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Biology

Sigma Unspezifische Protease Activity Assay - Casein als Substrat

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

Proteasen bauen Peptidbindungen. Im Labor ist es oft notwendig, um zu messen und / oder vergleichen Sie die Aktivität von Proteasen. Sigma ist nicht-spezifische Protease-Aktivität Test kann als ein standardisiertes Verfahren eingesetzt werden, um die Aktivität von Proteasen zu bestimmen.

Abstract

Proteasen bauen Peptidbindungen. Im Labor ist es oft notwendig, um zu messen und / oder vergleichen Sie die Aktivität von Proteasen. Sigma ist nicht-spezifische Protease-Aktivität Test kann als ein standardisiertes Verfahren eingesetzt werden, um die Aktivität der Proteasen, die das, was wir während unserer Qualitätskontrolle zu tun ist zu bestimmen. In diesem Test wirkt Casein als Substrat. Wenn die Protease testen wir Casein verdaut, ist die Aminosäure Tyrosin befreit zusammen mit anderen Aminosäuren-und Peptid-Fragmente. Folin und Ciocalteus Phenol oder Folin-Reagenz in erster Linie reagiert mit freiem Tyrosin zu einer blau gefärbten Chromophor, die quantifizierbar und gemessen als OD-Wert auf dem Spektralphotometer ist zu produzieren. Je mehr Tyrosin, die aus Kasein freigesetzt wird, desto mehr Chromophore erzeugt und desto stärker ist die Aktivität der Protease. Extinktionswerte durch die Aktivität der Protease erzeugt werden, um eine Standardkurve, die durch Umsetzung von bekannten Mengen von Tyrosin mit dem FC-Reagenz auf Veränderungen in der Absorption mit der Menge an Tyrosin in Mikromol korrelieren erzeugt wird verglichen. Von der Standardkurve der Aktivität der Protease Proben können in Bezug auf die Einheiten, die über den Betrag in Mikromol Tyrosin-Äquivalente aus Kasein pro Minute freigesetzt bestimmt werden.

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Protocol

Vor Beginn des Tests, müssen wir sicherstellen, dass die folgenden Reagenzien richtig vorbereitet sind:

  1. Eine 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Bereiten Sie mit 11,4 mg / ml Kalium Phosphat zweiwertigen Trihydrat in gereinigtem Wasser und Einstellen des pH mit 1 M HCl. Diese Lösung wird bei 37 ° C vor dem Einsatz platziert.
  2. A 0,65% Gewicht / Volumen Casein-Lösung durch Mischen 6,5 mg / ml Casein in der 50 mM Kaliumphosphatpuffer vorbereitet. Allmählich stieg die Temperatur der Lösung unter leichtem Rühren auf 80-85 ° C für ca. 10 Minuten, bis eine homogene Dispersion erreicht ist. Es ist sehr wichtig, nicht die Lösung kochen. Der pH-Wert wird dann angepasst, wenn nötig mit NaOH und HCl.
  3. A 110 mM Trichloressigsäure-Lösung durch Verdünnen einer 6.1N Lager 1.55 mit gereinigtem Wasser hergestellt. Trichloressigsäure ist eine starke Säure und sollten mit Vorsicht behandelt werden.
  4. 0,5 mM Folin & Ciolcaltea ist, oder Folin ist Phenolreagenz, die die Lösung, die mit Tyrosin reagieren wird, um eine messbare Farbwechsel, die direkt auf die Aktivität von Proteasen bezogen werden zu generieren. Folin ist Phenolreagenz ist eine Säure und sollte mit Sorgfalt behandelt werden.
  5. A 500 mM Natriumcarbonatlösung, hergestellt unter Verwendung von 53 mg / ml anyhydrous Natriumcarbonat in gereinigtem Wasser.
    Ein Enzym, Verdünnungsmittel Lösung, die von 10 mM Natriumacetat-Puffer mit 5 mM Calcium Acetate, pH 7,5, besteht bei 37 ° C. Diese Lösung ist es, was wir feste Protease-Proben auflösen oder verdünnten Enzym-Lösungen verwenden.
  6. 1,1 mM L-Tyrosin-Standard-Stammlösung. Hergestellt unter Verwendung von 0,2 mg / ml L-Tyrosin in gereinigtem Wasser und leicht, bis die Tyrosin löst erwärmt. Wie mit dem Casein, nicht kochen diese Lösung. Lassen Sie die L-Tyrosin-Standard auf Raumtemperatur abkühlen. Diese Lösung wird weiter verdünnt werden, um unsere Standard-Kurve machen.
  7. Protease-Lösung. Unmittelbar vor der Anwendung aufgelöst Protease in Enzym-Verdünnungslösung in Schritt 6 erstellt.

Wenn nötig, verwenden Sie eine feste Protease-Probe von vorbestimmten Tätigkeit, die aufgelöst mit Enzym Verdünnungsmittel auf 0,1-0,2 Einheiten / ml ist. Diese Lösung dient als positive Kontrolle für die Qualitätskontrolle Test und Validierung für die Berechnungen führen wir die Enzymaktivität bestimmt wird.

Einrichten des Protease-Assay-und Standard-Kurven

  1. Zu Beginn dieses Tests finden Sie passende Fläschchen, dass etwa 15 mls halten wird. Für jedes Enzym, das getestet werden soll, sind 4 Flaschen benötigt. Ein Fläschchen wird als Rohling verwendet werden, und drei andere wird Assay Aktivität von drei Verdünnungen der Protease verwendet werden. Drei Verdünnungen sind nützlich, wenn die Überprüfung endgültigen Berechnungen gegeneinander.
    1. Zu jedem Satz von vier Flaschen, fügen 5mls unserer 0,65% Casein-Lösung. Lassen Sie sie in ein Wasserbad Gleichgewicht bei 37 ° C für ca. 5 Minuten.
    2. Fügen unterschiedlicher Menge Enzymlösung, dass drei der Probe Fläschchen getestet werden, aber nicht die leer. Mix durch Schütteln und Inkubation für 37 ° C für genau 10 Minuten. Die Protease-Aktivität und Folgeschäden Befreiung von Tyrosin während dieser Inkubationszeit ist, was wird gemessen und verglichen werden zwischen Testproben.
  2. Nach diesem 10-minütigen Inkubation, fügen Sie die 5 ml des TCA-Reagenz in jedes Röhrchen, um die Reaktion zu stoppen. Dann fügen Sie ein geeignetes Volumen der Enzymlösung in jedes Röhrchen, auch die leeren, so dass die endgültige Volumen der Enzymlösung in jedes Röhrchen wird 1 ml. Dies ist für den Extinktionswert des Enzyms selbst Rechnung und um sicherzustellen, dass das Endvolumen in jeder Röhre gleich ist getan. Inkubieren Sie die Lösungen bei 37 ° C für 30 Minuten.


    Während dieser 30-minütigen Inkubation, können Sie zum Einrichten Ihres Tyrosin Standardverdünnungen. Verwende 6 dram Fläschchen (dram Fläschchen mit Polypropylen-Röhrchen ersetzt werden), die leicht zu halten kann 8 mls. Um die sechs Fläschchen, fügen Sie die 1,1 mM Tyrosin Standard-Stammlösungen mit folgenden Volumina in ml: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Fügen Sie keine Tyrosin-Standard auf den Rohling. Niedrigere Standards können für unreine Proben, die wenig Farbe ändern Ertrag benötigt werden. Sobald die Tyrosin-Standardlösung zugesetzt worden ist, fügen Sie ein geeignetes Volumen des gereinigten Wassers in jedem der Standards, um die Lautstärke zu 2 ml zu bringen.
  3. Nach der Inkubationszeit von 30 Minuten, Filter jede der Testlösungen und der Rohling mit einem 0,45 um Polyethersulfon Spritzenfilter. Filtration ist erforderlich, um unlösliche Bestandteile aus den Proben zu entfernen.
    1. Fügen Sie die Filtration 2 ml der Test-und Blindproben Filtrat bis 4 dram Fläschchen, dass mindestens 8 mls halten kann. Die gleiche Art von Flasche, in der die Standards hergestellt wurden genutzt werden kann.
    2. Um alle Flaschen mit den Normen und Standards blank, fügen 5mls von Natriumcarbonat. Für beste Ergebnisse 1 ml Folin-Reagenz unmittelbar danach.
    3. Add Natriumcarbonat zu einer pH-Abfall durch die Zugabe des Folin-Reagenz geschaffen zu regulieren.
    4. Add Natriumcarbonat zu den Proben und test leer. Diese Lösungen trüb nach der Zugabe von Natriumcarbonat. Fügen Sie die Folin-Reagenz, das vor allem reagiert mit freiem Tyrosin.
    5. Mischen Sie die DRAM-Fläschchen durch Schütteln und Inkubation bei 37 ° C für 30 Minuten.
    Nach dieser Inkubation, sollten Sie feststellen, dass die Standards eine Abstufung der Farbe korreliert mit der Menge an Tyrosin hinzugefügt haben, die höchsten Konzentrationen von Tyrosin erscheinen dunkelsten. Sie können auch feststellen, nennenswerte Farbveränderung in unseren Proben. 2mls dieser Lösungen sind durch ein 0,45 um Polyethersulfon Spritzenfilter in geeignete Küvetten. Nun, da der Test durchgeführt wird, können Sie mit dem Spektralfotometer Sie diese in unserem Extinktionswerte aufzunehmen.

Messung der Absorption und Berechnung Enzymaktivität

  1. Die Absorption der Proben wird durch ein Spektralphotometer mit einer Wellenlänge von 660nm gemessen. Der Lichtweg ist 1cm gesetzt. Notieren Sie sich die Extinktionswerte für die Standards, Standard-blank, die verschiedenen Proben und testen leer. Sobald alle Daten gesammelt wurden, kann die Standardkurve erstellt werden. Um die Kurve zu erzeugen, Extinktionsdifferenz zwischen der Standard-und Standard-Rohling berechnet werden muss. Dies ist der Extinktionswert auf die Menge an Tyrosin in der Standard-Lösungen. Nach dieser einfachen Rechnung, erstellen Sie die Standard-Kurve mit einem Grafik-Programm, um die Änderung der Absorption von unseren Standards auf der Y-Achse gegen die Menge in Mikromol für jedes unserer 5-Norm auf der X-Achse zeichnen.

    Volume von Tyrosin Standard- uMoles Tyrosin
    0,05 0,055
    0,10 0,111
    0,20 0,221
    0,40 0,442
    0,50 0,553
  2. Nachdem die Daten eingegeben sind, erzeugen eine Reihe von Best-Fit und entsprechende Neigung Gleichung.


    Finden Sie die Änderung der Absorption in den Proben durch Berechnung der Differenz zwischen der Probe Absorption und der Absorption der Test leer. Einsetzen der Extinktionswert für eine der Proben in den Hang Gleichung ein und lösen in der Mikromol Tyrosin befreiten während dieser besonderen proteolytischen Reaktion führen. Um die Aktivität des Enzyms in Einheiten pro / ml, führen Sie die folgende Berechnung:


    (Umole Tyrosinäquivalent freigegeben) x (11)
    Einheiten / ml Enzym = __________________________________________

    (1) x (10) x (2)


    11 = Gesamtvolumen (in Milliliter)-Assay
    10 = Time of Assay (in Minuten) nach der Einheit Definition
    1 = Volumen der Enzyme (in Milliliter) des Enzyms verwendet
    2 = Volumen (ml) in kolorimetrischen Bestimmung verwendet


    Nehmen Sie die Anzahl der Mikromol Tyrosin-Äquivalente freigesetzt aus der Steigung Gleichung erhalten und vermehren es durch das Gesamtvolumen des Assays in mls, was in unserem Fall ist 11mls. Teilen Sie diesen Wert durch drei weitere Mengen: die Zeit des Tests, die wir für 10 Minuten lief, das Volumen des Enzyms im Assay verwendet, die variiert wurde (wir verwenden 1ml), das Volumen der Milliliter in kolorimetrischen Nachweis verwendet, der eventuell unterscheiden auf der Grundlage Ihrer Küvette. Wir haben 2 mls.
  3. Mikromol Tyrosin durch die Zeit in Minuten liefert die Messung der Protease-Aktivität als "Einheiten" unterteilt. Wir können heben die Einheiten für Volumen-Messung in den Zähler und Nenner, so dass ein Messen von Enzymaktivität in Einheiten / ml. Um die Aktivität in einem festen Protease Probe in Enzym-Verdünnungsmittel verdünnt bestimmen, teilen wir unsere Tätigkeit in Einheiten / ml durch die Konzentration der festen in diesem Test ursprünglich in mg / ml. Verwendet, so dass uns mit der Aktivität in Bezug auf die Einheiten / mg .


    Einheiten / ml Enzym
    Units / mg Feststoff = _____________________

    mg Feststoff / ml Enzym

Discussion

Wir haben gerade gezeigt, wie Sie Protease-Aktivität analysieren mit Hilfe von Sigma universelle Protease-Aktivität-Assay. Darüber hinaus ist dieser Test nützlich, um sicherzustellen, dass unsere Proteasen haben genau Aktivität bestimmt, bevor Sie sie erhalten für Ihre Experimente. Wie Sie gesehen haben, wenn Sie diese Prozedur, ist es von größter Wichtigkeit zu erinnern, um sowohl das Kasein und Tyrosin-Lösungen Wärme langsam und nicht zu kochen. Außerdem ist es wichtig, verschiedene Rohlinge für Ihre Ansprüche und für jede Probe, die Sie vorbereiten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

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References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
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Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

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