Karaciğer metastazlarının klinik öncesi bir sıçangil modeli, hemispleen enjeksiyon tekniği ile gerçekleştirilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Karaciğer metastazları Klinik öncesi fare modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Sayısız fare modelleri, insan kanserleri çalışma ve kanser tedavisi ve kalkınma anlayışı ilerletmek için geliştirilmiştir. Burada, sinjenik mürin pankreas tümörü hücreleri hemispleen enjeksiyon ile karaciğer metastazlarının klinik öncesi, kemirgen pankreatik tümör modeli tarif edilmektedir. Bu model, karaciğere metastatik hastalığı olan hastalarda klinik durumların bir çoğu taklit eder. Fareler sürekli metastatik sürecinin incelenmesi, deneysel tedavi test ve tümör immünoloji araştırma için izin karaciğer metastazı gelişir.
Giriş
Pankreas duktal adenokarsinom (PDA) Amerika Birleşik Devletleri 1 kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedenidir. Metastatik PDA hastalar için beş yıllık sağkalım% 2-12 1'dir. Pankreas kanseri için adjuvan kemoterapi ve bugün her zamankinden daha etkili olmasına rağmen, hala yeni tedaviler için umutsuz bir ihtiyaç duyulmaktadır.
Yeni tedavilerin geliştirilmesi güvenilir klinik öncesi hayvan modellerinde gerektirir. , Deri altı tümör modelleri kullanmak için basit olmasına rağmen, dezavantajları, insan kanserlerinde görülen tümör ilerlemesi ve mikroçevrelerde metastaz taklit etmek için, bu tümörlerin yetersizlik içerir. Bu p53 ve Kras knock-onkojenik mutasyonların (KMG modeli) 2 ve bir soy YFP izleyicinin (PKCY model) KMG modeli içeren genetik olarak fare gibi genetik olarak modeller, 3 immunocompete doğal olarak oluşan tümörlerin çalışma için izin verirnt farenin. Buna ek olarak, tümör mikro değiştirilmemiş ve daha yakın insan tümör progresyonu görülene benzemektedir. Ne yazık ki, tümör gelişim zamanlaması zor deneysel tedavilerin çalışma yapar, bu model, içinde değişkendir. Ayrıca, bu farelerin geriye dönük melezleştirme zaman ve her zaman mümkün değildir, finansal bağlılık, önemli bir miktarda enerji gerektirmektedir. Son olarak, implante ksenogreft PDA fare modelleri değişmiş fareleri, ya da yoktur tümör mikroçevrelerde immünokompromize gerektirecek. Bunun bir sonucu olarak, bu klinik öncesi modellerinde ortaya deneysel tedavilerin etkinliği sıklıkla insan klinik deneylerinde 4 tekrarlanabilir değildir.
Bu hemisplenectomy fare modeli C57BL / 6 farelerinin 5, 6 türetilmiş bir çok tümörijenik, metilkolantren kaynaklı pankreatik tümör hücre soyu olan Panc02 tümör hücrelerini kullanır. Ayrıca, diğer sıçangil PDA hücre çizgileri KMG mikrofon türetilmişE Bu modelde kullanılabilir. Schulick ve ark. Önce bir hemisplenectomy tekniğini geliştirmiş ve kolon kanseri metastazı 7 genden fare modeli oluşturduk. Bu hemisplenectomy modeli (Şekil 1) yeni terapötik ajanların 7-10 soruşturma için borç verme bağışıklığı farelerde tutarlı ve eşit tümör aşılama sunuyor.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına uyduğu, ve hayvanlar Laboratuarı Değerlendirme ve Bakımı Akreditasyon (AAALAC) Derneği kurallarına uygun olarak muhafaza edildi. Cerrahi işlem on beş saatte hava değişim minimum giren bir ameliyathanede steril koşullar altında gerçekleştirilir. Tüm cihazlar, işlem sırasında önce, her bir fare arasında% 70 etanol ile işlem ve tekrar otoklav ile sterilize edilir. Cerrahi prosedürü hayatta beklenmemektedir bütün fareler anestezi altında ise hala sonra servikal dislokasyon yapılmıştır 3 dakika boyunca CO2 altında kurban edilmiştir.
1. Hücre Hazırlanması
- 2 x10 7 hücre / ml fosfat tamponlu tuzlu su içinde kültürlenmiş hücrelerin tekrar Panc02 ve buz üzerinde tutun.
2. Fare Hazırlık
- Ketamin yönetmeXylazine (10 mg / kg) ile karıştırılmıştır E (100 mg / kg) intraperitoneal olarak 8-12 hafta bölünmüş dozlarda C57BL / 6 dişi fareleri kullanıldı.
- Ayak tutam geri çekilme refleksi Fare tamamen uyuşturulduktan sağlamak için kaldırılmıştır olduğunu görmek için kontrol edin.
- Tam fareler anestezi için gerektiği kadar ksilazin (10 mg / kg) ile karıştırılmıştır Ketamin ilave dozda (100 mg / kg) uygulayın.
- Fareler anestezi altında iken kurumasını önlemek için, farelerin gözlerine Puralube Veteriner merhemi uygulanır.
- Yaranın kirlenmesini önlemek için farelerin cerrahi alan tıraş.
- Daha sonra iyot% 70 etanol ile kesi sol subcostal alanı hazırlayın.
- Sterilliği korumak için, karın çevresinde bir cerrahi örtü yerleştirin.
3. Laparotomi
- Deri yoluyla ve bir neşter kullanılarak karın zarı aracılığıyla sol kulakta doğrultusunda sol subkostal kesi yapmak.
- Eşzamanlı dijital p uygulayarak kesiden dalak ifadekesi kranial ve kaudal yönleri boyunca hava basıncı.
- Dalak alt ucunda dalak, kan damarları bulun.
- Dalak kutuplarda dalak, kan damarları zarar vermemek için dikkatli olmak dalak merkezinde iki Horizon orta boy ligatlayıcı klipleri koyarak dalak bölün.
- Kirlenmeyi önlemek için geri periton içine dalak üst kutbunu yerleştirin.
4. Tümör Enjeksiyon
- Bir 26 G x 5/8 "şırınga içine fosfat tamponlu tuzlu su, 150 ul hazırlayın.
- Enjeksiyon sırasında her zaman dik bir pozisyonda şırınga muhafaza aynı enjektöre 100 Panc02 ul (2 x10 6) hücrelerini çizin.
- % 70 etanol çözeltisi içinde iğne batırın. İğne sterilizasyonu sağlamak için% 70 etanol içinde daldırılır.
- Şırınga her zaman dik tutulur emin olarak maruz hemispleen yavaşça hücreleri enjekte edilir. Enjektörler arasında şevge dalak altında hücrelerin enjekte edilmesini önlemek için dalak kapsülü ile her zaman dikkat edilmelidir. Dalak ve kan damarlarının bir beyazlatma enjeksiyonu üzerine dikkat edilmelidir.
- Dalak yükseltmek ve dalak kan damarlarını tıkamak için dalak altında bir orta Horizon klibi geçerlidir.
- Pankreas ve dalak gemilerin en distal yönüne küçük bir Horizon klibi uygulayın.
- Horizon klipleri yukarıdaki keserek hemispleen gelen pankreas ve dalak gemilerin Arter.
- Onun 'yan fare yerleştirin ve distile su ile kesi sulamak.
Anestezi 5. Karın Kapanış ve Kurtarma
- 4-0 çalışan dikiş ile periton kapatın.
- Cilt insizyon kapatmak için iki veya üç cilt klipleri uygulayın.
- Cerrahi sonrası ağrıyı hafifletmek için 0.1 mg / kg buprenorfini veya 5-10 mg / kg Karprofen subkutan yönetmek.
- Rec için bir ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirinovery mobil kadar ve fare düzenli nefes desen göstermektedir. Hayvanlar sadece tam cerrahi kurtardıktan sonra diğer hayvanların şirkete iade edilir.
6. Nekropsi Sınav ve Karaciğer Hasat
- Cerrahi sonrası 30 ila 60 gün arasında, farenin metastaz klinik belirtileri göstermeye başlayacak ve ötenazi gerektirir. Insani ötenazi gerektiren metastatik hastalık belirtileri büyütülmüş karınlarını ve assit gelişimi bulunmaktadır. CO 2 Solunduğunda fareler Euthanize.
- Teneffüs ardından, servikal çıkık gerçekleştirin.
- Hayvan duyarlı olmayan olduğu tespit edildikten sonra, makas kullanılarak karın ortaya çıkarmak için karın zarı içinden bir kesik.
- Forseps ve makas kullanarak, yavaşça karın dışına karaciğer kesti.
- OCT bileşiği karaciğer yerleştirin ve flaş sıvı azot kullanılarak dondurmak. -80 ° C de karaciğer saklayın. Alternatif olarak, canlır gömülü 24 saat ve parafin oda sıcaklığında% 16 nötr tamponlu formalin içinde tespit edilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hemispleen içine enjekte edilen tümör hücreleri Panc02 tekniği doğru yapılması halinde akciğer ve karın zarı metastaz gözlenmez iken (Şekil 1) farelerin% 100'ünde bir şekilde karaciğer metastazı. Bu teknik çok sayıda bağımsız deneylerde Panc02 hücreleri kullanılarak yüz üzerinde fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir ve yeniden üretilebilir, tüm tedavi edilmemiş fareler hemisplenectomy prosedür (Şekil 2) takip eden 30 ila 60 gün, karaciğer metastazı ölür. Muamele edilmemiş ve edilmiş...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bir hemispleen enjeksiyon tekniği ile karaciğer, pankreas kanser metastazı bu klinik öncesi fare modeli, karaciğere metastatik hastalığı olan hastaların klinik ve immünolojik hastalıkların birçoğu aynaları tarif edilen birinci modelidir. Bu model, diğer sıçangil modellerinde fazla birkaç avantaj sunar. Farelerin sadece% 30 karaciğer ve metastaz oluşumu zamanlamasına metastazları geliştirir pankreas kanseri transjenik modelleri oldukça değişkendir farklı İlk olarak, bu model, farelerin% 100'ünde karaciğer sürekli ola...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa ilgi hiçbir ilgili çatışmaları var.
Teşekkürler
KF ve KO KS ile birlikte ilk yazarları co edilir
Bu çalışma AHPBA Kardeşliği (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Tıp Johns Hopkins Yüksekokulu Klinik Bilim İnsanı Ödülü (LZ), Virágh Vakfı ve Johns Hopkins Atla Virágh Pankreas Kanseri Merkezi (EMJ ve kısmen desteklenmiştir LZ), Ulusal Pankreas Vakfı (LZ), Lefkofsky Aile Vakfı (LZ), Gastrointestinal Kanserler P50 CA062924 yılında NCI SPORE (EMJ, LZ), Lustgarten Vakfı (LZ) ve Sol Goldman Pankreas Kanseri Merkezi hibeler (KS , BHE, LZ).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre kültürü ortamı ve bileşenleri | , hücre hattına bağlı olarak değişecektir | ||
| Fosfat Tamponlu Salin | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml santrifüj tüpleri | Corning | 430052 | |
| Kavisli Ameliyat Makası | Roboz Cerrahi Mağazası | RS-6835 | |
| Mikro Diseksiyon Graefe Forseps | Roboz Cerrahi Mağazası | RS-5130 | |
| İğne tutucu (normal) | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 veya 4-0 sütür | , cerrahi departmanının izniyle, Johns Hopkins | ||
| Weck Horizon Açık Bağlama Klipsi Uygulayıcısı, küçük, açılı | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon Açık Bağlama Klipsi Uygulayıcısı, orta, açılı | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon orta bağlama klipsi | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon küçük bağlama klipsi | Teleflex | 001200 | |
| Şırınga, 1 cc, tb şırınga, 3/8" kayma ucu | Becton Dickinson | 309625 | |
| Şırınga, 1 cc, tb şırınga, 5/8" kayma ucu | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm Otomatik Klips Uygulayıcı | Mikron | 427630 | |
| 9 mm Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | |
| Isıtma yastığı | Sunbeam | CAT93 | |
| %70 Etanol | çok sayıda satıcı tarafından satılmaktadır | ||
| Ketamin Hidroklorür | Hospira | 22395DD | |
| Ksilazin hidroklorür | Sigma | X1251 |
Kaynaklar
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
- Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
- Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
- Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
- Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
- Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
- Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390(2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
