Summary

ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להקמת שבר דיאפיזיאלי בעצם הירך של עכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי, לצורך מחקרי ריפוי שברים.

Abstract

לעצמות יש יכולת התחדשות משמעותית. עם זאת, ריפוי שברים הוא תהליך מורכב, ובהתאם לחומרת הנגעים ולגיל ולמצב הבריאותי הכללי של המטופל, עלולים להתרחש כשלים, המובילים לאיחוד מאוחר או לאי-איחוד. בשל המספר ההולך וגדל של שברים הנובעים מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, יש צורך דחוף בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים. לשם כך, השימוש במודלים אמינים של בעלי חיים הוא חיוני להבנה טובה יותר של המנגנונים התאיים והמולקולריים העיקריים הקובעים את תוצאות הריפוי. מכל הדגמים, העכבר הוא מודל המחקר המועדף מכיוון שהוא מציע מגוון רחב של זנים וריאגנטים טרנסגניים לניתוח ניסיוני. עם זאת, הקמת שברים בעכברים עשויה להיות מאתגרת מבחינה טכנית בשל גודלם הקטן. לכן, מאמר זה נועד להדגים את ההליכים להקמה כירורגית של שבר עצם הירך הדיאפיזיאלי בעכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי ודומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות.

Introduction

השלד הוא איבר חיוני ורב-תכליתי מבחינה תפקודית. עצמות השלד מאפשרות יציבה ותנועה של הגוף, מגינות על האיברים הפנימיים, מייצרות הורמונים המשלבים תגובות פיזיולוגיות, והן אתר של המטופויזה ואחסון מינרלים1. אם נשברים, לעצמות יש יכולת יוצאת דופן להתחדש ולשחזר באופן מלא את צורתן ותפקודן לפני הפציעה. תהליך הריפוי מתחיל בהיווצרות המטומה ותגובה דלקתית, הגורמת להפעלה ועיבוי של תאי גזע/אב שלדיים מהפריאוסטאום, האנדוסטאום ומח העצם והתמיינותם לאחר מכן ליצירת היבלת הסחוסית הרכה. הגישור בין הקצוות השבורים מתרחש בתהליך הדומה להיווצרות עצם אנדוכונדרלית, שבו הפיגום הסחוסי מתרחב ולאחר מכן עובר מינרליזציה, ויוצר את היבלת האוסאוסית הקשה. לבסוף, היבלת הקשה משופצת בהדרגה על ידי אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים כדי לשחזר את מבנה העצם המקורי 2,3.

למרות שתהליך ריפוי השבר הוא חזק למדי, הוא כרוך בסיכום מורכב של אירועים ומושפע באופן משמעותי ממספר גורמים בודדים, כולל מצבו הבריאותי הכללי, גילו ומינו של המטופל, כמו גם גורמי פציעה, כגון אופן הייצוב המכני של העצם השבורה, התרחשות הזיהום וחומרת הפגיעה ברקמות הרכות שמסביב4, 5,6. לכן, כשלים הם נפוצים, מה שמוביל להתפתחות של אי-איחוד, מה שמשפיע מאוד על שיקום המטופל ואיכות החיים שלו 7,8. בשל המספר ההולך וגדל של שברים כתוצאה מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, כמו גם העלויות הגבוהות של הטיפולים, שברים שאינם מאוגדים הפכו לנטל על מערכות הבריאות ברחבי העולם 9,10. עומס הולך וגובר זה מדגיש את הצורך הדחוף באסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם11,12 המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים13,14.

במטרה להשיג מטרה זו, נעשה שימוש נרחב במודלים של בעלי חיים במחקרים שמטרתם להבין את הביולוגיה הבסיסית של מנגנוני ריפוי שברים ובמחקרים פרה-קליניים להוכחת היתכנות שמטרתם לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לקידום תיקון עצם 15,16,17. מודלים של בעלי חיים קטנים, כמו העכבר, מצוינים למחקרי ריפוי שברים בגלל הזמינות הרחבה של זנים וריאגנטים מהונדסים גנטית לניתוחים ניסיוניים ועלויות התחזוקה הנמוכות שלהם. בנוסף, לעכברים יש מסלול זמן ריפוי מהיר, המאפשר ניתוח זמני של כל שלבי תהליך התיקון15. עם זאת, גודלו הקטן של בעל החיים יכול להציב אתגרים לייצור כירורגי של שברים עם מצבי קיבוע דומים לאלה המיושמים בבני אדם. פרוטוקול זה מתאר מודל פשוט וזול של ריפוי שברים בעכברים באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה של עצם הירך המיוצבת באמצעות חוט תוך מדולרי, הדומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות, וניתן להשתמש בו הן בחקירות בסיסיות והן בחקירות תרגומיות בהן נדרשת גישה לאתר השבר.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז’ניירו (פרוטוקול מספר 101/21). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי Balb/c זכרים בגיל 10-12 שבועות (25-30 גרם משקל גוף). ההליך הכירורגי אורך כ 15-20 דקות לכל עכבר. לפני כל הליך, המכשירים הנדרשים (המפורטי…

Representative Results

הדרך הפשוטה והמיידית ביותר להעריך את הצלחת ההליך הכירורגי בהפקת השבר היא הדמיית רנטגן. ניתן לבצע צילומי רנטגן מיד לאחר הניתוח, כאשר העכבר עדיין תחת הרדמה, ולאחר מכן 7 ימים, 14 ימים ו -21 ימים לאחר השבר כדי להעריך את היווצרות היבלות והתקדמותן. דפוסי שבר מקובלים הם אלה שבהם קליפת המוח נקרעת במלו?…

Discussion

ככל שמספר השברים גדל ברחבי העולם 9,10,25, טיפולים חדשניים לאי-איחוד הופכים דחופים יותר ויותר. מכיוון שריפוי שברים כרוך בסיכום מורכב ומתוזמר היטב של אירועים המתרחשים על פני סקאלת זמן ארוכה3, השימוש במודלים תקפים של בעלי חיים הוא ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי קרן קרלוס צ’אגס פיליו לתמיכה במחקר של מדינת ריו דה ז’ניירו (FAPERJ).

Materials

Alcohol 70º Merck 109-56-8 Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium) Merck C1795 Or any general available supplier
Cefazoline ABL Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip Merck CSL284525 Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator Focus Sold by Instrumentarium Dental Inc. 
DEPC water Merck W4502 Or any general available supplier
Dissecting Scissor ABC Instrumentos 0327 Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA Vetec 60REAVET014340 Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution Laborclin EA-65 Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A Vetec 60REAVET012053 Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads Cremer Not applicable Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution Laborclin 620503 Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad Tonkey Electrical Technology E114273 Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides Merck CSL294875X25 Or any general available supplier
Histology cassettes Merck H0542-1CS Or any general available supplier
Hydrochloric acid – 37% Merck 258148 Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe BD 324918 Or any general available supplier
Iodopovidone sponge Rioquímica 372106 Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride Ceva Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium Cristalia Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome Leica 149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer ABC Instrumentos 0164 Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G BD 2239 Or any general available supplier
Needle Holder  Golgran 135-18 Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 Atramat C1546-NT Or any general available supplier
Paraffin Exodo 8002 – 74 – 2 Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde Sigma 30525-89-4 Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x  Lonza  BE17-516F Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6 Atramat C1596-45B Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016" Orthometric 56.50.2016
Scalpel nº 11 Descarpak 15782 Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer Quinelato QC.404.12 Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver Phillips Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape 3M 2734 Or any general available supplier
Surgical tnt field Polarfix 6153 Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride Teuto  Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology Leica HI1210
Xylazine hydrochloride Ceva Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene Dinamica 60READIN001105 Similar brands of the item may be used according to local availability

References

  1. Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
  2. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
  3. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  4. Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
  5. Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
  6. Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
  7. Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
  8. Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
  9. Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
  10. Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
  11. Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
  12. Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
  13. Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
  14. Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
  15. Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
  16. Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
  17. Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
  18. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
  19. Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
  20. Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
  21. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  22. Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
  23. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  24. An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
  25. Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
  26. Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
  27. Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
  28. Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
  29. Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).

Play Video

Cite This Article
Braga Frade, B., Dias da Cunha Muller, L., Bonfim, D. C. Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice. J. Vis. Exp. (190), e64766, doi:10.3791/64766 (2022).

View Video