1. Mobil Aşamanın Yapılması
2. Bileşen Çözümlerinin Oluşturulması
Yapılması gereken üç bileşen kafein (0.8 mg/mL), potasyum benzoat (1.4 mg/mL) ve aspartamdır (L-aspartil-L-fenilalanin metil ester) (6.0 mg/mL). Bu konsantrasyonlar, aynı şekilde seyreltildikten sonra, standartları soda numunelerinde bulunan seviyelere getirir.
3. 7 Standart Çözümün Yapılması
Üç bileşenin tümünün farklı dağılım katsayıları vardır, bu da her birinin her iki faz ile nasıl etkileşime girdiğini etkiler. Dağılım katsayısı ne kadar büyük olursa, bileşen sabit fazda o kadar fazla zaman harcar ve bu da dedektöre ulaşmada daha uzun tutma sürelerine neden olur.
4. HPLC sisteminin başlangıç ayarlarını kontrol etme
5. Numuneyi manuel olarak enjekte etme ve veri toplama

Şekil 1. 3 bileşenin kromatogramı. Soldan sağa, bunlar kafein, aspartam ve benzoattır.
6. Diyet gazlı içecek örnekleri
Diyet Kola, Diyet Pepsi ve Kola Sıfır "bilinmeyenler" dir. Kabarcıklar HPLC sistemi için iyi olmadığı için karbonatlaşmadan kurtulmak için gece boyunca açık kaplarda bırakıldılar. Bu, numunelerdeki herhangi bir gazdan yeterince kurtulur.
7. Hesaplamalar

Şekil 2. Bir eğrinin çarpılacak olan tepe yüksekliği ve genişliğinin temel bir örneği (tepe yüksekliği çarpı 1/2 yükseklikte genişlik).
Kaynak: Dr. Paul Bower - Purdue Üniversitesi
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), sıvı numunelerin bileşenlerini ayırmak ve miktarını belirlemek için yaygın olarak kullanılan önemli bir analitik yöntemdir. Bu teknikte, bir çözelti (birinci faz), yüzeye bağlı ikinci bir faz ile küçük gözenekli parçacıklardan oluşan bir ambalaj içeren bir kolondan pompalanır. Numune bileşenlerinin iki fazdaki farklı çözünürlükleri, bileşenlerin kolon boyunca farklı ortalama hızlarda hareket etmesine neden olur ve böylece bu bileşenlerin ayrılmasını sağlar. Pompalanan çözelti mobil faz olarak adlandırılırken, kolondaki faz sabit faz olarak adlandırılır.
Kullanılan sabit ve/veya mobil fazın türüne bağlı olarak çeşitli sıvı kromatografi modları vardır. Bu deney, sabit fazın polar olmadığı ve mobil fazın polar olduğu ters faz kromatografisini kullanır. Kullanılacak sabit faz, 3 μm silika partiküllerine bağlanmış C18 hidrokarbon gruplarıdır, mobil faz ise elüsyon mukavemetini değiştirmek için eklenen bir polar organik değiştirici (asetonitril) ile sulu bir tampondur. Bu formda silika, suda çözünür olan ve geniş bir uygulama yelpazesi sağlayan numuneler için kullanılabilir. Bu deneyde, diyet alkolsüz içeceklerde sıklıkla bulunan üç bileşenin (yani kafein, benzoat ve aspartam) karışımları ayrılır. Üç türün bilinen miktarlarını içeren yedi hazırlanmış çözelti kullanılır ve daha sonra kromatogramları kaydedilir.
1. Mobil Aşamanın Yapılması
2. Bileşen Çözümlerinin Oluşturulması
Yapılması gereken üç bileşen kafein (0.8 mg/mL), potasyum benzoat (1.4 mg/mL) ve aspartamdır (L-aspartil-L-fenilalanin metil ester) (6.0 mg/mL). Bu konsantrasyonlar, aynı şekilde seyreltildikten sonra, standartları soda numunelerinde bulunan seviyelere getirir.
3. 7 Standart Çözümün Yapılması
Üç bileşenin tümünün farklı dağılım katsayıları vardır, bu da her birinin her iki faz ile nasıl etkileşime girdiğini etkiler. Dağılım katsayısı ne kadar büyük olursa, bileşen sabit fazda o kadar fazla zaman harcar ve bu da dedektöre ulaşmada daha uzun tutma sürelerine neden olur.
4. HPLC sisteminin başlangıç ayarlarını kontrol etme
5. Numuneyi manuel olarak enjekte etme ve veri toplama

Şekil 1. 3 bileşenin kromatogramı. Soldan sağa, bunlar kafein, aspartam ve benzoattır.
6. Diyet gazlı içecek örnekleri
Diyet Kola, Diyet Pepsi ve Kola Sıfır "bilinmeyenler" dir. Kabarcıklar HPLC sistemi için iyi olmadığı için karbonatlaşmadan kurtulmak için gece boyunca açık kaplarda bırakıldılar. Bu, numunelerdeki herhangi bir gazdan yeterince kurtulur.
7. Hesaplamalar

Şekil 2. Bir eğrinin çarpılacak olan tepe yüksekliği ve genişliğinin temel bir örneği (tepe yüksekliği çarpı 1/2 yükseklikte genişlik).
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC, bir sıvı karışımın bileşenlerini sabit bir faz ile farklı etkileşimlerine göre ayıran çok yönlü bir tekniktir.
HPLC, kolon kromatografisinin bir uyarlamasıdır. Kolon kromatografisinde, bir kolon sabit faz adı verilen mikro ölçekli boncuklarla doldurulur. Sabit faz boncukları, boncuk ile sıvı veya mobil fazda bulunan bir karışımın bileşenleri arasında bir etkileşimi indükleyen kimyasal gruplarla işlevselleştirilir. Karışım kolondan akarken, bileşenler sabit faz ile farklı şekilde etkileşime girer.
HPLC'de kolon kromatografisi, klasik kolon kromatografisine göre daha yüksek bir akış hızında ve dolayısıyla daha yüksek basınçta gerçekleştirilir. Bu, daha büyük bir yüzey alanı / hacim oranına sahip daha küçük sabit faz boncuklarının kullanılmasını sağlar, bu da sabit faz ile mobil fazdaki bileşenlerin etkileşimini büyük ölçüde artırır.
Bu video, çeşitli diyet gazlı içeceklerin bileşenlerinin ayrılmasını göstererek HPLC'nin çalışmasının temellerini tanıtacaktır.
Laboratuvarda kullanılan iki tür HPLC vardır: analitik ve hazırlayıcı. Analitik HPLC'de, cihaz küçük bir hacmin bileşenlerini tanımlamak için kullanılır ve analiz edilen numune daha sonra atık olarak atılır. Hazırlayıcı HPLC'de, cihaz bir karışımı saflaştırmak için kullanılır ve her bir bileşenin istenen bir miktarı fraksiyonlar halinde toplanır.
HPLC enstrümantasyonu bir dizi basit bileşenden oluşur. İlk olarak, solvent rezervuarlarında tutulan mobil faz, sabit bir akış hızında bir veya daha fazla pompa tarafından sisteme pompalanır. Numune, numune enjektörü tarafından mobil faz akışına enjekte edilir. Mobil faz ile seyreltilen numune, daha sonra numunenin bileşenlerinin ayrıldığı HPLC kolonuna iletilir. Bileşenler daha sonra dedektör tarafından analiz edilir ve daha sonra kullanılmak üzere fraksiyonlar halinde kaydedilir veya bir atık şişesine aktarılır.
HPLC sütunu, sistemin temel bileşenidir. Mikro ölçekli sabit faz boncukları veya kromatografi reçinesi ile paketlenmiş metal veya plastik bir silindirden oluşur. Numune karışımı, paketlenmiş parçacık yatağından sabit bir akış hızında akar ve her bileşen, akarken sabit faz ile etkileşime girer.
Bileşikler durağan faz ile farklı şekilde etkileşime girer ve bu nedenle kolonun uzunluğu boyunca dedektöre farklı bir hızda hareket eder. Bir bileşenin sütundan çıkması veya yükselmesi için gereken süreye bekletme süresi denir. Sonuç, alıkonma süresine karşı yoğunluğun bir grafiği veya bir kromatogramdır. Bekletme süresi, bileşeni tanımlamak için kullanılır. Tepe boyutu, özellikle tepe noktasının altındaki alan, ilk çözeltideki bileşiğin miktarını ölçmek için kullanılır.
Sabit faz seçimi, numune karışımındaki bileşenlerin özelliklerine bağlıdır. En yaygın olarak kullanılan sabit faz, mikro ölçekli boncuklar oluşturan ve yeterli paketleme yoğunluğuna ulaşan inert polar olmayan bir malzeme oldukları için silika boncuklardır. En yaygın HPLC türü, hidrofobik bir sabit faz kullanan, tipik olarak boncukların yüzeyine bağlanmış C18 zincirlerine sahip silika boncuklar kullanan ters fazlı kromatografidir. Bileşenler, azalan polarite sırasına göre ayrıştırılır.
Ters faz kromatografisinde kullanılan mobil faz tipik olarak su ve asetonitril gibi organik bir çözücü karışımıdır. Numuneye bağlı olarak, mobil faz, izokratik mod olarak bilinen sabit bir su ve organik çözücü oranı olarak kalabilir. Bununla birlikte, bu, yüksek su içeriği durumunda geniş zirvelere veya yüksek organik içerik durumunda üst üste binen zirvelere yol açabilir.
Mobil faz oranı, bir mobil faz gradyanı oluşturmak için ayırma sırasında doğrusal veya kademeli olarak da değiştirilebilir. Bir gradyan elüsyon, daha az polar bileşenlerin tepe genişlemesini önleyebilir, böylece ayrılmayı iyileştirebilir ve elüsyon süresini kısaltabilir.
Artık HPLC'nin temelleri ana hatlarıyla belirtildiğine göre, HPLC tekniği laboratuvarda gösterilecektir. Bu deneyde, HPLC, diyet sodanın üç ortak bileşenini ayırmak ve ölçmek için kullanılacaktır.
İlk olarak, mobil fazı hazırlamak için 1,5 L arıtılmış deiyonize suya 400 mL asetonitril ekleyin. Sonra dikkatlice 2.4 mL buzlu asetik asit ekleyin. Çözeltiyi toplam 2 L hacme kadar seyreltin. Elde edilen çözeltinin pH'ı 2.8 ile 3.2 arasında olmalıdır.
Kalibre edilmiş bir pH metre kullanarak karıştırma çözeltisine damla damla %40 NaOH ekleyerek pH'ı 4,2'ye ayarlayın.
Çözeltinin gazını almak ve kolonu tıkayabilecek katıları gidermek için mobil fazı vakum altında 0,47 μ'lik bir membran filtreden süzün. Kabarcıklar sabit fazda boşluklara neden olabileceğinden veya dedektör hücresine doğru ilerleyerek ölçümlerde kararsızlığa neden olabileceğinden, çözeltinin gazının alınması önemlidir.
Diyet gazlı içeceklerin üç tipik bileşeni olan kafein, benzoat ve aspartamdan oluşan üç bileşenli çözeltiler hazırlayın. Bu bileşen çözümleri daha sonra bilinmeyenleri belirlemek için kullanılacak standart çözümleri hazırlamak için kullanılır. 500 mL kafein ve benzoat çözeltileri hazırlayın.
100 mL aspartam bileşen çözeltisi hazırlayın. Ayrışmayı önlemek için kullanılmadığı zaman çözeltiyi buzdolabında saklayın.
Ardından, her biri farklı konsantrasyonlarda kafein, benzoat ve aspartam içeren 7 standart çözelti hazırlayın. Her bir bileşenin uygun miktarını hacimsel bir şişeye pipetleyin ve mobil faz ile 50 mL işaretine kadar seyreltin.
İlk 3 çözümün her biri, en yüksek tanımlamayı sağlamak için bir bileşen içerir. Diğer 4 çözelti, tepe yüksekliğini konsantrasyonla ilişkilendirmek için 3 bileşenin tümünün bir dizi konsantrasyonunu içerir.
Her standart çözeltiyi bir numune rafındaki etiketli bir şişeye dökün. Numune rafını numunelerle ve kalan solüsyonlarla birlikte buzdolabında saklayın.
İlk olarak, mobil fazı ve atık konteynerlerini kurun. Atık hatlarının bir atık konteynerine beslendiğinden ve mobil faza geri dönüştürülmediğinden emin olun. Giriş mobil faz hattının mobil faz kabına beslendiğinden emin olun.
Mobil fazın akış hızının 0,5 mL/dk olarak ayarlandığını doğrulayın. Bu akış hızı, tüm bileşenlerin 5 dakika içinde elüte olmasını sağlar, ancak tek tek tepe noktalarının çözünürlüğünü sağlamak için yeterince yavaştır.
Ardından, solvent dağıtım sistemi üzerindeki minimum ve maksimum basınçları doğrulayın. Bu ayarlar, sırasıyla bir sızıntı veya tıkanma durumunda pompayı kapatır.
Boşluğu ayarlamak için dedektörlerin ön panelindeki "sıfır" düğmesine basın. 100-? L deiyonize su ile şırınga, daha sonra 7 çalışma standartlarından 1'inin birkaç hacmi ile. Sonra şırıngayı bu çözelti ile doldurun. Her bir bileşenin tepe noktasını belirlemek için 3 tek bileşenli örnekle başlayın.
Ardından, enjektör kolunu yük konumuna getirerek çözeltiyi manuel olarak enjekte edin. Yavaşça 100 enjekte edin? Septum portundan L çözelti.
Veri toplama programının 300 saniye boyunca veri toplayacak şekilde ayarlandığını doğrulayın, bu da 3 tepe noktasının tümünün dedektörden geçmesi için yeterli zaman sağlar. Denemeye başlamaya hazır olduğunuzda, numuneyi mobil faza enjekte etmek için enjektör kolunu enjeksiyon konumuna çevirin. Hemen, veri toplama programında "Denemeyi Başlat" ı tıklayın. Tarama tamamlandığında, 7 standart çözümün her biri için işlemi tekrarlayın. İlk 3 standardın her biri için, 3 tepe noktasından yalnızca biri görünür. Bileşeni tanımlamak için kullanılan tepe noktasının konumuna dikkat edin.
3 diyet soda örneği seçin ve karbonatlaşmayı gidermek için gece boyunca açık kaplarda bekletin.
Gece boyunca gaz giderme işleminden sonra, her diyet sodadan yaklaşık 3 mL'yi plastik bir şırıngaya çekin. Daha sonra, şırıngaya bir filtre ucu takın ve katı partikülleri gidermek için sodayı filtreden bir cam şişeye itin.
Soda konsantrasyonunu yarı yarıya azaltmak için her numunenin 2 mL'sini 2 mL mobil faz ile seyreltin.
100 çizin ? Soda örneklerinden birinin L'sini bir şırıngaya koyun ve örnek döngüsüne enjekte edin. Denemeyi standart çözümlerle aynı parametrelerle çalıştırın. Her soda örneği için tekrarlayın.
İlk olarak, standart numunelerin tepe alanlarını bilinen konsantrasyonlarla ilişkilendirin. Bunu yapmak için, üçgen yöntemi kullanarak her standart numune için kromatograflardaki tepe alanlarını belirleyin. Genişlik yüksekliğin yarısı kadar olacak şekilde en yüksek yükseklik sürelerini hesaplayın ve bu değeri tepe alanı olarak kullanın.
Tepe alanını ve bilinen konsantrasyonları kullanarak her bileşen için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve her kalibrasyon eğrisi için uygun olan en küçük kareleri belirleyin.
Diyet gazlı içeceklerdeki her bir bileşenin konsantrasyonunu en yüksek bölgelerden hesaplayın. Gazlı içeceklerin tümünün HPLC'ye enjeksiyondan önce 2 kat seyreltildiğini unutmayın. Bu sonuçlara dayanarak, 12 oz'luk bir soda kutusundaki her bir bileşenin mg'ını hesaplayın.
Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, test edilen 3 gazlı içeceğin tümü kabaca aynı miktarda koruyucu benzoat içeriyordu. Bununla birlikte, kola ürünleri daha fazla kafein içeriyordu. Tüm bileşenler için hesaplanan değerler, üreticiler tarafından bildirilen değerlerle iyi bir şekilde ilişkilendirildi.
HPLC, çok çeşitli analizlerde kullanılan çok yönlü bir cihazdır.
HPLC genellikle peptit moleküllerini saflaştırmak için kullanılır. Bu örnekte, transmembran peptit kompleksleri hazırlandı ve daha sonra proteinleri disülfid bağları ile oksidatif çapraz bağlayarak stabilize edildi.
Proteinler daha sonra formik asit içinde çözüldü ve ters fazlı HPLC kullanılarak saflaştırıldı. Numune daha sonra iki çözücünün doğrusal bir gradyanı kullanılarak ayrıştırıldı ve saflık kütle spektrometresi ile doğrulandı.
HPLC, laboratuvarda sentezlenen organik bileşikleri tanımlamak için de kullanılabilir. Miller-Urey deneyinde, ilkel dünyadaki organik bileşiklerin abiyotik sentezi incelendi. Metan ve amonyak gibi ilkel gazlar, erken okyanusları simüle eden su içeren bir şişeye verildi. Daha sonra ilkel dünyadaki şimşekleri taklit ederek elektrik deşarjı uygulandı.
Su daha sonra kütle spektrometresi ile birleştirilmiş HPLC kullanılarak analiz edildi ve bilinen amino asit standartlarıyla karşılaştırıldı. Bu deneyde 23 amino asit sentezlendi ve tanımlandı.
JoVE'nin HPLC'ye girişini yeni izlediniz. Artık cihazı çalıştırmanın ve elde edilen verileri analiz etmenin temellerini anlamanız gerekir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
Bir HPLC deneyi sırasında, yüksek basınçlı bir pompa, mobil fazı bir rezervuardan bir enjektör aracılığıyla alır. Daha sonra, bileşen ayrımı için ters fazlı C18 paketli bir kolondan geçer. Son olarak, mobil faz, absorbansın 220 nm'de ölçüldüğü bir dedektör hücresine hareket eder ve bir atık şişede sona erer. Bir bileşenin enjektör portundan dedektöre gitmesi için geçen süreye tutma süresi denir.
Bu deneyde bir sıvı kromatograf kullanılır, burada ayırma işlemi bir ters faz sütunu üzerinde gerçekleştirilir. Kolon boyutları 3 mm (id) x 100 mm'dir ve silika paketleme (3 μm partikül boyutu) C18 oktadesilsilsilen (ODS) ile işlevselleştirilmiştir. Numuneyi başlangıçta küçük bir döngüde saklamak için bir Rheodyne 6 yollu döner enjeksiyon valfi kullanılır ve valfin döndürülmesi üzerine numuneyi mobil faza sokar.
Algılama, 220 nm dalga boyunda absorpsiyon spektroskopisi ile yapılır. Bu deney, bir dedektör değişken değilse, 254 nm'de çalıştırılabilir. Dedektörden gelen veriler, bir dijital multimetre (DMM) kullanılarak ölçülen ve bir veri toplama programı ile yüklenmiş bir bilgisayar tarafından okunan bir analog voltaj çıkışına sahiptir. Elde edilen kromatogram, numunedeki her bileşen için bir tepe noktasına sahiptir. Bu deney için, her üç bileşen de 5 dakika içinde elüte olur.
Bu deney, izokratik mobil faz olarak adlandırılan tek bir mobil faz ve pompa kullanır. Ayrılması zor olan numuneler için gradyan mobil faz kullanılabilir. Bu, ilk mobil fazın esas olarak sulu olduğu ve zamanla, genel mobil faza kademeli olarak ikinci bir organik mobil fazın eklendiği zamandır. Bu yöntem, zaman içinde bu fazın polaritesini yükseltir, bu da bileşenlerin tutma sürelerini azaltır ve bir gaz kromatografı üzerindeki bir sıcaklık gradyanına benzer şekilde çalışır. Kolonun ısıtıldığı (genellikle 40 °C'ye kadar) bazı durumlar vardır, bu da ortam sıcaklığındaki bir değişiklikle ilişkili tutma süresi hatalarını ortadan kaldırır.
Ters fazlı HPLC'de, sütun sabit faz salmastrası genellikle bir C4, C8 veya C18 salmastrasıdır. C4 sütunları esas olarak büyük moleküler ağırlığa sahip proteinler içindir, oysa C18 sütunları peptitler ve daha düşük moleküler ağırlığa sahip bazik numuneler içindir.
Absorpsiyon spektroskopisi ile algılama, bileşenlerin absorpsiyon spektrumlarının tümü hazır olduğundan, ezici bir çoğunlukla tercih edilen algılama yöntemidir. Bazı sistemler, algılama yöntemi olarak iletkenlik veya amperometri gibi elektrokimyasal ölçümler kullanır.
Bu deney için mobil faz esas olarak %20 asetonitril ve %80 saflaştırılmış deiyonize (DI) sudur. Mobil fazın pH'ını düşürmek için az miktarda asetik asit eklenir, bu da silanolün sabit paketleme fazında ayrışmamış bir durumda kalmasını sağlar. Bu, adsorpsiyon zirvesini kuyruktan azaltır ve daha dar uçlar verir. Daha sonra pH, pH'ı yükseltmek ve bileşenlerin alıkonma sürelerini azaltmaya yardımcı olmak için %40 sodyum hidroksit ile ayarlanır.
Her grup, standart çözeltilerin farklı konsantrasyonlarını içeren 7 flakondan oluşan bir set kullanır (Tablo 1). İlk 3, her bir tepe noktasını tanımlamak için kullanılır ve son 4, her bileşen için bir kalibrasyon tablosu oluşturmak içindir. Kalibrasyon tablosu için 1-3 standartları da kullanılır.
| sayı | Kafein (mL) | Benzoat (mL) | Aspartam (mL) |
| 1 | 4 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 4 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 4 |
| 4 | 1 | 1 | 1 |
| 5 | 2 | 2 | 2 |
| 6 | 3 | 3 | 3 |
| 7 | 5 | 5 | 5 |
Tablo 1. Sağlanan 7 çalışma standardını hazırlamak için kullanılan stok standartlarının hacimleri (her standardın toplam hacmi 50 mL'dir).
HPLC kromatogramları, standartların kalibrasyon eğrilerine dayalı olarak tüm numuneler için 3 bileşenin her birini ölçebilir (Şekil 3).
Bu deney grubundan, bu diyet gazlı içeceklerin 12 oz'luk bir kutusunun her bir bileşenden aşağıdaki miktarları içerdiği belirlendi:
Diyet Kola: 50.5 mg kafein; 217.6 mg aspartam; 83.6 mg benzoat.
Kola Sıfır: 43.1 mg kafein; 124.9 mg aspartam; 85.3 mg benzoat.
Diyet Pepsi: 34.1 mg kafein; 184.7 mg aspartam; 79.5 mg benzoat.
Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, 3'ü de sadece bir koruyucu olduğu için kabaca aynı miktarda benzoat içeriyordu. Kola ürünleri biraz daha fazla kafein içeriyordu ve Coke Zero, bazı tatlandırıcılar için sitrik asit içerdiğinden, diğer iki gazlı içecekten çok daha az aspartam içeriyordu.
Aşağıdaki sayılar, 3 diyet gazlı içeceklerin 12 oz'luk bir kutusundaki gerçek kafein ve aspartam miktarlarıdır (Kafein içeriği Coca-Cola ve Pepsi web sitelerinden elde edilmiştir. Aspartam içeriği hem LiveStrong.com hem de DiabetesSelfManagement.com elde edilmiştir.):
Diyet Kola: 46 mg kafein; 187.5 mg aspartam
Kola Sıfır: 34 mg kafein; 87.0 mg aspartam
Diyet Pepsi: 35 mg kafein; 177.0 mg aspartam
Örnek Hesaplamalar (Tablo 2):
STD # 1'deki kafein konsantrasyonu: Kafein için bileşen çözeltisi, 500 mL = 0.500 L → 0.800 g / L = 0.800 mg / mL'ye seyreltilmiş 0.400 g kafein içeriyordu.
STD # 1, bu çözeltinin 1 mL'sini 50.0 mL
'ye seyreltti.
0.800 mg/mL * (1.0 mL / 50.0 mL) = 0.016 mg/mL = 16.0 mg/L.
STD # 2, bu çözeltinin 2 mL'sini 50.0 mL
'ye seyreltti.
0.800 mg/mL * (2.0 mL / 50.0 mL) = 0.032 mg/mL = 32.0 mg/L.
Üç kalibrasyon grafiğinden (Şekil 4) elde edilen sonuçlar aşağıdaki denklemleri verdi:
Kafein Tepe Alanı = 0.1583*[Kafein mg/L] - 0.574
Aspartam Tepe Alanı = 0.02696*[Aspartam mg/L] - 0.405
Benzoat Tepe Alanı = 0.1363*[Benzoat mg/L] - 1.192
Diyet Kola: Kafein Tepe Alanı = 10.68 = 0.1583*[Kafein mg/L] - 0.574
Enjekte edilen örnekte [kafein mg / L] = (10.68 + 0.574) / (0.1583) = 71.1 mg / L.
Numune 2 kat seyreltildiğinden, Diyet Kola 141.2 mg / L kafein içeriyordu.
12 oz kutu başına miktar = (141.2 mg / L) (0.3549 mL / 12-oz kutu) = 50.5 mg kafein / kutu.

Şekil 3. 5 standardın ve 3 numunenin HPLC kromatogramları.

Şekil 4. 3 bileşenin her biri için kalibrasyon eğrileri.

Tablo 2. Kalibrasyon eğrilerini oluşturmak için kullanılan HPLC denemeleri için veri tabloları.
HPLC, birçok uygulama için ayırma ve algılamada yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Gaz kromatografisi (GC) numunelerin gaz fazında olmasını gerektirdiğinden uçucu olmayan bileşikler için idealdir. Uçucu olmayan bileşikler arasında şekerler, vitaminler, ilaçlar ve metabolitler bulunur. Ayrıca, tahribatsızdır, bu da her bir bileşenin daha ileri analizler (kütle spektrometrisi gibi) için toplanmasına izin verir. Mobil fazlar pratik olarak sınırsızdır, bu da daha iyi çözünürlük elde etmek için pH polaritesinde değişikliklere izin verir. Gradyan mobil fazların kullanılması, gerçek denemeler sırasında bu değişikliklere izin verir.
Yapay tatlandırıcı aspartam ile ilişkili olabilecek olası sağlık sorunları konusunda endişeler var. Mevcut ürün etiketi, diyet içeceklerin içindeki bu bileşenlerin miktarını göstermemektedir. Bu yöntem, kafein ve benzoat ile birlikte bu miktarların ölçülmesine izin verir.
Diğer uygulamalar arasında sudaki pestisit miktarlarının belirlenmesi; ağrı kesici tabletlerdeki asetaminofen veya ibuprofen miktarının belirlenmesi; sporcuların kan dolaşımında performans arttırıcı ilaçların bulunup bulunmadığının belirlenmesi; ya da sadece bir suç laboratuvarında uyuşturucu varlığının belirlenmesi. Bu numunelerin konsantrasyonları ve genellikle bileşenlerin kimliği kolayca belirlenebilirken, tek sınırlama, birkaç numunenin neredeyse aynı alıkonma sürelerine sahip olabilmesi ve bunun da birlikte elüsyon ile sonuçlanabilmesidir.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved