Denne protokollen demonstrerer enkeltmolekylære overflateforbedrede Raman-spredningsmålinger (SERS) ved hjelp av en DNA-origami nanoantenne (DONA) kombinert med kolokalisert atomkraftmikroskopi (AFM) og Raman-målinger.
Overflateforbedret Raman-spredning (SERS) har evnen til å oppdage enkeltmolekyler som krever høy feltforbedring. Enkeltmolekyl (SM) SERS er i stand til å gi molekylspesifikk spektroskopisk informasjon om individuelle molekyler og gir derfor mer detaljert kjemisk informasjon enn andre SM-deteksjonsteknikker. Samtidig er det potensial for å avdekke informasjon fra SM-målinger som forblir skjult i Raman-målinger av bulkmateriale. Denne protokollen skisserer SM SERS-målingene ved hjelp av en DNA-origami nanoantenne (DONA) i kombinasjon med atomkraftmikroskopi (AFM) og Raman-spektroskopi. En DNA-origami-gaffelstruktur og to gullnanopartikler kombineres for å danne DONAene, med et gap på 1, 2-2, 0 nm mellom dem. Dette muliggjør en opptil 1011-fold SERS-signalforbedring, noe som muliggjør målinger av enkeltmolekyler. Protokollen demonstrerer videre plasseringen av et enkelt analyttmolekyl i et SERS-hot spot, prosessen med AFM-avbildning og den påfølgende overlegget av Raman-avbildning for å måle en analytt i en enkelt DONA.
DNA origami er en nanoteknologi teknikk som innebærer folding DNA-tråder i bestemte former og mønstre. Evnen til å lage strukturer med presis kontroll på nanoskala er en av de viktigste fordelene med DNA-origami1. Evnen til å manipulere materie i så liten skala har potensial til å revolusjonere et bredt spekter av felt, inkludert medisin, elektronikk og materialvitenskap2. For eksempel har DNA-origamistrukturer blitt brukt til å levere medisiner direkte til kreftceller 3,4, lage nanoskalasensorer for å oppdage sykdommer5,6, og skape intrikate mønstre på overflatene av materialer 6,7. Videre har evnen til å bruke DNA-origami til å skape komplekse nanoskalastrukturer skapt nye muligheter for å studere grunnleggende biologiske prosesser på nanoskala8.
Overflateforbedret Raman-spredning (SERS) er en robust analytisk teknikk som oppdager og identifiserer molekyler ved ekstremt lave konsentrasjoner9. Den er basert på Raman-effekten, som er en endring i bølgelengden til spredt lys10. SERS krever et plasmonisk metallsubstrat for å forbedre Raman-signalet om molekyler adsorbert på det. Denne forbedringen kan være opptil 10 11 ganger større enn signalet oppnådd fra det samme molekylet målt ved konvensjonell Raman-spektroskopi, noe som gjør SERS til en svært følsom metode for å analysere spormengder av stoffer11.
Raman-signalforbedringen av nanopartikler skyldes hovedsakelig elektromagnetisk forbedring basert på eksitering av lokalisert overflateplasmonresonans (LSPR)12. I dette fenomenet svinger elektroner i metallnanopartikkelen kollektivt rundt overflaten av metallnanopartikkelen under lysinnfall. Dette resulterer i dannelsen av en stående bølge av elektroner kjent som en overflateplasmon, som kan resonere med det innfallende lyset. LSPR forbedrer det elektriske feltet nær partikkelens overflate, og den optiske absorpsjonen av partikkelen er maksimal ved plasmonresonansfrekvensen. Overflateplasmonens energi avhenger av formen og størrelsen på metallnanopartikkelen, samt egenskapene til det omkringliggende mediet13. En høyere forbedring kan videre oppnås ved plasmoniske koblinger, for eksempel når to nanopartikler er nær hverandre i en avstand på omtrent 2, 5 ganger diameterlengden eller mindre14. Nærheten får LSPR av begge nanopartikler til å interagere med hverandre, og forbedrer det elektriske feltet i gapet mellom partiklene med flere størrelsesordener, som langt overstiger forbedringen av en enkelt nanopartikkel15,16,17. Størrelsen på forbedringen er omvendt proporsjonal med avstanden mellom nanopartiklene; Når avstanden minker, vises et kritisk punkt der forbedringen er tilstrekkelig til å oppdage enkeltmolekyler (SM)18.
DNA-origami representerer en nøkkelteknologi som effektivt kan arrangere plasmoniske nanopartikler for å utnytte og optimalisere plasmonisk kobling19. Samtidig kan molekyler av interesse plasseres nøyaktig på stedet der optisk deteksjon er mest effektiv. Dette har blitt demonstrert med DNA origami-baserte plasmoniske nanoantenner for fluorescensdeteksjon20. I motsetning til deteksjon av fluorescerende etiketter, gir SERS muligheten til å oppdage et direkte kjemisk fingeravtrykk av et molekyl, noe som gjør enkeltmolekylet SERS svært attraktivt for sensing, samt overvåking av kjemiske reaksjoner og mekanistiske studier. DNA-origami kan også brukes som en maske for å fremstille plasmoniske nanostrukturer med veldefinerte former21, selv om muligheten til å plassere målmolekyler nøyaktig inn i det varme stedet da går tapt.
Ved hjelp av kolokalisert atomkraftmikroskopi (AFM) og Raman-målinger kan vi oppnå Raman-spektrene fra en enkelt DNA-origami nanoantenne (DONA) og potensielt et enkelt molekyl hvis det plasseres i posisjonen til høyeste signalforbedring. DONA består av en DNA-origami-gaffel og to nøyaktig plasserte nanopartikler, fullt belagt med DNA komplementære til utvidede stifttråder festet til DNA-origami. Ved DNA-hybridisering er nanopartiklene bundet til DNA-origami-gaffelen med et gap på 1, 2-2, 0 nm mellom nanopartikkelflatene22. Slik montering skaper et hot spot mellom nanopartiklene med en signalforbedring på opptil 1011 ganger, som beregnet fra FDTD-simuleringer (finite difference time domain)22, og tillater dermed SM SERS-målinger. Imidlertid er volumet av den høyeste forbedringen liten (i 1-10 nm3-området ), og følgelig må målmolekylene plasseres nøyaktig inn i dette varme stedet. DNA-origami-gaffelen tillater plassering av et enkelt molekyl mellom de to nanopartiklene ved hjelp av en DNA-gaffelbro og egnet koblingskjemi. Likevel er det svært utfordrende å observere slike SM-er i Raman-spektra22. Alternativt kan nanopartiklene være fullt belagt med målmolekylet, for eksempel et TAMRA-fargestoff, for å tillate enkle DONA-målinger med høyere SERS-intensitet21. I dette tilfellet er TAMRA kovalent festet til DNA-beleggstrengen (figur 1).
SM SERS er et kraftig verktøy som gjør det mulig for forskere å studere oppførselen og interaksjonene til individuelle molekyler i en prøve1. En slik teknikk tillater analyse av systemer på et enestående følsomhetsnivå, og gir ny innsikt i den grunnleggende oppførselen til enkeltmolekyler og fordelingen av kjemiske eller fysiske egenskaper over et ensemble av molekyler, og bidrar til å identifisere relevante mellomprodukter i kjemiske prosesser. Å plassere et enkelt molekyl på det varme stedet samtidig som du sørger for at det varme stedet har nok overflateforbedring, kan imidlertid være ganske utfordrende27. De beskrevne DONAene i denne protokollen kan nøyaktig plassere et enkelt molekyl i det varme stedet mellom to gullnanopartikler samtidig som det sikres at en 1011 ganger overflateforbedring er nådd.
Gapet mellom nanopartiklene er kritisk for at DONA-forsamlingen skal nå den nødvendige overflateforbedringen for SM SERS-studier. DONAene er optimalisert for sfæriske nanopartikler med størrelser mellom 60 og 80 nm. Videre kan kvaliteten på nanopartiklene betydelig påvirke hybridiseringen av nanopartiklene med DNA-origami-gaflene; Når nanopartiklene som brukes i beleggingstrinnet er eldre enn 6 måneder, begynner effektiviteten av hybridisering å avta.
Et annet kritisk aspekt ved protokollen er at trinnene som krever et nøyaktig forhold mellom komponentene må følges nøyaktig, ellers vil DONAene ikke bli dannet riktig. DNA-origami-gaffelen er ekstremt følsom for temperaturrampingprotokollen, med endringer som påvirker strukturens integritet eller forhindrer gafler i å dannes.
Amorf karbongenerering er et betydelig problem under SERS-målinger fordi toppene vanligvis er i samme område som fingeravtrykkområdet for mange molekyler (1,200-1,700 cm-1). Selv om formasjonen ennå ikke er fullt ut forstått, er den vanligvis forbundet med høy lasereffekt eller lange integrasjonstider28. Som en forholdsregel bør lavest mulig lasereffekt og kortest mulig integrasjonstid brukes. Dette er imidlertid ikke lett å oppnå fordi det må oppnås en balanse mellom å oppnå ønsket SERS-signal og unngå generering av amorft karbon.
DONAene er svært allsidige som et SM-system angående de forskjellige typer og former av nanopartikler som kan brukes, for eksempel sølvkuler, gullblomster eller stjerner. I tillegg kan molekylet som undersøkes enkelt erstattes ved å endre bare DNA-strengen i midten av broen, uten endringer i prosedyren. Bytte til proteiner som cytokrom C kan gjøres ved å ha en pyridinmodifisert DNA-fangststreng i broen, noe som vil binde cytokrom C og sikre at den er i hot spot for SM SERS-målinger22. Dette betyr også fleksibelt valg av laser for bestråling, potensielt ved hjelp av en laser som gir maksimal forbedring.
Oppsummert er denne metoden pålitelig for montering av DONA-strukturer og bruk av dem til enkeltmolekylære overflateforbedrede Raman-spektroskopimålinger.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Det europeiske forskningsrådet (ERC; consolidator Grant No. 772752).
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL | Merck | UFC5100BK | |
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA) | SIGMA Aldrich | T9650 | |
60 nm goldspheres, bare (citrate) | NanoComposix | AUCN60 | |
ACCESS-NC-A AFM probes | SCHAEFER-TEC | ||
Agarose powder | SIGMA Aldrich | 9012-36-6 | |
AuNP DNA coating strands | IDT | ||
AuNP DNA coating strands (TAMRA) | SIGMA Aldrich | ||
Glycerol | SIGMA Aldrich | 56-81-5 | |
Heraeus Fresco 17 centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution | HORIBA | ||
Magnesium chloride | SIGMA Aldrich | 7786-30-3 | |
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA) | Metabion | ||
Nanofork DNA staple strands | SIGMA Aldrich | ||
ParafilmM | Carl Roth | CNP8.1 | |
Primus 25 Thermocycler | Peqlab/VWR | ||
Silicon wafer | Siegert wafer | BW14076 | |
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18) | Tilibit nanosystems | ||
TCEP solution | SIGMA Aldrich | 51805-45-9 |