How does HPLC separate components in a liquid mixture?

HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.

What is the difference between analytical and preparative HPLC?

Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.

Why is degassing the mobile phase important in HPLC?

Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.

What does the chromatogram tell you about separated components?

A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.

What is reversed-phase chromatography and when is it used?

Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.

How does gradient elution improve HPLC separation?

Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.

Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?

HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

0 görüntüleme12:58 dk

1. Mobil Aşamanın Yapılması

Yaklaşık 1,5 L arıtılmış DI suya 400 mL asetonitril ekleyerek mobil fazı hazırlayın.
Bu çözeltiye dikkatlice 2.4 mL buzlu asetik asit ekleyin.
Çözeltiyi, arıtılmış DI su ile hacimsel bir şişede toplam 2.0 L hacme kadar seyreltin. Elde edilen çözeltinin pH'ı 2.8 ila 3.2 arasında olmalıdır.
Kalibre edilmiş bir dijital pH metre kullanarak damla damla @ sodyum hidroksit ekleyerek pH'ı 4,2'ye ayarlayın. PH 4.0'a ulaştığında çok yavaş ekleyin. Bunu başarmak için yaklaşık 50 damla almalıdır.
Çözeltinin gazını almak ve kromatografik kolonu tıkayabilecek katıları uzaklaştırmak için mobil fazı vakum altında 0,47 μm Naylon 66 membran filtreden süzün. Kolonun girişindeki sabit fazda bir boşluğa neden olabilecek veya dedektör hücresine girerek UV absorbansında kararsızlığa neden olabilecek bir kabarcık oluşmasını önlemek için mobil fazın gazından arındırılması önemlidir.

2. Bileşen Çözümlerinin Oluşturulması

Yapılması gereken üç bileşen kafein (0.8 mg/mL), potasyum benzoat (1.4 mg/mL) ve aspartamdır (L-aspartil-L-fenilalanin metil ester) (6.0 mg/mL). Bu konsantrasyonlar, aynı şekilde seyreltildikten sonra, standartları soda numunelerinde bulunan seviyelere getirir.

500 mL'lik hacimsel bir şişeye 0,40 g kafein ekleyin, ardından DI su ile 500 mL işaretine kadar seyreltin.
500 mL'lik hacimsel bir şişeye 0.70 g benzoat ekleyin, ardından DI su ile 500 mL işaretine kadar seyreltin.
100 mL'lik hacimsel bir şişeye 0,60 g aspartam ekleyin, ardından DI su ile 100 mL işaretine kadar seyreltin. Depolama sırasında ayrışmayı önlemek için bu çözeltiyi buzdolabına koyun.

3. 7 Standart Çözümün Yapılması

Üç bileşenin tümünün farklı dağılım katsayıları vardır, bu da her birinin her iki faz ile nasıl etkileşime girdiğini etkiler. Dağılım katsayısı ne kadar büyük olursa, bileşen sabit fazda o kadar fazla zaman harcar ve bu da dedektöre ulaşmada daha uzun tutma sürelerine neden olur.

Tablo 1'deki tabloyu takip ederek, her bileşenin uygun miktarını 50 mL'lik hacimsel bir şişeye pipetleyin.
Stok çözeltilerinin her birini, mobil fazlı hacimsel şişeler üzerindeki 50 mL işaretine kadar seyreltin.
Her standart çözeltiyi bir numune rafındaki etiketli küçük şişelere dökün.
Numune raflarını, kalan çözeltilerle birlikte 50 mL hacimsel şişelerde bir buzdolabında saklayın.

4. HPLC sisteminin başlangıç ayarlarını kontrol etme

Atık hattının bir atık konteynerinde olduğunu ve mobil faza geri dönüştürülmediğini onaylayın.
Mobil fazın akış hızının 0,5 mL/dk olarak ayarlandığını doğrulayın. Bu, tüm tepe noktalarının 5 dakika içinde elüte olmasına izin verecek kadar yüksek ve güzel çözünürlüğe izin verecek kadar yavaştır.
Minimum ve maksimum basıncın ve akış hızının, solvent dağıtım sisteminin (pompa) ön panelinde doğru değerlere ayarlandığını doğrulayın.
1. Minimum basınç ayarı: 250 psi (bu, bir sızıntı meydana gelirse pompayı kapatmak içindir).
2. Maksimum basınç ayarı: 4.000 psi (bu, bir tıkanıklık oluşursa pompanın kırılmasını önlemek içindir).
Boşluğu ayarlamak için dedektörün ön panelindeki "sıfır"a basın (boş, saf mobil fazdır).
100 μL'lik bir şırıngayı deiyonize su ile durulayın, ardından analiz edilecek çalışma standartlarından birinin birkaç hacmi ile durulayın ve şırıngayı bu çözelti ile doldurun. İlgilenilen her bir bileşenin tepe noktasını belirlemeye izin veren 3 tek bileşenli örnekle başlayın.

5. Numuneyi manuel olarak enjekte etme ve veri toplama

Enjektör kolu yük konumundayken, septum portundan yavaşça 100 μL çözelti enjekte edin.
Veri toplama programının 300 saniye boyunca veri toplayacak şekilde ayarlandığını doğrulayın, bu da 3 tepe noktasının tümünün dedektörden geçmesi için yeterli zaman sağlar.
Denemeye başlamaya hazır olduğunuzda, enjektör kolunu enjeksiyon konumuna çevirin (numuneyi mobil faza enjekte eder) ve hemen bilgisayar veri toplama programında "Denemeyi Başlat"a tıklayın. 1-3 arası standartlar için, çalışma sırasında ekranda üç ardışık tepe noktasından yalnızca biri görünür (Şekil 1).
300 saniye geçtikten sonra, veri toplama veri dosyasını kaydetmek için bir istem gönderir. Verileri uygun bir dosya adı altında kaydedin (, ör. , STD#1).
Bu bileşeni tanımlamak için kullanılan her denemenin zirve noktası için saniye cinsinden süreyi not edin.
Şırıngayı septumdan çıkarın ve ilk çalıştırmadan itibaren belirlenen kromatogram başına aynı süreyi kullanarak kalan çalışma standartlarının her biri için işlemi tekrarlayın.

Şekil 1. 3 bileşenin kromatogramı. Soldan sağa, bunlar kafein, aspartam ve benzoattır.

6. Diyet gazlı içecek örnekleri

Diyet Kola, Diyet Pepsi ve Kola Sıfır "bilinmeyenler" dir. Kabarcıklar HPLC sistemi için iyi olmadığı için karbonatlaşmadan kurtulmak için gece boyunca açık kaplarda bırakıldılar. Bu, numunelerdeki herhangi bir gazdan yeterince kurtulur.

Plastik bir şırıngaya yaklaşık 2 mL diyet soda çekin.
Filtre ucunu yerine çevirerek Luer-Lok aracılığıyla şırıngaya takın.
Şırıngadaki sıvıyı filtreden geçirin ve küçük bir cam şişeye itin. Bu, ayırma kolonunu potansiyel olarak tıkayabilecek istenmeyen partiküllerden kurtulur.
Her numuneyi eşit miktarda DI su ile seyreltin, böylece P saflıkta olurlar.
Numuneden 100 μL'yi numune döngüsüne enjekte edin ve standartlarla aynı parametrelerle denemeler yapın.

7. Hesaplamalar

Bileşen çözeltilerinin konsantrasyonlarından, 7 numune için yapılan seyreltmelere dayalı olarak standartlardaki tüm bileşenlerin konsantrasyonunu hesaplayın.
Her standart ve bilinmeyen numuneler için kromatogramlardaki tepe alanlarını, tepe yüksekliğinin 1/2 yükseklikteki genişlikle çarpımına eşit olan üçgen yöntemle belirleyin (Şekil 2). Her bir bileşenin kendi tepe noktasını göstermesi için geçen süreye bağlı olarak hangi tepe noktasının her bir bileşene karşılık geldiğini belirledikten sonra, bu tepe alanlarını bir bilgisayar elektronik tablosuna girin.
Her üç bileşen için de standartlarda tepe alanı ve konsantrasyon (mg/L) kalibrasyon eğrileri oluşturun.
Her kalibrasyon eğrisi için uygun olan en küçük kareleri belirleyin.
Numuneler için HPLC denemelerinden gösterilen tepe alanlarından diyet gazlı içeceklerdeki her bir bileşenin konsantrasyonunu hesaplayın. Diyet sodanın HPLC sistemine enjekte edilmeden önce 2 kat seyreltildiğini unutmayın.
Diyet gazlı içeceklerdeki her bir bileşenin mg / L cinsinden miktarını hesaplayın.
Sonuçlara dayanarak, 12 oz'luk bir soda kutusunda bulunan her bir bileşenin miligramını hesaplayın. 12 oz = 354.9 mL olduğunu varsayalım.

Şekil 2. Bir eğrinin çarpılacak olan tepe yüksekliği ve genişliğinin temel bir örneği (tepe yüksekliği çarpı 1/2 yükseklikte genişlik).