Establecimiento de un modelo de fractura de fémur diafisario en ratones
Summary
Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para el establecimiento de una fractura diafisaria en el fémur de ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular, para estudios de cicatrización de fracturas.
Abstract
Los huesos tienen una importante capacidad regenerativa. Sin embargo, la cicatrización de la fractura es un proceso complejo y, dependiendo de la gravedad de las lesiones y de la edad y el estado de salud general del paciente, pueden producirse fallas, lo que lleva a un retraso en la unión o a la falta de unión. Debido al creciente número de fracturas resultantes de traumatismos de alta energía y envejecimiento, se necesita urgentemente el desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras para mejorar la reparación ósea basadas en la combinación de células madre esqueléticas/mesenquimales/estromales y biomateriales biomiméticos. Con este fin, el uso de modelos animales fiables es fundamental para comprender mejor los mecanismos celulares y moleculares clave que determinan los resultados de curación. De todos los modelos, el ratón es el modelo de investigación preferido porque ofrece una amplia variedad de cepas transgénicas y reactivos para el análisis experimental. Sin embargo, el establecimiento de fracturas en ratones puede ser técnicamente difícil debido a su pequeño tamaño. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo demostrar los procedimientos para el establecimiento quirúrgico de una fractura de fémur diafisario en ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular y se asemeja al proceso de reparación ósea más común, a través de la formación de callos cartilaginosos.
Introduction
El esqueleto es un órgano vital y funcionalmente versátil. Los huesos del esqueleto permiten la postura y el movimiento del cuerpo, protegen los órganos internos, producen hormonas que integran las respuestas fisiológicas y son el sitio de hematopoyesis y almacenamiento de minerales1. Si se fracturan, los huesos tienen una notable capacidad para regenerarse y restaurar completamente su forma y función previas a la lesión. El proceso de cicatrización comienza con la formación de un hematoma y una respuesta inflamatoria, que induce la activación y condensación de las células madre/progenitoras esqueléticas del periostio, el endosteo y la médula ósea y su posterior diferenciación para formar el callo cartilaginoso blando. El puente de los extremos fracturados se produce a través de un proceso que se asemeja a la formación de hueso endocondral, en el que el andamio cartilaginoso se expande y luego se mineraliza, formando el callo óseo duro. Finalmente, el callo duro es remodelado gradualmente por osteoclastos y osteoblastos para restaurar la estructura ósea original 2,3.
Aunque el proceso de curación de la fractura es bastante robusto, implica una suma intrincada de eventos y está significativamente influenciado por varios factores individuales, incluido el estado de salud general, la edad y el sexo del paciente, así como factores de lesión, como el modo de estabilización mecánica del hueso fracturado, la aparición de infección y la gravedad de la lesión de los tejidos blandoscircundantes. 5,6. Por lo tanto, los fracasos son comunes, lo que lleva al desarrollo de pseudoartrosis, lo que impacta en gran medida en la rehabilitación del paciente y en la calidad de vida 7,8. Debido al creciente número de fracturas como resultado de traumatismos de alta energía y envejecimiento, así como a los altos costos de los tratamientos, las fracturas pseudoartrosas se han convertido en una carga para los sistemas de salud de todo el mundo 9,10. Esta carga creciente pone de manifiesto la necesidad urgente de estrategias terapéuticas innovadoras para mejorar la reparación ósea11,12 basadas en la combinación de células madre esqueléticas/mesenquimales y biomateriales biomiméticos 13,14.
En la búsqueda de este objetivo, los modelos animales han sido ampliamente utilizados en estudios que tienen como objetivo comprender la biología fundamental de los mecanismos de cicatrización de fracturas y en estudios preclínicos de prueba de concepto con el objetivo de diseñar nuevas estrategias terapéuticas para promover la reparación ósea 15,16,17. Los modelos de animales pequeños, como el ratón, son excelentes para los estudios de cicatrización de fracturas debido a la amplia disponibilidad de cepas y reactivos modificados genéticamente para análisis experimentales y sus bajos costos de mantenimiento. Además, los ratones tienen un curso de tiempo de curación rápido, lo que permite el análisis temporal de todas las etapas del proceso de reparación15. Sin embargo, el pequeño tamaño del animal puede plantear desafíos para la producción quirúrgica de fracturas con modos de fijación similares a los aplicados en humanos. Este protocolo describe un modelo simple y de bajo costo de cicatrización de fracturas en ratones utilizando una osteotomía femoral abierta estabilizada con un alambre intramedular, que se asemeja al proceso de reparación ósea más común, a través de la formación de callos cartilaginosos, y puede ser utilizado tanto en investigaciones básicas como traslacionales en las que se requiere acceso al sitio de la fractura.
Protocol
Representative Results
Discussion
A medida que aumenta el número de fracturas en todo el mundo 9,10,25, los tratamientos innovadores para la pseudoartrosis son cada vez más urgentes. Dado que la cicatrización de fracturas implica una suma compleja y estrechamente orquestada de eventos que ocurren a lo largo de una larga escala de tiempo3, el uso de modelos animales válidos es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los mecani…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Carlos Chagas Filho de Apoyo a la Investigación del Estado de Río de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
