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Biology

No específico de Sigma Ensayo de actividad de la proteasa - La caseína como sustrato

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

Las proteasas rompen los enlaces peptídicos. En el laboratorio, a menudo es necesario medir y / o comparar la actividad de las proteasas. No específico de Sigma ensayo de actividad de la proteasa puede ser utilizado como un procedimiento normalizado para determinar la actividad de las proteasas.

Abstract

Las proteasas rompen los enlaces peptídicos. En el laboratorio, a menudo es necesario medir y / o comparar la actividad de las proteasas. No específico de Sigma ensayo de actividad de la proteasa puede ser utilizado como un procedimiento normalizado para determinar la actividad de las proteasas, que es lo que hacemos en nuestros procedimientos de control de calidad. En este ensayo, la caseína actúa como sustrato. Cuando la proteasa que estamos probando digiere la caseína, el aminoácido tirosina es liberado junto con otros aminoácidos y fragmentos peptídicos. Reactivo de Folin y Ciocalteus fenol, o Folin es principalmente reacciona con la tirosina libre para producir un cromóforo de color azul, que es cuantificable y se mide como un valor de absorbancia en el espectrofotómetro. La tirosina más que se libera de la caseína, más los cromóforos que se generan y más fuerte es el de la actividad de la proteasa. Los valores de absorción que genera la actividad de la proteasa se compara con una curva patrón, que se genera mediante la reacción de cantidades conocidas de la tirosina con el reactivo FC correlacionar los cambios en la absorbancia con la cantidad de tirosina en micromoles. De la curva estándar de la actividad de las muestras de la proteasa se puede determinar en términos de unidades, que es la cantidad de micromoles de equivalentes de tirosina liberada de la caseína por minuto.

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Protocol

Antes de comenzar el ensayo, hay que asegurarse de que los siguientes reactivos se preparan correctamente:

  1. Una de potasio 50 mM tampón fosfato, pH 7,5. Prepare con 11,4 mg / ml de fosfato de potasio dibásico, trihidrato en agua purificada y ajustar el pH con HCl 1M. Esta solución se coloca a 37 ° C antes de su uso.
  2. Un 0,65% peso / volumen caseína solución preparada mezclando 6,5 mg / ml de caseína en el tampón fosfato 50 mM de potasio. Poco a poco aumentó la temperatura de la solución con agitación suave a 80-85 º C durante unos 10 minutos hasta una dispersión homogénea se logra. Es muy importante que no hierva la solución. El pH se ajusta si es necesario con NaOH y HCl.
  3. A 110 mM solución de ácido tricloroacético, preparado por dilución de una 1:55 acciones 6.1N con agua purificada. El ácido tricloroacético es un ácido fuerte y debe ser manejado con cuidado.
  4. 0,5 mM de Folin y Ciolcaltea, o reactivo Folin Fenol, que es la solución que reacciona con la tirosina para generar un cambio de color mensurables que se relaciona directamente con la actividad de las proteasas. Reactivo Folin fenol es un ácido y debe manejarse con cuidado.
  5. A 500 mM de carbonato de sodio solución preparada con 53 mg / ml de carbonato de sodio anyhydrous en agua purificada.
    Una solución diluyente enzima, que consta de 10 mM de tampón acetato de sodio con acetato de calcio 5 mM, pH 7,5, a 37 ° C. Esta solución es lo que usamos para disolver las muestras sólidas de la proteasa o soluciones diluidas de la enzima.
  6. 1,1 mM de L-tirosina Solución madre del estándar. Elaborado a partir de 0,2 mg / ml de L-tirosina en agua purificada y se calienta suavemente hasta que la tirosina se disuelve. Al igual que con la caseína, no hervir esta solución. Que la norma L-tirosina para enfriar a temperatura ambiente. Esta solución se diluye aún más para hacer que nuestra curva estándar.
  7. Proteasa solución. Inmediatamente antes de su uso, se disuelven en la solución diluyente de la proteasa enzimas preparada en el paso 6.

Si es necesario, utilice una muestra sólida de la proteasa actividad predeterminada, que se disuelve con un diluyente de la enzima a 0,1-0,2 unidades / ml. Esta solución sirve como un control positivo para el ensayo de control de calidad y la validación de los cálculos que se realizan para determinar la actividad enzimática.

Configuración del ensayo de la proteasa y las curvas de calibración

  1. Para comenzar este ensayo, encontramos viales adecuados que contendrá alrededor de 15 ml. Para cada enzima que se pondrá a prueba, 4 viales son necesarios. Un vial se utilizará como un espacio en blanco, y otros tres se utilizará para ensayar la actividad de tres diluciones de la proteasa. Tres diluciones son útiles en la comprobación final de los cálculos el uno contra el otro.
    1. Para cada conjunto de cuatro viales, añadir 5ml de nuestra solución de caseína al 0,65%. Dejar que se equilibre en un baño de agua a 37 ° C durante unos 5 minutos.
    2. Añadir la variación de volúmenes de solución de enzima que se pondrá a prueba a tres de los viales de prueba de muestra, pero no el blanco. Mezclar por agitación e incubar a 37 ° C durante diez minutos exáctamente. La actividad de la proteasa y la liberación consiguiente de la tirosina durante este tiempo de incubación es de lo que va a ser medido y comparado entre las muestras de prueba.
  2. Después de esta incubación de 10 minutos, agregue el 5 ml del reactivo de TCA a cada tubo para detener la reacción. A continuación, agregue un volumen adecuado de solución de enzima a cada tubo, hasta el blanco, por lo que el volumen final de solución de enzima en cada tubo es de 1 ml. Esto se hace para tener en cuenta el valor de absorción de la enzima en sí y para asegurarse de que el volumen final en cada tubo es igual. Se incuban las soluciones a 37 ° C durante 30 minutos.


    Durante esta incubación de 30 minutos, es posible que desee configurar su diluciones estándar de tirosina. Use 6 viales DRAM (DRAM viales pueden ser sustituidos por tubos de polipropileno) que puede contener 8 ml. A los seis viales, añadir los 1,1 mM soluciones de tirosina de patrón con los siguientes volúmenes de la MLS: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. No agregue ningún estándar de tirosina en el espacio en blanco. Niveles más bajos puede ser necesaria para las muestras de prueba impuros que los cambios sean poco de color. Una vez que la solución estándar de tirosina se ha añadido, añadir una cantidad adecuada de agua purificada a cada una de las normas para obtener un volumen de 2 ml.
  3. Después de la incubación de 30 minutos, filtrar cada una de las soluciones de prueba y el espacio en blanco con un 0,45 m de polietersulfona filtro de jeringa. La filtración es necesaria para eliminar cualquier insolubles de las muestras.
    1. Añadir 2 ml de la filtración de las muestras de ensayo y en el filtrado de 4 viales de DRAM que puede contener un mínimo de 8 ml. El mismo tipo de vial en el que las normas fueron preparadas se pueden utilizar.
    2. A todos los viales que contienen las normas y estándares en blanco, agregar 5ml de carbonato de sodio. Para obtener mejores resultados, añadir 1 ml de reactivo Folin inmediatamente después.
    3. Agregar carbonato de sodio para regular cualquier disminución del pH creado por la adición de reactivo Folin de la.
    4. Agregar carbonato de sodio a las muestras de prueba y test en blanco. Estas soluciones se nublan después de la adición de carbonato de sodio. Añadir el reactivo Folin es el que va a reaccionar principalmente con tirosina libre.
    5. Mezclar los viales dram por agitación e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
    Después de esta incubación, se debe notar que las normas tienen una gradación de color en correlación con la cantidad de tirosina añadido, las mayores concentraciones de tirosina que aparecen más oscuras. También puedes notar el cambio de color apreciable en las muestras de nuestra prueba. 2mls de estas soluciones se filtran utilizando una jeringa de 0,45 m de polietersulfona filtro en las cubetas adecuadas. Ahora que se realiza el ensayo, se puede proceder a la espectrofotómetro para grabar nuestros valores de absorbancia.

Medir la absorbancia y cálculo de la actividad enzimática

  1. La absorbancia de las muestras se mide con un espectrofotómetro con una longitud de onda de 660 nm. La trayectoria de la luz se encuentra a 1 cm. Registre los valores de absorbencia de los estándares, en blanco estándar, las muestras de prueba diferentes, y en blanco de ensayo. Una vez que todos los datos han sido recogidos, la curva estándar se pueden crear. Con el fin de generar la curva, la diferencia en la absorbancia entre el blanco estándar y debe ser calculado. Este es el valor de absorbancia atribuible a la cantidad de tirosina en las soluciones estándar. Después de este cálculo simple, crear la curva estándar utilizando un programa de graficación para trazar el cambio de absorbancia de los estándares en el eje Y, frente a la cantidad de micromoles por cada uno de los cinco niveles en el eje X.

    Volumen de estándar tirosina uMoles tirosina
    0.05 0.055
    0.10 0.111
    0.20 0.221
    0.40 0.442
    0.50 0.553
  2. Después de los puntos de datos han sido ingresados, generará una línea de mejor ajuste y la ecuación de la pendiente correspondiente.


    Buscar el cambio de absorbancia en las muestras de ensayo mediante el cálculo de la diferencia entre la absorbancia de la muestra de ensayo y la absorbancia del blanco de prueba. Insertar el valor de absorción de una de las muestras de prueba en la ecuación de la pendiente y la resolución dará lugar a la micromoles de tirosina liberada en esta reacción proteolítica particular. Para obtener la actividad de la enzima en unidades por / ml, realice el siguiente cálculo:


    (Umole equivalentes de tirosina liberada) x (11)
    Unidades / ml Enzima = __________________________________________

    (1) x (10) x (2)


    11 = Total de volumen (en mililitros) de ensayo
    10 = Tiempo de ensayo (en minutos) de acuerdo con la definición de unidad
    1 = Volumen de la enzima (en mililitros) de la enzima que se utiliza
    2 = volumen (en mililitros) utilizados en la determinación colorimétrica


    Tome el número de equivalentes de tirosina liberada micromoles obtenidos a partir de la ecuación de la pendiente y se multiplica por el volumen total de la prueba en la MLS, que en nuestro caso es 11mls. Dividir este valor por tres otras cantidades: el tiempo del ensayo, que duró 10 minutos, el volumen de enzima utilizada en el ensayo, que fue variado (vamos a usar 1 ml), el volumen de mililitros utilizados en la detección colorimétrica, que puede variar en función de su cubeta. Se utilizó 2 ml.
  3. Micromoles de tirosina dividido por el tiempo en minutos de medición de los rendimientos de la actividad de la proteasa llamado "unidades". Podemos cancelar las unidades de medida de volumen en el numerador y el denominador, dejando una de Medidas de la actividad enzimática en términos de unidades / ml. Con el fin de determinar la actividad en una muestra de la proteasa sólido diluido en un diluyente de la enzima, dividimos nuestra actividad en las unidades / ml de la concentración de sólidos utilizados en este ensayo originalmente en mg / ml., Dejándonos con la actividad en términos de unidades / mg .


    Unidades / ml de enzima
    Unidades / mg sólido = _____________________

    mg sólidos / ml enzima

Discussion

Acabamos mostrado cómo analizar la actividad de la proteasa utilizando universales de Sigma ensayo de actividad de la proteasa. Además, este ensayo es útil para asegurar que nuestros proteasas se han determinado con precisión la actividad antes de que usted los reciba para sus experimentos. Como se ha visto, cuando se hace este procedimiento, es de suma importancia recordar que el calor tanto de la caseína y las soluciones de tirosina lentamente y no a hervir. Además, es fundamental para preparar los espacios en blanco diferente para ambos sus estándares y para cada muestra de prueba que usted tiene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

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References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
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Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

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