Nær-UV litografi og trækkraft mikroskopi kombineres for at måle cellulære kræfter på mikropatterned hydrogels. Den målrettede lysinducerede frigivelse af enkelte celler muliggør et stort antal målinger på den samme prøve.
Traction force mikroskopi (TFM) er den vigtigste metode, der anvendes i mekanobiologi til at måle cellekræfter. Almindeligvis bruges dette til celler, der klæber til flade bløde substrater, der deformerer under cellegreb (2D-TFM). TFM er afhængig af brugen af lineære elastiske materialer, såsom polydimethylsiloxan (PDMS) eller polyacrylamid (PA). For 2D-TFM på PA skyldes vanskeligheden ved at opnå høj gennemløb hovedsagelig den store variation af celleformer og trækkraft, der kræver standardisering. Vi præsenterer en protokol til hurtigt og effektivt at fremstille mikropatterned PA hydrogels til 2D-TFM-undersøgelser. Mikropatternerne er først skabt af maskeløs fotolitografi ved hjælp af nær-UV-lys, hvor ekstracellulære matrixproteiner kun binder sig til de mikropatterned regioner, mens resten af overfladen forbliver ikke-klæbende til celler. Mikropattering af ekstracellulære matrixproteiner skyldes tilstedeværelsen af aktive aldehydgrupper, hvilket resulterer i klæbende regioner af forskellige former for at imødekomme enten enkelte celler eller grupper af celler. Til TFM-målinger bruger vi PA hydrogels af forskellig elasticitet ved at variere mængden af acrylamid og bis-acrylamid og spore forskydningen af indlejrede fluorescerende perler til at rekonstruere celle trækkraftfelter med legaliseret Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
For yderligere at opnå præcis registrering af cellekræfter beskriver vi brugen af en kontrolleret dosis mønstret lys for at frigive cellegreb i definerede områder for enkelte celler eller grupper af celler. Vi kalder denne metode lokal UV-belysning trækkraft mikroskopi (LUVI-TFM). Ved enzymatisk behandling afmonteres alle celler fra prøven samtidigt, mens der med LUVI-TFM trækkraft af celler i forskellige områder af prøven kan registreres i rækkefølge. Vi demonstrerer anvendeligheden af denne protokol (i) at studere celle trækkraft kræfter som en funktion af kontrolleret vedhæftning til substratet, og (ii) for at opnå et større antal eksperimentelle observationer fra samme prøve.
Når de interagerer med deres ekstracellulære miljø, udøver klæbende celler kræfter, der hovedsageligt medieres af integrinbaserede fokale vedhæftninger, der forbinder den ekstracellulære matrix (ECM) med actin cytoskeleton. Focal vedhæftninger er multiprotein samlinger, der er centreret omkring bindingen af integriner til ECM-proteiner som fibronectin og kollagen. Integrin clustering og vækst af fokale vedhæftninger er afgørende ikke kun for etableringen af en mekanisk stabil forbindelse, men også for rekruttering af andre fokale vedhæftning proteiner, herunder dem, der aktiverer RhoA vej til regulering af cellulære sammentrækning1. Den RhoA-afhængige kontraktilitet af actin cytoskeleton gør det muligt for celler at sprede sig og migrere på den underliggende ECM, og også at fornemme dens stivhed2. Fordelingen af trækkraften afhænger i høj grad af cellernes spredningsområde og form, som begge er afhængige af matrixegenskaber og derfor påvirker cytoskeletal organisation og til sidst danner en lukket feedback loop mellem matrixmekanik og cytoskeletal organisation3,4.
Overflademikrotteringsteknikker giver mulighed for en defineret kontrol af celleformen ved at skabe mikronstore områder, der præsenterer ECM-klæbeproteiner; i henhold til størrelsen af disse områder, enkelte celler eller grupper af celler, der klæber til mikropattern5. ECM proteiner kan mønstres på glas substrater ved forskellige tilgange såsom mikrokontakt udskrivning, foto-mønstre eller laser-mønstre6. Brugen af UV-lys (λ = 185 eller 375 nm) kombineret med overflade antifouling strategier giver fleksibilitet til at designe forskellige former og størrelser og immobilisering af flere proteintyper med en høj præcision nær overfladekanter7,8. De regioner, der er belagt med proteinafvisende kemikalier såsom polyethylenglycol (PEG), er beskyttet med enten en kromfotomaske eller en digital spejlenhed (DMD)-baseret maskefrit litografisystem. Mønstrene i maskerne gør det muligt at blive udsat for UV-lys i regioner, der derefter vil blive mønstret med ECM-proteiner. Mønstret af hydrogeloverflader med ECM-proteiner kræver et overførselstrin for at fjerne proteiner fra glasoverfladen og krydse dem til mønstrene. Alternativt kan mønstre på bløde materialer opnås ved først at overfladebehandling af fotomasken med et afstødende protein, efterfulgt af at brænde de umaskerede områder ved hjælp af dyb UV-belysning. Da dyb UV genererer ozon og gør overfladen reaktiv for proteinbinding, er de umaskerede områder belagt med ECM-proteiner, og endelig polymeriseres gelen direkte oven på de umaskerede regioner9,10.
De mønstrede hydrogeler kan bruges til at udføre TFM, en teknik, der måler cellekræfter ved cellematerialegrænsefladen11. I 2D-TFM bruger man den flade overflade af en tyk polymerfilm, hvor markørperler er blevet indlejret til at spore deformationer12,13,14,15. For at udtrække forskydningsvektorer er det vigtigt at kombinere to billeder, et af deforme tilstand og et referencebillede uden deformationer. De to billeder er derefter knyttet til hinanden med billedbehandling. Ved høj markørtæthed sker dette normalt med Particle Image Velocimetry (PIV), som er en veletableret metode til at rekonstruere hydrodynamisk flow. Ved lav markørtæthed og i 3D-TFM sker dette normalt med Partikelsporing Velocimetri (PTV), som indeholder specifikke funktioner i det eksperimentelle datasæt. Et eksempel på et beregningsmæssigt billigere alternativ er optisk flow, såsom Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritme16. I tilfælde af hydrogel substrater er fluorescerende perler normalt indlejret ved høj densitet under materialet polymerisering, og billeder registreres før og efter celle frigivelse ved enzymatisk løsrivelse. Enzymatisk løsrivelse af klæbende celler, f.eks. ved trypsinisering, fører til samtidig frigivelse af cellulære trækkraft fra alle celler på hydrogelerne, hvilket gør det vanskeligt at opnå en detaljeret analyse fra et stort antal celler.
Her præsenterer vi en protokol til at forberede mikropatterned hydrogels til at styre celleform og lokalisering og en metode til effektivt at måle trækkraftkræfter i rækkefølge ved hjælp af UV til at frigøre individuelle celler fra substratet. Til trækkraftmålinger præsenterer vi en teknik til at producere tolags PA hydrogels, hvor fluorescerende perler kun er indlejret i det øverste lag, hvilket øger deres tæthed og reducerer deres lodrette spredning. Ved at kombinere UV-medieret frigivelse af cellulære trækkraftkræfter med mikromaling gør det muligt at opnå rumlig kontrol over celleløsning (f.eks. af enkelte celler uden at påvirke vedhæftningen af andre celler i interesseområdet), forudsat at der er tilstrækkelig afstand mellem mønstrede celler. Cellulær trækkraft rekonstrueres derefter ved hjælp af den mest effektive og pålidelige metode til 2D-TFM, nemlig Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) med legalisering17,18.
I denne protokol beskriver vi forberedelsen af mikropatterned PA hydrogeler, der indeholder fluorescerende perler, der bruges som fiducial markører til TFM-undersøgelser. Vores tilgang er baseret på tre trin: 1) forberedelse af dual-layered PA hydrogels; 2) mikropattering af ECM-proteiner og deres overførsel til hydrogeloverfladen 3) brug af mønstret nær-UV-lys til TFM. Den eksperimentelle opsætning til at analysere cellegreb til substratet kræver brug af lineære elastiske materialer med kendte stivhedsværdier til at beregne de kræfter, der er relateret til forskydning af de fluorescerende perler26. PA hydrogels er nemme at forberede, stivheden kan let indstilles, og de er almindeligt anvendt til stivhed sensing og TFM18,28. For at opnå reproducerbare polymeriseringstider og homogen polymerisering af hele hydrogelen bør der dog lægges vægt på opbevaring af betingelser og tid for reagenserne, f.eks. TEMED skal beskyttes mod direkte lys. Brugen af oxideret HEA muliggør kovalent binding af matrixproteiner på hydrogeloverfladen, hvilket kan være fordelagtigt at opnå dannelsen af et fuldt og stabilt proteinlag. Den oxiderede HEA-opløsning skal fremstilles frisk, hver gang PA hydrogels fremstilles. Den tolags PA hydrogel tilbyder tre hovedfordele: 1) det giver en alternativ måde at reproducerucibly få en homogen fordeling af fiducial perler nær hydrogel overflade, uden behov for at gøre gelen ekstremt tynd (dvs. <20 μm). Kontrol over hydrogel tykkelse er afgørende for at opnå nøjagtige målinger med TFM. Når det elastiske substrat er for tyndt, kan stærke klæbende celler som fibroblaster fornemme og mekanisk reagere på det underliggende stive glassubstrat29,30. Tykke hydrogels gør billedopsamlingen til kraftrekonstruktionen mere udfordrende. Desuden vil mange mikroskoper ikke have tilstrækkelig plads til at rumme dem, i betragtning af den ekstra tykkelse af glassubstratet, der anvendes til at fastgøre hydrogel, medmindre ultratynde mikroskopi dias anvendes. 2) I den dobbelte LAG PA hydrogel opnås den homogene fordeling af fiducial perler nær overfladen af PA hydrogel uden at bruge en centrifuge, men snarere med en simpel inkubation af præcise mængder hydrogelopløsninger og fluorescerende perler. Høj perletæthed er af væsentlig fordel ved udførelse af PIV-analysen, fordi den øger trækkraftkræfternes opløsning og signal-til-støj-forholdet uden behov for konfokal mikroskopi. 3) Confining perler i et tyndt lag tæt på celle-materiale interface muliggør billeddannelse af trækkraft kræfter med epifluorescence mikroskoper samt confocal mikroskoper. Ved tilberedning af hydrogelen skal brugeren sørge for, at den klæber fast til det nederste glas, før den fortsætter med de efterfølgende trin i protokollen. Vi anbefaler at følge inkubationstiden angivet for polymerisering af hydrogellagene, da det kan være svært at fjerne glasset oven på overfladen uden at beskadige hydrogeloverfladen.
De mest kendte teknikker til at måle elastiske egenskaber er AFM, nanoindentation, trækprøver og rheometri. Nanoindentation fremkalder imidlertid meget høje belastninger på de materialer, der kan påvirke bestemmelse af elastiske egenskaber. Trækprøver og rheometri er derimod makroskopiske måleteknikker, mens celler interagerer på en mikroskopisk skala31,32. AFM tillader målinger på mikroskala med reducerede stammer under fysiologiske forhold. Pålideligheden af AFM-målinger kan påvirkes negativt, hvis der mangler eksperimentelle detaljer (f.eks. indrykningskraft og hastighed), eller hvis der registreres utilstrækkelige data27. Huth et al. beskriver en algoritme til at udtrække Youngs moduli fra AFM-data, som lægger vægt på at holde måledetaljer konstant27. Denne algoritme tilbyder en præcis og pålidelig bestemmelse af Youngs moduli og blev brugt til vores eksperimenter. Derudover målte vi mange kurver på prøver fremstillet på forskellige dage og opnåede meget lignende resultater (variation af gennemsnitsværdier på ca. 1-2 kPa). Dette viser, at stivheden af vores geler pålideligt kan forudsiges.
I denne protokol bruger vi et fotopatterningsmodul til at skabe mikropatterned regioner på glas, som derefter overføres til hydrogeloverfladerne. Den mikropatterning, der er vist i denne protokol, er baseret på DMD (digital mikrospejlsenhed)-baseret maskeløs nær-UV-litografi (λ = 375 nm)7. En DMD består af et stort antal mikromirrorer på en chip. En enkelt pixel svarer til et enkelt mikrospejl. Den pixelerede mønsterbilledfil fra en computer projiceres gennem DMD og fokuseres på overfladen ved hjælp af en objektiv linse. Til mikromaling af proteiner bruges det fokuserede laserlys til at kløve afstødende polymerbørster ved hjælp af en fotoinitiator. Derefter fyldes de udsatte regioner med ECM-proteiner. Denne maskeløse ablationsmetode giver stor fleksibilitet i udformningen af nye mønstre, da den ikke er afhængig af brugen af en fotomaske. Design og anvendelse af et mønster er meget nemt, da det kun tager flere minutter ved hjælp af en freeware som Inkscape. Antallet af mønstre og prøver, der produceres på kort tid, er imidlertid en stor ulempe, da denne metode kun kan bruges til at mønstre et enkelt substrat hver gang. Fotopatterning modulet bruger en nær UV solid-state laser kilde, der udsender flere milliwatt. Den uskærmede laserstråle er farlig for øjne og hud. Reflekteret og spredt lys og stråling kan også være farligt. Håndteringen skal ledsages af en sikkerhedsinstruks fra laserofficerer. Det mest kritiske trin i protokollen, når du bruger et fotobemalingsmodul, er at sikre, at laseren under mikropatterning og ablation er korrekt fokuseret på overfladen. En ensartet belysningsdosis (intensitet ganget med tiden) af UV-lys under mønstre er afhængig af, hvordan laseren er fokuseret på overfladen. En svag intensitet på overfladen på grund af dårligt fokus kan resultere i svigt af ECM overførsel til hydrogel overflade resulterer i ingen celler bliver knyttet til hydrogel.
I TFM eksperimenter, efter den første billeddannelse af klæbende celler og fiducial markører, celler frigives fra PA hydrogel ved trypsin behandling for at registrere deres afslappede tilstand. En ulempe ved at udføre dette trin er håndtering af prøven på mikroskopistadiet. Uden et perfusionskammer udgør åbning af skålens låg, aspirerer medium, skylning og pipetter trypsinopløsning en udfordring for begyndere og erfarne brugere. Faktisk er disse procedurer en vigtig kilde til afdrift i xyz akser, hvilket resulterer i tab af position og fokus. Vores lokale UV-belysningsprotokol gør TFM til en mere tilgængelig teknik for begyndere. Det skal bemærkes, at vi brugte et kommercielt tilgængeligt mikroskopibaseret fotomalingsmodul, men i princippet kunne ethvert UV-A-belysningssystem anvendes, i sidste ende i kombination med en maske for at beskytte områder af substraterne, hvor celletrækkræfter ikke bør registreres. At udsætte celler med en betydelig dosis af lavt bølgelængde synligt lys (f.eks. det violette lys, der ophidser DAPI-emissionen), vil føre til stigende oxidativ stress, hvilket kan resultere i fototoksicitet og celledød. Derfor kan denne teknik anvendes selv i et epifluorescencemikroskop uden et UV-lasermodul. Men da intensiteten er meget svagere, vil det være meget lettere at opnå TFM med den enzymatiske behandling i dette tilfælde.
Med LUVI-TFM er det muligt at anvende den samme prøve til flere målinger på grund af den lokale løsrivelse af enkelte celler eller små grupper af celler. Der bør dog lægges vægt på udvælgelsen af celler til at løsne, for at undgå at registrere kræfter fra tilstødende celler. For enkeltcellemålinger i mangel af mikropatterner bør overfyldte regioner således undgås; til målinger på enkelte mikropatterned celler skal mønstrene udformes således, at afstanden mellem enkelte strukturer er mindst dobbelt så stor som diameteren af det mønstrede område. Vi anbefaler også ikke at bruge celler fra tilstødende mønstre i rækkefølge, men snarere prøveudtagning dem fra fjerne områder på substratet. Vores måling er godt udført på et epifluorescencemikroskop udstyret med en fokuskontrolfunktion og en 40 x luft NA = 0,9 linse, hvor linsens arbejdsafstand er tilstrækkelig lang, og den hurtige bevægelse fra den ene brønd til den anden er meget tunabel. Den målrettede løsrivelse af celler til TFM-applikationer er effektiv til måling af cellulær kraft af en enkelt celle eller af en hel lille celleklynge (f.eks. op til 300 μm i diameter). Ved hjælp af vores opsætning observerede vi celleafrunding og løsrivelse til UV-behandling af enkeltceller (Figur 3A), mens løsrivelse sjældent forekom for små celleklynger. Dette kan føre til en undervurdering af celle trækkraft kræfter. For større celleklynger anbefales enzymatisk løsrivelse, da brugerne skal bruge et 20x luftmål til at afbilde hele klyngen, og der er behov for en fokusstyringsfunktion. Da dybden af fokus for 20x luftlinsen er meget længere, vil håndteringen ikke være så kritisk som den højere forstørrelse mål. Brugeren bør sikre, at fokus er korrekt indstillet til ablation af celler, da belysningsdosis er afhængig af laserfokus på overfladen. Mens vi er opmærksomme på de mulige begrænsninger i brugen af LUVI-TFM i cellekollektiver på grund af mulige mekaniske interaktioner med tilstødende ubehandlede celler, kan dette aspekt faktisk vise sig at være nyttigt til undersøgelser af mekanikken i målrettet celleekstrudering, f.eks. fra epitelmonomer.
Afslutningsvis, med vores TFM-tilgang kombineret med let induceret frigivelse af mikropatterned celler, giver vi en robust og højgennemsigtsprotokol til måling af celle vedhæftningskræfter. Alsidigheden af denne metode kunne udnyttes yderligere ved hjælp af mikroskopi og billeddannelse setup med henblik på at forbedre opløsning og følsomhed.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Fru Rebecca Alvarado for støtten i protokollen video produktion og Mr. Stephen Casale for konstruktiv kritik af manuskriptet. Vi takker kollegerne fra Institut for Cellulær Biofysik, Max Planck Institute for Medical Research for de nyttige diskussioner. Den finansielle støtte fra Max-Planck-Gesellschaft til E.A.C.-A. og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 til E.A.C.-A. og P4 til USA; DFG EXC 2082/1-390761711 til USA) er også meget anerkendt. J.B. takker Carl Zeiss Foundation for økonomisk støtte. E.A.C.-A., C.S. og USA anerkender finansiering gennem Max Planck School Matter to Life støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF). C.S. støttes af Det Europæiske Forskningsråd (Consolidator Grant PHOTOMECH, nr. 101001797).
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
UV Pattening module | #PRIMO | Alveole | |
UVO cleaner | #342-220 | Jelight |