i EPSPS-sekvenserna. Således har det föreslagits att användningen av GBP kan ha en direkt effekt på växt- och djurmikrobiom, inklusive människans tarmmikrobiom 12,13,14. Användningen av GBP kan dock ha en negativ inverkan på praktiskt taget alla ekosystem funktioner och tjänster som är beroende av mikrober och mikrob-underlättade processer. De därav följande hoten kan gälla biokemiska markprocesser, pollineringsbiologi och djurs och människors välbefinnande. Detta kräver en mer omfattande förståelse för hur glyfosat påverkar shikimatvägar och metoder för att bedöma mikrobernas känslighet för glyfosat.
I detta protokoll presenterar vi en pipeline för att testa effekten av glyfosat och GBP på mikrobiomet, från fältförsök till bioinformatikanalyser. Vi beskriver i detalj en nyligen publicerad bioinformatikmetod som kan användas för att bestämma organismernas potentiella känslighet för glyfosat12. Såvitt forskarna vet är detta det första och hittills enda bioinformatikverktyget för att bedöma enzymet EPSPS inneboende känslighet för den aktiva komponenten i GBP. Denna bioinformatikmetod är baserad på detektion av kända aminosyramarkörer i glyfosatmålenzymet (EPSPS)12. Rörledningen är uppdelad i fem huvudsakliga arbetsfaser (figur 1): 1) en kort introduktion till två fältexperiment för att testa effekten av GBP, 2) en kort sammanfattning av mikrobiomanalyser (16S rRNA, ITS och EPSPS-gen ), 3) insamling av EPSPS-sekvenser från offentliga förvar, 4) bestämning av organismernas potentiella känslighet för glyfosat och 5) bedömning av EPSPS-klassen från universella mikrobiella markörer (16S rRNA och ITS).
Detta protokoll ger allmän vägledning om hur man kvantifierar effekten av GBP på mikrobiom baserat på analysen av EPSPS-proteinet. Protokollet har tre viktiga kritiska steg: (i) Kvantifiering av EPSPS-proteinet från mikrobiomdata. Detta steg är kritiskt eftersom EPSPS är herbicidens direkta målenzym. Således kan arter som har en kopia av EPSPS-genen påverkas av användningen av GBP. Icke desto mindre kan även arter som saknar en kopia av EPSPS-genen påverkas av herbiciden genom alternativa icke-målmekanismer43,44. (ii) Om analysen av EPSPS-genen inte ingår i utformningen av studien är det möjligt att få en bra uppskattning genom att analysera 16S rRNA (bakterier) eller ITS (svampar). I detta fall är det viktigt att förlita sig på en omfattande referenstabell (t.ex. tillhandahåller ATGC-databasen sekvenser av EPSPS-proteinet från flera när besläktade arter). iii) EPSPS-proteinet är uppdelat i potentiellt känsligt eller resistent mot glyfosat beroende på vissa aminosyrarester från EPSPS aktiva stället. Mutationer som påverkar en enda aminosyra kan dock förändra denna klassificering45 och övergångar mellan klasser kan ske under en relativt kort tidsperiod14.
Organismernas potentiella känslighet för glyfosat kan bestämmas genom referensgenom, aminosyramarkörer och sekvensjusteringar. i) Referensgenom: EPSPS-enzymet kan klassificeras som potentiellt känsligt (klass I [alfa eller beta]46,47) eller resistent (klasserna II48,49, III50 och IV51) mot glyfosat baserat på förekomsten av aminosyramarkörer och motiv (i fråga om klass III). Dessa aminosyramarkörer och motiv är baserade på placeringen av aminosyrarester i EPSPS-proteinet i Vibrio cholerae (vcEPSPS, klass I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klass II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klass III) och Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klass IV). ii) Aminosyramarkörer: Glyfosat interagerar med EPSPS-enzymet och konkurrerar med fosfoenolpyruvat (PEP, det andra substratet för EPSPS-enzymet)52,53. Hos vissa arter ger små aminosyraförändringar i EPSPS-sekvensen en högre affinitet för PEP och en resistens mot glyfosat 12,14,52,54,55. I andra sekvenser binder glyfosat EPSPS-sekvensen i en icke-hämmande konformation 45. Även om många resistenta 12,14,48,49,52,54,55 och toleranta 56,57 EPSP-sekvenser mot glyfosat har beskrivits, är det nuvarande klassificeringssystemet för EPSPS indelat i fyra huvudklasser (I-IV)12 (tabell 5 ). iii) Sekvensjusteringar: För att klassificera ett EPSPS-enzym utförde vi parvisa justeringar, med ett multipelt sekvensjusteringsprogram-standardparametrar35-, av frågesekvensen mot var och en av referenssekvenserna (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS och sdEPSPS). Dessa justeringar är nödvändiga för att identifiera positionerna för aminosyramarkörerna i frågesekvensen. Som ett resultat klassificeras ett enzym enligt beskrivningen12-klass I, II och / eller IV baserat på närvaron av aminosyramarkörer och klass III-baserade motivmarkörer.
Protokollet är baserat på fyra kända typer av EPSPS: en typ är känslig, de andra tre är resistenta). Cirka 10 % av EPSPS-sekvenserna i prokaryoter är dock ännu oklassificerade (16 % i arkéer och 8 % i bakterier)12. Således bör ytterligare forskning analysera dessa sekvenser för att bestämma glyfosatkänslighet. EPSPSClass-servern ger möjlighet att testa nya genetiska markörer. Identifieringen av kända klasser i EPSPS är enkel, såsom visas i avsnitt 4.4. och figur 5. I de fall där användarna vill jämföra sina egna fråge- och referensproteiner ger servern dessutom möjlighet att manuellt inkludera en referenssekvens och en uppsättning aminosyramarkörer (figur 11). Detta alternativ kan användas för att identifiera nya klasser av EPSPS, samt för att testa andra herbicider och målsekvenser.
Analysen av EPSPS-klassen bestäms genom sekvensanalys och närvaron/frånvaron av aminosyramarkörer. Detta är en preliminär uppskattning som kan användas för hypotesprövning inom området. Aminosyramarkörer har bestämts i litteraturen baserat på empiriska och observationsstudier 46,47,48,49,50,51. Referensproteinsekvenser för att bestämma EPSPS-klass har dock endast testats på ett begränsat antal arter och kan ibland misslyckas med att förklara resistens mot glyfosat. Effekten av kompensationsmutationer och EPSPS-associerade domäner (främst i svampar) kan också påverka känsligheten för glyfosat58. Denna uppsatss analys är baserad på fyra EPSPS-klasser. En undersökning av bakterier i människans tarmmikrobiom visade att cirka 30% av dem var oklassificerade (dvs. EPSPS-proteiner från dessa arter tillhör inte någon av de kända klasserna), och ytterligare studier behövs för att identifiera andra EPSPS-klasser. Det bör också noteras att EPSPS-proteinsekvensen i bakterier och växter är oföregen, medan svamp-EPSPS-proteiner innehåller flera domäner59. Således kan ett proteinveck i svampar leda till ett annat svar från EPSPS-enzymet på glyfosat. Dessutom beaktas inte ytterligare icke-målbaserade resistensmekanismer (t.ex. effluxpumpar och överuttryck av EPSPS-genen 13) eller känslighet för glyfosat (t.ex. effekten av glyfosat på mitokondriell transportkedja12).
Även om GBP har funnits som herbicid sedan 1974 och har använts i stor utsträckning sedan 1991, är detta den första bioinformatikmetoden för att bestämma organismernas potentiella känslighet för glyfosat. Metoden är baserad på identifiering av kända aminosyrarester i målsekvensen. Således ger vår metod en baslinjeuppskattning av den potentiella effekten av glyfosat på arten. Inom en snar framtid bör nya bioinformatikmetoder omfatta ytterligare klasser av EPSPS-proteinet för att bestämma den potentiella känsligheten för glyfosat av oklassificerade sekvenser 12,54,55. Dessutom, med tanke på att epsps-enzymets exakta beteende kan variera med enstaka aminosyraförändringar 12,14,52,54,55, bör vidare i silikoexperiment ta hänsyn till små variationer i vikningen av EPSPS-proteinet, liksom effekten av EPSPS-associerade domäner på proteinstrukturen i svampar58 . Dessutom har det visats att tolerans mot glyfosat kan framställas genom överuttryck av EPSPS-proteinet56,57; Således kan bioinformatikanalyser baserade på förbättringen av kodonanvändningen60 användas för att identifiera nya EPSPS-sekvenser som maximerar eller minimerar genuttryck.
Jordbrukare, politiker och beslutsfattare behöver snarast en grundlig förståelse för riskerna med den stora användningen av bekämpningsmedel. Således är både bioinformatiska verktyg som avslöjar organismernas potentiella känslighet för bekämpningsmedel och väl replikerade, randomiserade och fältrealistiska experimentella studier utförda i olika miljöer nödvändiga. Den presenterade bioinformatiska metoden som är utformad för att undersöka organismers känslighet för glyfosat kan moduleras för andra bekämpningsmedel. På samma sätt kan metoderna för experimentell ekologi tillämpas för att studera alla relaterade ekologiska frågor. Tillsammans kan metoderna användas för att påvisa olyckor mellan fältobservationer, genomdata och användning av bekämpningsmedel. Alla presenterade metoder är ovärderliga vid riskbedömning. Bioinformatiska metoder kan till exempel användas för att övervaka mikrobiella anpassningar till jordbrukskemikalier och för att tillhandahålla en kvantitativ metod för att testa potentiella andra därmed sammanhängande risker, såsom en ökning av patogenernas resistens mot jordbrukskemikalier, negativa effekter på mikrober som används som biologiska kontrollmedel i integrerat växtskydd (IPM) och antibiotikaresistens hos bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Finlands Akademi (anslag nr 311077 till Marjo Helander).
2100 Bioanalyzer Instrument | INVITEK Molecular | 1037100300 | Genomic DNA extraction from plant tissues |
dNTP mix (10 mM each) | BIO-RAD | 1852196 | For PCR reactions |
GoTaq G2 DNA Polymerase kit | Promega | M7848 | PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification |
Invisorb Spin Plant Mini Kit | Agilent | G2939B | To check the concentration and quality of PCR products |
Ion Chip Minifuge | sage science | PIP0001 | For size fractionation of PCR amplicons |
Ion PGM System | ThermoFisher Scientific | 4462921 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Ion PGM Torrent Server | ThermoFisher Scientific | 4483643 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pippinprep | ThermoFisher Scientific | 4479672 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pressure tank | Berthoud | 102140 | For sprayin glyphosate based products in field |
Primers | ThermoFisher Scientific | R0192 | For PCR amplification |
Rotary tiller | Grillo | 984511 | For tilling the soil in experimental plots |
S1000 ThermalCycler | Sigma-Aldrich | Custom-made | For PCR amplification |