Çevresel Kaynaklardan Gelen Bakterilerin Gram Boyanması

1. Örnek Koleksiyonu

1. Toprak örneği toplayın ve mikrobiyal analiz için laboratuvara taşıyın.
2. Laboratuvarda 10 g'lık bir numuneyi analitik terazi kullanarak tartın.
3. Numuneyi 1:10 oranında 95 mL fosfat tamponlu tuzlu suya (10 kısım toprak, 5 kısım sulu sıvıya eşdeğerdir) seyreltin ve karıştırmak için girdap yapın (Şekil 2, Adım 1).
4. mL başına en az 10^-5 g toprağa kadar müteakip 1:10 seyreltme gerçekleştirin ve seçilen seyreltmeleri iki veya üç kopya halinde düşük besinli bir agar ortamına yayın ( örneğin , R2A) (Şekil 2, Adım 2-3).
5. Plakaları oda sıcaklığında bir hafta boyunca inkübe edin (Şekil 2, Adım 4).
6. İzolasyon için bir veya iki koloni seçin ve taze agar plakalarına sürün (Şekil 3, Adım 1-3).
7. Çizgi plakalarını oda sıcaklığında iki ila üç gün inkübe edin (Şekil 3, Adım 4).

2. Bakteriyel Yaymaların Hazırlanması

1. İzole koloniler için çizgi plakalarını gözlemleyin.
2. Her bir smear hazırlığını hazırlamak için, bir aşılama halkasını etanole batırın, alevle sterilize edin ve önceden temizlenmiş cam slaytların ortasına 1 ila 2 ilmek dolusu steril damıtılmış su yerleştirin.
3. Aşılama döngüsünü daha önce tarif edildiği gibi tekrar sterilize edin. Soğuduktan sonra, izole edilmiş tek bir koloniden az miktarda kültürü çıkarın ve slayt üzerindeki su damlacıkları ile karıştırın (smear seyreltilmiş yağsız süte benzemelidir). Aşılama döngüsü, koloni izolasyonundan önce soğutulmalıdır. Çok sıcak bir döngü, koloninin ve/veya ortamın sıçramasına neden olur ve bu da bakterilerin aerosolleşmesine yol açabilir. Genel olarak, döngü kullanım için çok sıcak olduğunda, agar veya koloniye uygulandığında bir "tıslama" sesi duyulacaktır. Döngünün uygun olmayan şekilde soğutulması, kültürden slayta transferin daha az verimli olmasına ve hücre morfolojisinin bozulmasına neden olabilir.
4. Lekeyi sürgünün yüzeyine yaklaşık 2,5 cm x 2,5 cm ölçülerinde yayın ve kurumaya bırakın. Havayla kurutmanın laminer akış koşulları altında gerçekleşmesi önemlidir. Lekeyi bozmamak için slaytlar fön ile kurutulmamalıdır. Ayrıca, hücre morfolojisini korumak için slaytlar alevle kurutulmamalıdır.
5. Kuruduktan sonra, slaytı 2-3 kez alevden hızlı bir şekilde geçirerek lekeyi ısıyla sabitleyin. Hücre morfolojisinin bozulmasını ve/veya cam sürgünün hasar görmesini önlemek için sürgü alevde sabit tutulmamalıdır.

3. Gram Boyama

1. Temiz bir mandal kullanarak sürgüyü bir ucundan sabitleyin.
2. Smear'ı kristal viyole (birincil leke) ile örtün ve 2 ila 3 dakika bekleyin.
3. Slaytı damıtılmış suyla dikkatlice yıkayın. Cam slaytın hasar görmesini ve/veya ayrılmasını önlemek için su akışı lekeye yönlendirilmemelidir.
4. Smear'ı Gram'ın iyotuyla örtün ve 2 dakika bekleyin, ardından slaytı suyla nazikçe durulayın.
5. Leke artık slayttan yıkanmayana kadar% 95 etanol kullanarak lekenin rengini giderin (bu, lekenin kalınlığına bağlı olarak genellikle 20 saniyeden fazla sürmez), ardından hemen damıtılmış suyla durulayın. Bu adım, yanlış bir Gram leke atamasına (, yani Gram değişkeni) yol açabilecek slaytın aşırı renginin açılmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
6. Karşı lekeyi (safranin) lekeye ekleyin ve 30 saniye bekleyin. Ardından slaytı damıtılmış suyla nazikçe durulayın ve emici kağıt kullanarak kurulayın.

4. Slaytların mikroskobik gözlemi

1. Düşük ( ör. , 4X veya 10X), yüksek kuru ( örneğin , 40X) ve yağa daldırma (100X) hedeflerini kullanarak slaytları gözlemleyin. Yağa daldırmak için, yağı doğrudan lekeye ekleyin.
2. Gram-pozitif ve Gram-negatif toprak bakterilerinin temsili sonuçları için bakınız Şekil 4 ve 5.

Şekil 2. Seyreltme ve yayma kaplama tekniği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Çizgi Plakası tekniği kullanılarak koloni izolasyonu.

Şekil 4. Gram pozitif toprak bakterisi Staphylococcus aureus.

Şekil 5. Gram negatif toprak bakterisi Escherichia coli.