कैसिइन के रूप में एक सब्सट्रेट - सिग्मा गैर विशिष्ट Protease गतिविधि परख

Summary

Proteases पेप्टाइड बांड तोड़ने. प्रयोगशाला में, यह अक्सर है को मापने के लिए और / या proteases की गतिविधि की तुलना करने के लिए आवश्यक है. Proteases की गतिविधि को निर्धारित करने के लिए सिग्मा protease गैर विशिष्ट गतिविधि परख एक मानकीकृत प्रक्रिया के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Proteases पेप्टाइड बांड तोड़ने. प्रयोगशाला में, यह अक्सर है को मापने के लिए और / या proteases की गतिविधि की तुलना करने के लिए आवश्यक है. Proteases की गतिविधि है, जो है कि हम क्या हमारे गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के दौरान निर्धारित सिग्मा protease गैर विशिष्ट गतिविधि परख एक मानकीकृत प्रक्रिया के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख में, कैसिइन एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है. जब protease हम परीक्षण कर रहे हैं कैसिइन हज़म, एमिनो एसिड tyrosine अन्य एमिनो एसिड और पेप्टाइड टुकड़ों के साथ मुक्त है. Folin और Phenol Ciocalteus, या Folin है अभिकर्मक मुख्य रूप से मुक्त करने के लिए एक नीले रंग क्रोमोफोर है, जो और quantifiable स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर एक absorbance के मूल्य के रूप में मापा जाता है का उत्पादन tyrosine के साथ प्रतिक्रिया करते हैं. अधिक tyrosine कि कैसिइन से जारी है, और अधिक chromophores उत्पन्न होते हैं और मजबूत protease की गतिविधि. Absorbance protease की गतिविधि द्वारा उत्पन्न मान एक मानक वक्र है, जो एफसी अभिकर्मक के साथ tyrosine की ज्ञात मात्रा प्रतिक्रिया micromoles में tyrosine की राशि के साथ absorbance में परिवर्तन सहसंबंधी द्वारा उत्पन्न होता है की तुलना में कर रहे हैं. मानक वक्र से protease नमूनों की गतिविधि इकाइयों, जो tyrosine प्रति मिनट कैसिइन से जारी समकक्ष के micromoles में राशि है के संदर्भ में निर्धारित किया जा सकता है.

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Protocol

परख शुरू करने से पहले हम यह सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित अभिकर्मकों सही ढंग से तैयार हैं बनाने की जरूरत है: एक 50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर, 7.5 पीएच. 11.4 मिलीग्राम / पोटेशियम Phospate dibasic, शुद्ध पानी और 1M एचसीएल के साथ पीएच समायोजन में trihydrate के मिलीलीटर का उपयोग कर तैयार करें. यह समाधान 37 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करने के लिए पहले रखा गया है. एक 0.65% कैसिइन / वजन मात्रा समाधान, 50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर में 6.5 कैसिइन के मिलीग्राम / मिलीलीटर का मिश्रण से तैयार किया. कोमल सरगर्मी के साथ धीरे – धीरे समाधान के तापमान में वृद्धि डिग्री सेल्सियस के बारे में 10 मिनट के लिए जब तक एक समरूप फैलाव 80-85 के लिए हासिल की है. यह बहुत महत्वपूर्ण है समाधान नहीं फोड़ा है. पीएच तो NaOH और एचसीएल के साथ यदि आवश्यक हो तो निकाला जाता है. एक 110 मिमी Trichloroacetic एसिड समाधान, शुद्ध पानी के साथ एक 6.1N शेयर 1:55 गिराए द्वारा तैयार की. Trichloroacetic एसिड एक मजबूत एसिड होता है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. 0.5 मिमी Folin और Ciolcaltea, या Folin Phenol अभिकर्मक, जो समाधान है कि tyrosine के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एक औसत दर्जे का रंग बदलने कि सीधे proteases की गतिविधि के लिए संबंधित हो जाएगा उत्पन्न होगा. Folin Phenol अभिकर्मक एक एसिड होता है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. एक 500 मिमी सोडियम कार्बोनेट समाधान, शुद्ध पानी में 53 anyhydrous सोडियम कार्बोनेट मिलीग्राम / मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए तैयार है. एक एंजाइम मंदक समाधान ° है जो 37 पर 5mm कैल्शियम एसीटेट के साथ 10 मिमी सोडियम एसीटेट बफर, 7.5 पीएच, होते सी. यह समाधान है कि हम क्या करने के लिए ठोस protease नमूने भंग या एंजाइम समाधान जलमिश्रित उपयोग. 1.1 मिमी एल tyrosine मानक स्टॉक समाधान. शुद्ध पानी और धीरे गर्म है जब तक tyrosine घुल में 0.2 / मिलीलीटर एल tyrosine मिलीग्राम का उपयोग कर तैयार है. कैसिइन के साथ के रूप में, इस समस्या का समाधान नहीं फोड़ा करते हैं. एल-tyrosine मानक कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें. यह समाधान और पतला हो जाएगा करने के लिए हमारी मानक वक्र बनाने के लिए. Protease समाधान. तुरंत से पहले का उपयोग करने के लिए, एंजाइम मंदक चरण 6 में तैयार समाधान में protease भंग. यदि आवश्यक हो, पूर्व निर्धारित गतिविधि का एक ठोस protease नमूना है, जो 0.1-0.2 इकाइयों / मिलीलीटर एंजाइम मंदक का उपयोग करने के लिए भंग कर रहा है का उपयोग करें. यह समाधान गुणवत्ता नियंत्रण परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और हम एंजाइम गतिविधि निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन करेंगे गणना के लिए मान्यता के रूप में कार्य करता है. Protease परख और मानक घटता की स्थापना इस परख शुरू करने के लिए, उपयुक्त शीशियों के बारे में 15 mls आयोजन करेगा लगता है. एक एंजाइम है कि परीक्षण किया जाएगा, 4 शीशियों की जरूरत है. एक शीशी एक खाली के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, और तीन अन्य protease के तीन dilutions की परख गतिविधि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. तीन dilutions उपयोगी होते हैं जब एक दूसरे के खिलाफ अंतिम गणना की जाँच. चार शीशियों के प्रत्येक सेट करने के लिए, हमारे 0.65% कैसिइन समाधान के 5mls जोड़ें. उन्हें 37 पर एक पानी के स्नान में संतुलित ° सी के बारे में 5 मिनट के लिए. एंजाइम समाधान की मात्रा अलग है कि परीक्षण के नमूने शीशियों के तीन परीक्षण किया जाएगा, लेकिन रिक्त नहीं जोड़ें. घूमता और 37 के लिए सेते डिग्री सेल्सियस ठीक दस मिनट के लिए मिश्रण. protease और इस ऊष्मायन समय के दौरान tyrosine की परिणामी मुक्ति गतिविधि है क्या और मापा जाएगा के नमूने परीक्षण के बीच तुलना. इस 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक ट्यूब TCA अभिकर्मक के 5 mls जोड़ने के लिए प्रतिक्रिया बंद करो. फिर, प्रत्येक ट्यूब एंजाइम समाधान के एक उचित मात्रा में जोड़ने के लिए, भी खाली है, इतना है कि प्रत्येक ट्यूब में एंजाइम समाधान के अंतिम मात्रा है 1 मिलीलीटर. यह एंजाइम ही absorbance के मूल्य के लिए खाते में करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब में अंतिम मात्रा बराबर है के लिए किया जाता है. 37 पर समाधान सेते ° C 30 मिनट के लिए. इस 30 मिनट ऊष्मायन के दौरान, आप अपने tyrosine मानक dilutions सेट करना चाहते हो सकता है. 6 घूंट (घूंट शीशियों polypropylene ट्यूबों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है) शीशियों का उपयोग करें कि आसानी से 8 mls पकड़ कर सकते हैं. 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50: छह शीशियों के लिए, mls में निम्नलिखित संस्करणों के साथ 1.1 मिमी tyrosine मानक स्टॉक समाधान जोड़ने. रिक्त करने के लिए किसी भी tyrosine मानक जोड़ने मत करो. लोअर मानकों अशुद्ध परीक्षण के नमूने है कि थोड़ा रंग बदलने निकलेगा लिए आवश्यक हो सकता है. एक बार tyrosine मानक समाधान जोड़ा गया है, मानकों के प्रत्येक के लिए 2 mls मात्रा लाने के लिए शुद्ध पानी का एक उचित मात्रा में जोड़ने के लिए. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक परीक्षण समाधान के फिल्टर और रिक्त 0.45 उम polyethersulfone सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर. निस्पंदन नमूनों से किसी भी insolubles हटाने के लिए आवश्यक है. 4 घूंट शीशियों है कि कम से कम 8 mls पकड़ कर सकते हैं नमूने परीक्षण के निस्पंदन 2 mls और रिक्त छानना जोड़ें. शीशी में जो मानक तैयार किए गए एक ही प्रकार का इस्तेमाल किया जा सकता है. सभी मानकों और मानक रिक्त युक्त शीशियों करने के लिए, सोडियम कार्बोनेट के 5mls जोड़ें. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, Folin अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ने के तुरंत बाद. किसी भी पीएच Folin अभिकर्मक के अलावा के द्वारा बनाई गई ड्रॉप विनियमित सोडियम कार्बोनेट जोड़ें. सोडियम कार्बोनेट परीक्षण के नमूने और tes जोड़ेंटी रिक्त है. ये समाधान सोडियम कार्बोनेट के अलावा के बाद बादल बन. Folin अभिकर्मक, जो मुख्य रूप से मुक्त tyrosine के साथ प्रतिक्रिया होगी जोड़ें. मिक्स घूमता द्वारा घूंट शीशियों और 37 ° C पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. इस ऊष्मायन के बाद, आप है कि मानकों के रंग का एक उन्नयन tyrosine जोड़ी की राशि के साथ correlating है नोटिस चाहिए, tyrosine के उच्चतम सांद्रता अंधेरे दिखने. तुम भी हमारे परीक्षण के नमूने में प्रशंसनीय रंग बदलने के नोटिस कर सकते हैं. इन समाधान के 2mls उपयुक्त cuvettes में 0.45 उम polyethersulfone सिरिंज फिल्टर का उपयोग फ़िल्टर्ड रहे हैं. अब जब कि परख किया जाता है, आप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए आगे बढ़ने के लिए हमारे absorbance के मूल्यों को रिकॉर्ड कर सकते हैं. Absorbance मापने और एंजाइम गतिविधि की गणना absorbance के नमूनों की 660nm की एक तरंग दैर्ध्य का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापा जाता है. प्रकाश पथ 1cm के लिए सेट कर दिया जाता है. Absorbance के मूल्यों के लिए मानक, मानक रिक्त, विभिन्न परीक्षण के नमूने, और परीक्षण रिक्त रिकॉर्ड. एक बार डेटा के सभी एकत्र किया गया है, मानक वक्र बनाया जा सकता है. आदेश में वक्र उत्पन्न करने के लिए मानक और मानक रिक्त बीच absorbance में अंतर की गणना की जानी चाहिए. इस absorbance के मूल्य मानक समाधान में tyrosine की राशि के लिए attributable है. इस साधारण गणना के बाद, एक रेखांकन प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए y अक्ष पर हमारे मानकों के absorbance में बदलने के लिए, बनाम micromoles में एक्स अक्ष पर हमारे 5 मानकों के प्रत्येक के लिए राशि की साजिश मानक वक्र बनाने. Tyrosine मानक के वॉल्यूम uMoles Tyrosine 0.05 0.055 0.10 0.111 0.20 0.221 0.40 0.442 0.50 0.553 डेटा बिंदुओं के बाद दर्ज किया गया है, सबसे अच्छा फिट और इसी ढलान समीकरण की एक पंक्ति उत्पन्न करते हैं. परीक्षण नमूना absorbance और परीक्षण रिक्त के absorbance के बीच अंतर की गणना के द्वारा परीक्षण नमूनों में absorbance में परिवर्तन का पता लगाएं. ढलान समीकरण में नमूने परीक्षण के लिए absorbance के मूल्य डालने और सुलझाने tyrosine मुक्त के micromoles में इस विशेष proteolytic प्रतिक्रिया के दौरान परिणाम होगा. / एमएल प्रति इकाइयों में एंजाइम की गतिविधि प्राप्त करने के लिए, निम्न परिकलन: एक्स (जारी umole tyrosine समकक्ष) (11) इकाइयों / मिलीलीटर एनजाइम = __________________________________________ (1) एक्स (x 10) (2) परख की = 11 कुल मात्रा (मिलीलीटर में) परख के 10 = समय (मिनट में) के रूप में प्रति यूनिट परिभाषा 1 एनजाइम = एंजाइम की (मिलीलीटर) में वॉल्यूम का इस्तेमाल 2 = (मिलीलीटर) में वॉल्यूम वर्णमिति निर्धारण में इस्तेमाल किया Micromoles tyrosine जारी समकक्ष ढलान समीकरण से प्राप्त की संख्या में ले लो और यह MLS, जो हमारे मामले में 11mls है में परख की कुल मात्रा से गुणा. फूट डालो तीन अन्य मात्रा द्वारा इस मूल्य: परख, जो हम 10 मिनट के लिए दौड़ा के समय के लिए, एंजाइम की मात्रा परख में इस्तेमाल किया, जो (है 1ml उपयोग) विविध था, वर्णमिति पता लगाने में इस्तेमाल किया मिलीलीटर की मात्रा है, जो हो सकता है अपने क्युवेट के आधार पर अलग. हम mls 2 इस्तेमाल किया. Tyrosine की Micromoles मिनट protease गतिविधि की पैदावार माप "इकाइयों" बुलाया में समय से विभाजित. हम मीटर और विभाजक में मात्रा की माप के लिए इकाइयों को रद्द कर सकते हैं, इकाइयों / एमएल के मामले में एंजाइम गतिविधि का एक measurment छोड़ने. आदेश में एक ठोस protease एंजाइम मंदक पतला नमूने में गतिविधि को निर्धारित करने के लिए, हम इस परख में मिलीग्राम / एमएल मूल इस्तेमाल किया ठोस एकाग्रता द्वारा इकाइयों / मिलीलीटर में हमारे गतिविधि, विभाजित हमें इकाइयों मिलीग्राम / के मामले में गतिविधि के साथ जा रहा . इकाइयों / मिलीलीटर एंजाइम इकाइयों मिलीग्राम / ठोस = _____________________ मिलीग्राम ठोस / मिलीलीटर एंजाइम

Discussion

हम बस तुम कैसे protease गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए सिग्मा सार्वभौमिक protease गतिविधि परख का उपयोग कर दिखाया है. इसके अलावा, इस परख करने के लिए सुनिश्चित करें कि हमारे proteases ठीक गतिविधि निर्धारित किया है इससे पहले कि आप उन्हें अपने प्रयोगों के लिए प्राप्त करने के लिए उपयोगी है. जैसा कि आप देखा है, जब इस प्रक्रिया कर रही है, यह सर्वोच्च महत्व का है दोनों कैसिइन और tyrosine समाधान गर्मी धीरे धीरे और नहीं उन्हें फोड़ा करने के लिए याद है. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है दोनों अपने मानकों के लिए और प्रत्येक परीक्षण के नमूने है कि आप के लिए अलग कारतूस तैयार है.

Materials

Protease	Sigma-Aldrich	P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate	Sigma-Aldrich	P5504
Casein	Sigma-Aldrich	C7078
Trichloroacetic Acid	Sigma-Aldrich	T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent	Sigma-Aldrich	F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous	Sigma-Aldrich	S2127
Sodium Acetate, Trihydrate	Sigma-Aldrich	S8625
Calcium Acetate	Sigma-Aldrich	C1000
L-Tyrosine, Free Base	Sigma-Aldrich	T3754
Protease Profiler Kit	Sigma-Aldrich	PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit	Sigma-Aldrich	PF0100