Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

פרוטאזות לשבור אג"ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות.

Abstract

פרוטאזות לשבור אג"ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות, וזה מה שאנחנו עושים במהלך הליכי בקרת האיכות שלנו. ב assay זו, קזאין משמש מצע. כאשר אנו בודקים פרוטאז מעכל קזאין, טירוזין חומצה אמינית משוחרר יחד עם חומצות אמינו אחרות ושברי פפטיד. מגיב Folin ו Ciocalteus פנול, או של Folin בעיקר מגיב עם טירוזין חינם לייצר chromophore בצבע כחול, אשר לכימות ומדד כערך ספיגת על ספקטרופוטומטר. טירוזין יותר כי הוא שוחרר מבית קזאין, יותר chromophores נוצרים חזקה יותר פעילות של פרוטאז. ספיגת ערכים שנוצר על ידי פעילות של פרוטאז הם לעומת עקומת רגיל, אשר מופק על ידי מגיבים בכמויות ידוע של טירוזין עם מגיב FC לתאם שינויים ספיגת עם כמות של טירוזין ב micromoles. מתוך עקומת סטנדרט הפעילות של דגימות פרוטאז ניתן לקבוע במונחים של יחידות, המהווה את הסכום micromoles ושווי טירוזין שוחרר מבית קזאין לדקה.

כדי להציג את המאמר הזה בסינית, לחץ כאן

Protocol

לפני תחילת assay, אנחנו צריכים לוודא כי ריאגנטים הבאים מוכנים כראוי:

  1. פוספט 50 מ"מ הצפת אשלגן, pH 7.5. הכן באמצעות 11.4 מ"ג / מ"ל ​​phospate dibasic אשלגן, הידראט של מים מטוהרים והתאמת pH עם 1M HCl. פתרון זה ממוקם ב 37 מעלות לפני השימוש.
  2. 0.65% משקל / נפח פתרון קזאין, שהוכן על ידי ערבוב של 6.5 מ"ג / מ"ל ​​של קזאין ב חיץ 50 mM אשלגן זרחתי. בהדרגה הגדילו את הטמפרטורה פתרון עם ערבוב עדין 80-85 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות עד פיזור אחיד מושגת. חשוב מאוד לא להרתיח את הפתרון. PH הוא מותאם אז אם יש צורך עם NaOH ו HCl.
  3. 110 חומצה Trichloroacetic פתרון מ"מ, שהוכן על ידי דילול המניות 1:55 6.1N עם מים מטוהרים. חומצה Trichloroacetic היא חומצה חזקה יש לנהוג בזהירות.
  4. 0.5 mM Folin &, או מגיב Ciolcaltea של פנול של Folin, המהווה את הפתרון יגיב עם טירוזין לחולל שינוי צבע למדידה יהיה קשור ישירות לפעילות של פרוטאזות. מגיב פנול של Folin היא חומצה וצריך לטפל בזהירות.
  5. נתרן 500 mM פתרון קרבונט, שהוכן באמצעות 53 מ"ג / מ"ל ​​של סודיום קרבונט anyhydrous של מים מטוהרים.
    פתרון diluent האנזים, אשר מורכב של 10 הצפת נתרן אצטט מ"מ עם Acetate סידן 5mm, pH 7.5, בשעה 37 ° C. פתרון זה מה שאנו משתמשים בו כדי להמיס דגימות פרוטאז מוצק או לדלל פתרונות האנזים.
  6. המניה 1.1 mM L-tyrosine תקן פתרון. הוכן באמצעות 0.2 מ"ג / מ"ל ​​L-tyrosine ב מטוהרים מים מחוממים בעדינות עד טירוזין נמס. כמו קזאין, אינם להרתיח את הפתרון הזה. אפשר תקן L-tyrosine כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. פתרון זה יהיה מדולל יותר כדי להפוך עקומת הרגילה שלנו.
  7. פרוטאז פתרון. מיד לפני השימוש, לפזר פרוטאז בפתרון diluent אנזים מוכן בשלב 6.

במידת הצורך, להשתמש במדגם פרוטאז מוצק של פעילות קבועה מראש, אשר מומס באמצעות diluent האנזים 0.1-0.2 יחידות / מ"ל. פתרון זה משמש כביקורת חיובית assay בקרת איכות כמו אימות עבור החישובים נבצע לקביעת פעילות האנזים.

הגדרת Assay פרוטאז ועקומות רגילה

  1. כדי להתחיל את זה assay, למצוא בקבוקוני מתאים אשר יחזיקו כ - 15 MLS. במשך כל אנזים זה תיבחן, 4 צלוחיות נדרשים. בקבוקון אחד ישמש ריק, ושלושה אחרים ישמשו לפעילות assay של שלושה דילולים של פרוטאז. שלושה דילולים שימושיים בעת בדיקת חישובים הסופית אחד נגד השני.
    1. כדי להגדיר כל אחד של ארבעה בקבוקונים, להוסיף 5mls של הפתרון שלנו 0.65% קזאין. תנו להם לאזן באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ -5 דקות.
    2. הוסף שונות כרכים של פתרון אנזים ייבדקו שלוש צלוחיות של מדגם הבדיקה, אך לא ריקה. מערבבים על ידי מתערבלים דגירה של 37 מעלות בדיוק עשר דקות. פעילות הפרוטאז והשחרור תוצאתי של טירוזין במהלך תקופה זו הדגירה היא מה יהיה נמדד בהשוואה בין דגימות הבדיקה.
  2. לאחר דגירה זה 10 דקות, מוסיפים את 5 ה-MLS של מגיב TCA על צינור אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של תמיסת האנזים צינור אחד, אפילו ריק, כך נפח הסופי של פתרון האנזים במבחנה כל 1 מ"ל. הדבר נעשה על חשבון הערך ספיגת של האנזים עצמו כדי להבטיח את הנפח הסופי במבחנה כל שווה. דגירה הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.


    במהלך הדגירה זה 30 דקות, ייתכן שתרצה להגדיר דילולים תקן טירוזין שלך. השתמש ב-DRAM 6 צלוחיות (צלוחיות DRAM ניתן להחליף עם צינורות פוליפרופילן) אשר יכול בקלות להחזיק 8 MLS. כדי שש צלוחיות, להוסיף את הפתרונות 1.1 mM טירוזין מניות רגיל עם הכרכים הבאים MLS: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. אין להוסיף שום תקן טירוזין על ריק. סטנדרטים התחתון עשוי להיות נחוץ עבור דגימות מבחן טמא שיניבו שינוי צבע קטנה. לאחר פתרון סטנדרטי טירוזין נוספה, להוסיף נפח מתאים של מים מטוהרים לכל הסטנדרטים להביא את נפח 2-MLS.
  3. לאחר דגירה של 30 דקות, לסנן כל הפתרונות מבחן ריק באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק הסינון. סינון נדרשת להסיר כל insolubles מן הדגימות.
    1. מוסיפים את הסינון 2 MLS של דגימות בדיקה תסנין ריק 4 צלוחיות DRAM שיכול להכיל לפחות 8 MLS. אותו סוג של הבקבוקון שבו הסטנדרטים היו מוכנים ניתן להשתמש.
    2. לכל בקבוקונים המכילים את הסטנדרטים ריק רגיל, להוסיף 5mls של סודיום קרבונט. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מוסיפים 1 מ"ל של ריאגנט של Folin מייד לאחר מכן.
    3. הוסף סודיום קרבונט להסדיר כל טיפה pH נוצר על ידי תוספת של מגיב של Folin.
    4. הוסף סודיום קרבונט על דגימות הבדיקה TESריק לא. פתרונות אלה הופכים מעונן לאחר תוספת של סודיום קרבונט. הוספת ריאגנט של Folin, אשר יגיב בעיקר עם טירוזין חינם.
    5. מערבבים את בקבוקוני ה-DRAM ידי מתערבלים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    לאחר דגירה זה, אתה צריך לשים לב שהסטנדרטים יש הדרגתיות של צבע correlating עם כמות של טירוזין הוסיף, הריכוזים הגבוהים ביותר של טירוזין המופיעים האפלים ביותר. ניתן גם לשים לב לשינוי צבע ניכר דגימות הבדיקה שלנו. 2mls של פתרונות אלה מסוננים באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק לתוך cuvettes מסנן מתאים. כעת, assay מתבצע, אתה יכול להמשיך ספקטרופוטומטר כדי להקליט ספיגת הערכים שלנו.

מדידת ספיגת ואת חישוב פעילות האנזים

  1. ספיגת של דגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר באמצעות אורך גל של 660nm. נתיב האור מוגדר 1cm. הקלט את ספיגת ערכים של תקנים, תקן ריק, דגימות מבחן אחר, מבחן ריק. לאחר שכל הנתונים נאספו, עקומת סטנדרט ניתן ליצור. על מנת ליצור את עקומת, ההבדל בין ספיגת ריק תקן תקן חייב להיות מחושב. זהו ערך ספיגת לייחס סכום של טירוזין של פתרונות סטנדרטיים. לאחר החישוב הפשוט הזה, ליצור את עקומת סטנדרט באמצעות תוכנית גרפים לעלילה שינוי ספיגת הסטנדרטים שלנו על ציר Y, ​​לעומת הסכום micromoles עבור כל הסטנדרטים שלנו 5 על ציר ה-X.

    נפח תקן טירוזין uMoles טירוזין
    0.05 0.055
    0.10 0.111
    0.20 0.221
    0.40 0.442
    0.50 0.553
  2. אחרי נקודות הנתונים הוזנו, ליצור קו בכושר הטוב ביותר ואת המשוואה מדרון המקביל.


    מצא את השינוי ספיגת בדגימות בדיקה על ידי חישוב ההפרש בין ספיגת במבחן מדגם ואת ספיגת ריק הבדיקה. הכנסת ערך ספיגת אחד של דגימות בדיקה למשוואה מדרון ופתרון תגרום micromoles של שחרור טירוזין במהלך התגובה הזאת proteolytic בפרט. כדי לקבל את הפעילות של האנזים יחידות מ"ל /, לבצע את החישוב הבא:


    (ושווי טירוזין umole שוחרר) x (11)
    יחידות / מ"ל אנזים = __________________________________________

    (1) x (10) x (2)


    11 = סה"כ נפח (ב מיליליטר) של assay
    10 = שעה של assay (בדקות) לפי ההגדרה היחידה
    1 = נפח האנזים (ב מיליליטר) של האנזים המשמש
    Volume 2 = (ב מיליליטר) המשמשים קביעת Colorimetric


    קח את מספר ושווי micromoles טירוזין שוחרר המתקבל המשוואה המדרון הכפל אותו ב מהנפח הכולל של assay ב-MLS, שבמקרה שלנו הוא 11mls. מחלקים ערך זה על ידי שלושה כמויות אחרות: הזמן של assay, אשר רצנו 10 דקות, נפח של אנזים המשמש assay, שהיה מגוונות (בואו להשתמש 1ml), נפח מ"ל המשמש לגילוי colorimetric, אשר עשוי שונים המבוססים על קובט שלך. השתמשנו 2 MLS.
  3. Micromoles של טירוזין מחולק זמן מדידת התשואות דקות של פעילות הפרוטאז שנקרא "יחידות". אנחנו יכולים לבטל את יחידות למדידת נפח במונה וגם במכנה, משאיר מדידה של פעילות האנזים במונחים של יחידות / מ"ל. על מנת לקבוע את הפעילות מדגם פרוטאז מוצק מדולל diluent האנזים, אנו מחלקים את הפעילות שלנו ביחידות / ml ידי ריכוז מוצק המשמש assay זה במקור מ"ג / מ"ל. והותיר אותנו עם פעילות במונחים של יחידות / מ"ג .


    יחידות / מ"ל אנזים
    יחידות / מוצק מ"ג = _____________________

    מ"ג מוצק / מ"ל אנזים

Discussion

הוכחנו רק אותך איך לנתח פעילות הפרוטאז באמצעות פעילות assay אוניברסלי של סיגמא פרוטאז. בנוסף, assay זו שימושית כדי להבטיח פרוטאזות שלנו קבעו דווקא פעילות לפני שתקבל אותם עבור הניסויים שלך. כפי שראיתם, בעת ביצוע הליך זה, זה בעל חשיבות עליונה לזכור חום הן קזאין ופתרונות טירוזין לאט, לא להרתיח אותם. כמו כן, זה קריטי כדי להכין את החסר שונה עבור שני תקני שלך למדגם כל מבחן שיש לך.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter