STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Andreia Gianotti Sommer; Sarah S. Rozelle; Spencer Sullivan; Jason A. Mills; Seon-Mi Park; Brenden W. Smith; Amulya M. Iyer; Deborah L. French; Darrell N. Kotton; Paul Gadue; George J. Murphy; Gustavo Mostoslavsky

doi:10.3791/4327

Yöntem makalesi

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

26.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4327

⸱

31 Ekim 2012

Andreia Gianotti Sommer¹ , Sarah S. Rozelle¹ , Spencer Sullivan² , Jason A. Mills³ , Seon-Mi Park¹ , Brenden W. Smith¹ , Amulya M. Iyer¹ , Deborah L. French³ , Darrell N. Kotton¹ , Paul Gadue³ , George J. Murphy¹ , Gustavo Mostoslavsky¹

¹Center for Regenerative Medicine (CReM), Boston University School of Medicine, ²Department of Hematology, Children's Hospital of Philadelphia, ³Center for Cellular and Molecular Therapeutics, Children's Hospital of Philadelphia

Bu makalede

Özet

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

Özet

Dört transkripsiyon faktörleri, Oct4, Klf4 ve ektopik ekspresyonu ile, Sox2 ve cMyc, insan somatik hücre sözde indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSCs) ^1-4 üreten, bir pluripotent durum için dönüştürülebilir. Hastaya özel iPSCs embriyonik kök hücreler (EKH) çevreleyen ve olası immün red baypas edecek etik kaygılar yoksundur. Böylece, iPSCs hastalığı modelleme çalışmaları, farmakolojik bileşikler tarama ve rejeneratif tedaviler ⁵ için oldukça dikkat çekmiştir.

Bu Yamanaka faktörler ⁶ kodlayan bir tek vergilendirilebilir polisistronik lentiviral Kök Hücre Kaseti (STEMCCA) kullanılarak farklı akciğer hastalıkları olan hastalardan alınan transgeni içermeyen insan iPSCs üretimi göstermiştir. Bu IPSC çizgiler deri fibroblastları, yeniden programlanması için en yaygın olarak kullanılan hücre tipinden elde edildi. Normal olarak, fibroblastlar elde hücrenin genişlemesi punch biyopsi ardından bir cilt gerektirirBirkaç pasajlar için kültür s. Önemli olarak, grup halinde iPSCs ^7-9, insan periferik kan hücrelerinin yeniden programlanması bildirilmiştir. Bir çalışmada, STEMCCA vektörünün bir Tet indüklenebilir versiyon kan hücreleri eşzamanlı olarak ters tetrasiklin Transaktivatörü kodlayan bir yapısal olarak aktif lentivirüs ile enfekte edilmesi için gerekli olan, ⁹ kullanılmıştır. Fibroblastlar tersine, periferik kan hücrelerinin büyük ölçüde hastanın rahatsızlık ve sıkıntı azaltarak, minimal invazif yoluyla toplanabilir. Kurucu bir tek vergiye tabi vektör kullanarak kan hücreleri yeniden programlama için basit ve etkili bir protokol daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknolojisi uygulama hızlandırabilir. Bundan başka, periferal kan hücrelerinin yeniden programlanması deri biyopsileri kaçınılmalıdır (örn. Anormal yara) ya da bağlı olarak önceden var olan hastalık durumlannın preventi için gereken bireyler dan iPSCs üretilmesine olanak tanırpunch biyopsi için ng erişim.

Burada yapısal 4 faktörleri ifade eden bir tek floxed-vergiye tabi lentiviral vektörü kullanılarak periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) insan iPSCs üretimi için bir protokol göstermektedir. Yeni toplanmış ve çözülmüş olan PBMC STEMCCA lentivirüs ile transdük önce olduğu gibi ortam içeren askorbik asit, ^10,11 tarif 9 gün, SCF, IGF-1, IL-3 ve EPO için genişletilir. Hücreler daha sonra MEFS üzerine kaplanır ve ESC gibi koloniler iki hafta sonra enfeksiyon canlandırılabilir. Son olarak, seçilen klonlar genişletildi ve pluripotency işaretleri SSEA-4, Tra-1-60 ve Tra-1-81 ekspresyonu açısından test edilmiştir. Bu protokol kan kolayca erişilebilir 4 ml insan iPSCs üretimi için güvenilir bir yöntem sağlayan, basit, güçlü ve son derece tutarlıdır.

Protokol

1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izolasyonu ve Genişletme

GÜN 0

Sodyum sitrat içeren bir BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp içine periferik kan 4 ml çizin. Tüp 8-10 kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 30 dakika için 1800 x g'da santrifüjlenir. İdeal olarak, bu adımı toplama 2 saat içinde yapılmalıdır.
Steril bir 15 ml konik santrifüj tüpüne buffy coat (jel bariyeri ve plazma arasındaki hücre tabakası) pipetleme mononükleer hücre (MH) toplayın. 15 dakika 300 x g santrifüj ile birkaç kez, invert steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 ml toplam hacmi getirmek.
Steril PBS içinde 10 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve hücre sayımı ile yerine getirir. 10 dakika boyunca 300 xg'de steril 15 ml konik santrifüj tüpü ve santrifüj içine 1 2x10 ⁶ hücre aktarın.
Genişleme ortam, 2 ml (EM) (içinde tekrar süspansiyon hücreleri 50 ug / ml içeren Asco QBSF-60 Kök Hücre Ortarbic asit, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml, IGF-1, 1 uM Deksametazon ve 100 ug / ml primocin ya da% 1 pen / strep) ve aktarma bir iyi bir 12-kuyulu plakanın. _% 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.
300 x kalan hücreleri santrifüjleyin % 10 DMSO içeren FBS 10 dk ve donma ~ 2x10 ⁶ hücre / flakon için g.
PBMC kullanılarak dondurulmuş protokol başlamak için, 10 dakika boyunca 300 xg'de QBSF orta ve santrifüj 10 ml içine hücre 1 vial eritin. EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12-kuyulu plakanın iyi bir transfer. _% 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.

GÜN 3 ve 6. GÜN

Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
10 dakika için 300 x g'da hücre santrifüjleyin.
EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12 de bir transfer-Plaka. _% 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.

2. STEMCCA Lentivirus ile PBMC'ler ve İletimi

GÜN 9

Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
10 dakika için 300 x g'da hücre santrifüjleyin.
5, ug / polybrene ve STEMCCA lentivirüs ml içeren taze EM, 1 ml hücre yeniden süspanse edin (MOI = 1-10) ve bir 12-kuyulu plakanın de bir transfer. (Lentiviral parçacıklarının üretim tarif protokol bulunabilir http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
90 dakika için 25 ° C'da 2,250 rpm'de plaka Spin.
Spin sonra, taze EM ilave 1 ml ekleyin ortam, 2 ml toplam olarak 5 ug / ml polybrene ihtiva eden ve 37 ° C de inkübe plaka,% 5 CO ₂ inkübatör.

10. GÜN

Steril bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
10 dakika için 300 x g'da hücre santrifüjleyin.
EM 2 ml hücreler yeniden süspanse edin ve bir 12-kuyulu plakanın 1 iyi transfer. _% 5 CO2 kuluçka makinesi, 37 ° C de hücreler inkübe edin.

3. Kaplama MEFS üzerine Hücreleri transdüklü

GÜN 11

Coat 2x10 ⁵ hücre az% 0.1 jelatin ve plaka inaktive fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) ile / iyi MEF orta (IMDM% 10 FBS,% 1 Temel Olmayan Amino Asitler içeren, 100 mcM β-bir 6-plaka kuyu merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml primocin ya da% 1 Pen / Strep.) Infeksiyon başına 3 kuyu hazırlayın.

GÜN 12

Bir steril 15 ml konik tüpe transfer hücreleri ve yapışık hücrelere toplamak QBSF-60 Kök Hücre Orta 1 ml bir kez iyice yıkayın.
10 ng / ml bFGF, ve askorbik asit ve EM kullanıldığı gibi aynı konsantrasyonlarda, büyüme faktörü içeren MEF orta 3 ml hücreler yeniden süspanse edin, orta (50 ug / ml Askorbik Asit, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml, IGF-1, 1 uM deksametazon).
Levha 1 hücreleri ml başına iyi MEFS ihtiva eden bir 6-kuyulu plakanın. / Kuyu ortamı 2.5 ml toplam bFGF, askorbik asit ve büyüme faktörleri ile MEF ortam 1.5 ml ilave edilir.
25 500 rpm'de döndürme tabağı ° C'de 30 dakika süre ile. 37 ° C,% 5 _CO2 kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin.

GÜN 14

10 ng / ml bFGF ve 50 mg / ml Askorbik Asit (hiçbir büyüme faktörleri) içeren MEF medyanın 2,5 ml Yem hücrelerini her geçen gün. Aspire ve her besleme ile yüzen hücreler atın.
Olarak (genellikle haftada bir kez) ihtiyaç duyulan ek MEFS ekleyin.

p "> ~ GÜN 20

Bir kez küçük koloniler yem hücreler insan embriyonik kök hücre (hESC) orta (DMEM/F12 içeren% 20 Knockout Serum Değiştirme,% 1 Temel Olmayan Amino Asitler, 100 mcM β-merkaptoetanol, 2 mM L-Glutamine 2 ml ile günlük, görünür , 100 ug / ml primocin ya da% 1 Pen / Strep ve 10 ng / ml bFGF).

4. Toplama ve IPSC Klonların Genişletme

~ GÜN 30 - 40

12-plaka inaktive MEFS / iyi hESC orta 1 ml artı Stemolecule Y27632 (ROCK inhibitörü) 10 uM içeren önceden seeded bireysel kuyularda her koloni seçin.
Yalnızca hESC orta (hayır ROCK inhibitörü) 1 ml bundan sonra günlük hücreleri besleyin.

5. Pluripotency Markers için İmmünofloresan Boyama

Boyama Millipore gelen kit "ES Hücre Marker örnek Kiti" kullanılarak ve üreticinin protokolü takip yapıldı.

6. INTEG eksizyonunominal STEMCCA Vektör

Kaset yeniden programlanması eksizyonu Kre-IRES-Puro ifade vektörü ve transfeksiyon sonrasında ⁶ tarif edildiği gibi kısa puromisin seçim kullanılarak elde edilir.