Method Article

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

DOI:

10.3791/52056

⸱

November 6th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoklastlar kemik iliği monosit / makrofaj türetilen çok özel hücreler bulunmaktadır. Kemiğin organik ve inorganik matrisler hem emmek üzere onların sağlıyor bu iskeletin yeniden modellenmesini düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı anlamına gelir. Birlikte, osteoblastlar ve osteoklastlar kemik erimesini ve sağlık ve hastalık sırasında normal iskeleti korumak için birlikte hareket eden kemik oluşumunu hem içeren dinamik bağlantı işlemi için sorumludur.

Vücutta ana kemik-rezorbe hücre olarak, osteoclast farklılaşmasında ve işlev değişikliklerin vücudun derin etkilere neden olabilir. Değiştirilmiş osteoklast fonksiyonuna bağlı hastalıklar, daha yaygın olarak, aşırı osteoklastik kemik erimesi oluşumunu kırılma yatkınlık olan osteoporoz, patolojileri gözlenen nedeniyle hematopoez için kemik iliği boşluk oluşturmak için başarısızlık öldürücü yenidoğan hastalığın şiddeti değişebilir. ent "> in vitro yüksek sayılarda osteoklastlan izole etmek için bir yeteneği kemik yeniden çevriminin anlaşılması önemli gelişmeler için izin verdi ve bu hastalıklar ile mücadele yeni tedavi stratejilerinin keşif için yol açmıştır.

Burada, izole edilmesi ve osteoklastların sayıda verecek fare kemik iliğinden osteoclastların yetiştirmek için bir protokol açıklar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik remodeling dinamik ve kemik erimesinin 1 ile kemik oluşumu birleştirmesini kapsar. Bu sıkı düzenlenmiş süreç normal homeostasisin sırasında iskeleti korunmasından sorumlu olup, yaralanma ve hastalığa karşı.

Osteoklastlar kemik organik ve inorganik matris hem rezorbe yeteneğine sahip olan benzersiz sonunda, çok çekirdekli hücrelerdir. Osteoklastlar kemik iliği 2-5'in monosit / makrofaj elde edilir. Osteoklast fonksiyonuna veya oluşumundaki anormallikler osteoporoz gibi yaygın durumlar dahil olmak üzere klinik durumlar, çeşitli neden olabilir.

In vitro osteoklastlan oluşt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Etik deyimi: omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırmalar Laboratuvar Hayvan Bakım Stanford İdari Paneli (APLAC) tarafından onaylanan uyarınca protokoller yapıldı.

1. Hazırlık

  1. Ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı, 10 ml, 50 ml konik bir tüp içinde oda sıcaklığına gelmeye (polisükroz ve sodyum Diatrizoate içeren, 1,077 gr / ml'lik bir yoğunluğa ayarlanır) izin verin.
  2. Akış sitometrik hazırlayın (FACS) 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve% 2 fetal buzağı serumu (FCS) ile tampon. 50 ml'lik bir şişe almak ve yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı aşama esnasında kullanım için, oda sıcaklığında, bu kısım k....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemin amacı, kolay bir hafta içinde, tipik olarak, in vitro olarak, osteoklastların sayıda izole edildi. Osteoklastların sayıda başarıyla izolasyonu, tartrat-dirençli asit fosfataz lekeleme (Şekil 1A) kullanılarak teyit edilmiştir. Büyük osteoklastlar çok çekirdekli (genellikle ≥ 3 çekirdekleri) ile büyük mor hücreler olarak görülür. Bu protokolü kullanarak, osteoklast ortalama olarak 30 kadar çekirdeklerin (Şekil 1B) ile osteoklastlan izole etmek yaygındır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolayca in vitro osteoklastlann sayıda izole ve yetiştirmek için bir yetenek kemik biyoloji ve osteoklast-aracılı hastalıkların anlayışı ilerletmek için yardımcı sorumlu olmuştur. Son zamanlarda osteoklast formasyonu, farklılaşma ve canlılık 16-18 başlıca düzenleyicisi olarak tespit edilmiştir zaman, bu yol RANKL ayırdedilebilmesidir.

Kemik iliği osteoclastların in vitro kültürü ekim yoğunluğu büyük ölçüde bağımlı olan bizim deneyim oldu. Biz kemik iliği kaynaklı.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların hiçbiri beyan açıklanmasını veya çıkar çatışması vardır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz NIH hibe R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, Oak Vakfı ve Pediatrik Rejeneratif Tıp Hagey Laboratuvarı destek için minnettarım.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MEM, glutamin yok, fenol kırmızısı yokGibco51200-038
M-CSF, rekombinant fareGibcoPMC2044
Rekombinant Fare TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli eksprese edilmiş)R& D Systems462-TEC-010
Prostaglandin E2Sigma-Aldrich
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
Asit fosfataz, Lekosit (TRAP) kitiSigma-Aldrich387A
Osteoassay kemik rezorpsiyon plakaları, 24 kuyulu plakalarCorning Yaşam Bilimleri3987

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
  2. Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Osteoclast DerivationMouse Bone MarrowBone Marrow IsolationDensity Gradient SeparationTartrate Resistant StainingOsteoclast CulturingBone Resorption AssayMonocyte Macrophage LineageSkeletal RemodelingOsteoclast Differentiation

Related Articles