Yöntem makalesi

Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon

20K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54017

⸱

31 Mayıs 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Vasküler kalsifikasyon, insan kardiyovasküler hastalığının önemli bir belirleyicisi ve katkıda bulunan bir faktördür. Bu protokol, kültürlenmiş primer vasküler düz kas hücrelerinin kalsifikasyonunu indüklemek ve yakın kızılötesi floresan görüntüleme kullanarak hayvan aortlarında kalsifikasyon ve makrofaj yükünü ölçmek için yöntemleri açıklar.

Özet

Kardiyovasküler hastalıklar dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. Lipid yüklü makrofajlar ve kalsifikasyondan oluşan aterosklerotik plaklar, koroner arterlerde, aort kapağında, aort ve periferik kondüit arterlerde gelişir ve kardiyovasküler hastalığın ayırt edici özelliğidir. İnsanlarda, bilgisayarlı tomografi ile görüntüleme, vasküler kalsifikasyonun ölçülmesine izin verir; Vasküler kalsifikasyonun varlığı, gelecekteki kardiyovasküler olayların güçlü bir göstergesidir. Kardiyovasküler hastalıklarda yeni tedavilerin geliştirilmesi, aterosklerozun altında yatan moleküler mekanizmaları anlamamızı geliştirmeye kritik derecede bağlıdır. Aterosklerotik mekanizmalar hakkındaki bilgimizi geliştirmek, murin ve hücre bazlı modellere dayanmaktadır. Burada, spektral olarak farklı iki yakın kızılötesi floresan görüntüleme probu kullanılarak aort kalsifikasyonu ve makrofaj infiltrasyonunu görüntülemek için bir yöntem detaylandırılmıştır. Yakın kızılötesi floresan görüntüleme, tüm aortta kalsifikasyon ve makrofaj birikiminin ex vivo olarak ölçülmesine olanak tanır ve aterosklerozda inflamasyon ve kalsifikasyon arasındaki mekanik ilişkiyi daha iyi anlamamız için kullanılabilir. Ek olarak, hayvan aort vasküler düz kas hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir yöntem ve murin aortlarından veya insan koroner arterlerinden kültürlenmiş düz kas hücrelerinde kalsifikasyonu indüklemek için bir protokol açıklanmaktadır. Vasküler kalsifikasyonu modellemek için kullanılan bu in vitro yöntem, tedavi için yeni hedefler keşfetme umuduyla, vasküler hastalığın gelişimi için önemli olabilecek sinyal yolaklarını tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Giriş

O yılda 780.000 üzerinde ölüm hesapları nerede kardiyovasküler hastalık Amerika Birleşik Devletleri'nde olmak üzere dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedeni vardır. 1 Koroner arter kalsifikasyonu ve aort kalsifikasyon aterosklerotik hastalığın özellikleridir ve kardiyovasküler olayların güçlü belirleyicileri olarak hizmet vermektedir. 2- intimal kalsifikasyon ateroskleroza bağlı ve orta kronik böbrek hastalığı ve diyabet ile bağlantılı kalsifikasyon, (aynı zamanda, Mönckeberg olarak da bilinir) 5 intimal kalsifikasyon lipid birikimi ve makrofaj ortamda oluşur: vasküler kalsifikasyon 4 İki ana tip yetişkin bildirilmiştir. damar duvarı içine sızma. 5,6 Medial duvar kalsifikasyon, bağımsız intimal kalsifikasyon meydana elastin lifleri veya düz kas hücrelerinde lokalize ve lipid birikimi veya makrofaj infiltrasyonu ile ilişkili değildir. 5,7,8 Çalışmaları moleküler mekanizmaları üzerindeVasküler kalsifikasyon hücre bazlı ve hayvan modeli sistemlerinde yararlanmıştır. Medial kalsifikasyon için modeller matriks Gla proteini ile fareler dahil ederken atherocalcific hastalık için kemirgen modelleri, apolipoprotein E (Apo) 9,10 veya düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (LDLR) 11 yüksek yağlı diyetle beslenen ya eksik fareler dahil (MGP) eksikliği 12 veya yakınındaki total nefrektomi (5/6 nefrektomi modeli) ya da yüksek adenin diyet maruz ya üremi geliştirmek sıçanlar. 13

Burada, MGP eksikliği ile ilişkili vasküler kalsifikasyon modeli odaklanmıştır. MGP arteriyel kalsifikasyon inhibe eden bir hücre dışı bir proteindir. MGP geninde 12 mutasyon Keutel sendromu, brachytelephalangy ek olarak yaygın kıkırdak kalsifikasyon ile karakterize nadir insan hastalığı, işitme kaybı ve periferik pulmoner stenoz tespit edilmiştir. 14-18 olmasa da sık sık gözlenen, 19çoklu arter eş kireçlenme. Keutel sendromu tarif edilmiştir uncarboxylated, biyolojik olarak aktif olmayan mgp yüksek dolaşım düzeyleri kardiyovasküler mortalite tahmin ederken, insan MGP geninde 20 ortak polimorfizmler, koroner arter kalsifikasyon riski, 21-23 ile ilişkilidir. 24. İnsanlarda aksine Keutel sendromlu, MGP eksikliği fareler iki hafta başlayan ve aort rüptürü doğumdan sonra 6-8 hafta die spontan yaygın arteriyel kalsifikasyon oluşan ciddi vasküler fenotip gelişir. 12

ApoE aksine - / - ve LDLR - / - fareler yüksek yağlı diyetle beslenen, ilişkili makrofaj kaynaklı inflamasyon ile intimal vasküler kalsifikasyon geliştirmek, hangi MGP - / -. Fareler makrofajların yokluğunda medial vasküler kalsifikasyon geliştirmek 11,25 rağmen bu bulgular Sex Amaçlı altta yatan farklı uyaranlara önermekal ve medial kalsifikasyon, tümör nekroz faktörü-a ve IL-1 ve ön-osteojenik faktör gibi inflamatuar aracıları içeren vasküler kalsifikasyon katkı tespit edilmiştir kireçlenme. 26 Çoklu sinyal yollarının her iki yapı da aracılık sinyal mekanizmalarında örtüşme vardır Bu çentik Wnt ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal. 27,28 Bunlar sinyal yolları da kemik ilişkili proteinlerin ifadesini artırmak transkripsiyon faktörlerinin solucan ile ilgili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2) ve Osterix ekspresyonunu (geliştirmek . / - - ve LDLR - / - fareleri, yüksek yağlı diyet ve kendiliğinden beslenen örneğin kalsifikasyon aracılık damar sisteminde, kemik sklerostin ve alkalin fosfataz) 28-30 Biz ve diğerleri ApoE gözlemlenen vasküler kalsifikasyon göstermiştir / - - MGP gözlenen vasküler kalsifikasyon tüm kemik morfogenetik protein bağlıdır farelerin (BMP) signaling ve burada odaklanmıştır, bu yoldur. 11,25,31 BMP kemik oluşumu için gerekli olan güçlü bir osteojenik faktör, insan ateroskleroz içinde arttırılmış ekspresyon sergileyen bilinmektedir. 32-34 in vitro çalışmalar, düzenlenmesinde BMP sinyal rol var bu Runx2 olarak osteojenik faktör sentezlenmesi. BMP ligandının 35-37 aşırı ekspresyonu, BMP-2, yüksek yağlı diyet ile beslenen ApoE eksikliği olan farelerde vasküler kalsifikasyon gelişimini hızlandırır. 38 Ayrıca, bu tür inhibitörleri sinyal belirli bir BMP kullanımını / - - 39,40 ve / veya LDN-193189 (LDN) olarak ALK3-Fc hem LDLR vasküler kalsifikasyon gelişimini engeller fareler yüksek yağlı diyet ve MGP eksikliği fareler beslenen 11,25.

Vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) vasküler kalsifikasyon gelişiminde önemli bir role sahiptir. 30,41,42 gelişen vasküler kalsifikasyon MGP yoksun fareler karakteristik olanbir osteojenik fenotipi VSMC'Ierin bir transdiferansiyonun tarafından terized. Böyle Runx2 ve osteopontin olarak osteojenik belirteçleri eşlik eden bir artış ile myocardin ve alfa düz kas aktin içeren VSMC belirteçlerin azalmış ifadesi MGP sonuçlarının kaybı. Bu değişiklikler vasküler kalsifikasyon gelişimi ile örtüşmektedir. 25,43,44

Aort kalsifikasyon ve farelerde iltihap tipik olarak geç kireçlenme erken kireçlenme ve osteojenik aktivite, von Kossa ve Alizarin kırmızı boyama için alkalin fosfataz aktivitesi ve makrofaj protein belirteçlerinin (örn. Hedef immünohistokimyasal protokoller olarak histokimyasal teknikler kullanılarak değerlendirilir, CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Bununla birlikte, bu, standart görüntüleme teknikleri, örnekleme yanlılığa alıcı ve kusurlu zaman enine bölüme aort dokularının işlenmesini gerektirir ve sınırlıdır kendi inflamasyon ve calcificat sayısal yeteneğiBütün aort iyon. Bu protokol, aynı zamanda sağlanan. Görselleştirmek ve bütün aort ve orta ölçekli arteryel kalsiyum ve yakın kızılötesi floresan (NIR) moleküler görüntüleme ex vivo olarak kullanılarak makrofaj birikimini ölçmek için bir yöntem tarif hasat ve farelerden primer aort VSMC'Ierin kültürlenmesi ve uyarılması için bir yöntemdir için sıçangil ve in vitro olarak insan VSMC'Ierinin kalsifikasyon vasküler kalsifikasyon altında yatan moleküler mekanizmaların belirlenmesi. Bu teknikler, in vivo ve atherocalcific hastalığı eğitimi için in vitro yöntemleri hem araştırmacı sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

fare ile tüm çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerilerine sıkı göre yapıldı. Konut ve bu çalışmada açıklanan fareler ile ilgili tüm işlemler (Araştırma Hayvan Bakım Alt Komitesi) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri Massachusetts General Hastanesi tarafından kabul edildi. Tüm prosedürler acıyı azaltmak için özenle yapıldı.

Reaktiflerin 1. Hazırlık

  1. Tüm aortalarının Near-Infrared Floresans Görüntüleme
    Not:. Flüoresan görüntüleme probu hidroksiapatit bağlanarak 46,47 damar osteojenik aktivitesi işaretlemek için kullanılabilir yakın kızıl ötesi bir bisfosfonat türevi, bir katepsin-aktif fluoresan görüntüleme probu makrofaj proteolitik ve elastolitik aktivite için bir gösterge olarak kullanılabilir damar. 9, hem flüoresan eşzamanlı kullanımına izin için önemlidirspektral ayrıdır problar kullanın. gösterimde kalsiyum NIR katepsin faaliyete özgü yakın kızılötesi flüoresan görüntüleme probu belirtmek için kalsifikasyon özgü yakın kızılötesi flüoresan görüntüleme probu ve katepsin NIR belirtmek için kullanılacaktır.
    1. Kalsiyum NIR ve katepsin NUR çözümleri hazırlayın. üreticinin protokollerine göre, kalsiyum NIR veya katepsin NIR 24 nmol ihtiva eden şişeye 1X fosfat tamponlu salin (PBS) 1.2 ml ilave edilir ve yavaşça çalkalayın.
      Not: 2-8 ° C'de karanlıkta saklandığında Üreticiye göre, bir kez PBS ile yeniden kalsiyum NIR ve katepsin NIR çözeltiler, 14 gün boyunca sabit kalır.
  2. İzolasyon ve murin aortik VSMC'Ierin kalsifikasyonu
    1. Aort Sindirim Çözümü:
      1. 175 U / ml tip 2 kolajenaz ve 1.25 U / ml elastaz içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile yeni bir çözeltisi (~ 3-5 mi başına aorta hasat) hazırlayın. w çözüm sterilizeve 0.22 um vakum tahrik filtrasyon sistemi i kullanılana kadar buz üzerinde tutun çözeltisi.
    2. Celi Ortamı:
      1. % 10 cenin sığır serumu, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 500 ml Supplement. kullanımdan önce, 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.
    3. Kireçlenme Medya:
      1. Kalsifikasyon Ortam A (NaPhos, fare hücre çizgileri kullanılır):
        1. % 10 fetal bovin serumu, 2 mM sodyum fosfat, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile (gerektiğinde ses) DMEM 100-500 mi Supplement. kullanımdan önce, 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.

          VEYA
      2. Kalsifikasyon Ortam B (βGP / Asc / DEX, fare veya insan hücre çizgileri ya da kullanılır):
        1. % 10 fetal bovin serumu ile, 10 mM β-gliserofosfat disodyum, 50 ug / ml L-askorbik asit, 10 DMEM 100-500 mi (gerektiğinde ses) EknM deksametason, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. kullanımdan önce, 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.

2. Kuyruk Ven Enjeksiyon

  1. Kuyruk enjeksiyondan önce, 5 dakika boyunca hafif bir ısıtma lambası altında fareler ısınmaya.
  2. Bir tüp kemirgen tutucu fare kısıtlamaktadır. alkollü bir bezle kuyruk dezenfekte edin.
  3. kuyruk damar enjeksiyonu için 30 G iğne yararlanın. Kuyruk damarlar yanal yer almaktadır.
    1. iğne kuyruk içine ilerletilir olarak şırınga ileri bir basınç hafif miktarda uygulayın. Enjeksiyon direnci artık mevcut kez damar erişilir.
    2. sabit bir oranda kalsiyum NIR 100 ul ve / veya katepsin NIR 100 ul bir hacim enjekte edilir. Enjeksiyon sonunda, 5 sn'lik aradan sonra, iğneyi çıkartın.
  4. aorta (Bölüm 3), enjeksiyondan sonra 3-24 saat hasat.

3. Fare Diseksiyon

  1. 200 mg / kg intraperitonal pentobarbital enjeksiyon ile fare öldürülür.
  2. diseksiyon gemide hayvan sırtüstü yatırın ve yönetim kuruluna her pençe bantlama ile stabilize. Bir mikroskop ve küçük makas kullanarak, üst toraks alt karın uzanan bir orta hat kesi yapmak.
  3. forseps ile cilt soyma geri ve karın organları ifşa periton kaldırın. aorta transect vermemeye özen, gastrointestinal organlar çıkarın.
  4. ön diyafram bir yanal kesi yapmak ve karın boyunca kesi devam ediyor. Diseksiyon makas kullanarak, kaburga kenarlarına ile kesme ve sternum üstün kısmına yumuşak doku yapışık kaldırarak göğüs kafesi bırakın. akciğerler açığa göğüs kafesi çıkartın.
  5. ve dikkatlice akciğerlere çıkarın (belirlenmesi ve proksimal aort diseksiyon yardım) başlangıçta yerinde kalbi bırakın. bakım, ensuri ile timus, trakea ve özofagus kaldıraort bozulmadan kalmasını ng.
  6. Düz ince forseps ve mikro-diseksiyon makas kullanarak, peri-aort yağ (Şekil 1A) sökerken dikkat ederek, aort kemer iliak bifurkasyonundan aorta çevreleyen yumuşak doku kaldırmak. Aort arkı (yani, brakiyosefalik, karotis ve subklavian arterler, Şekil 1B) büyük dalları çevreleyen kalan yağ ve yumuşak doku çıkarın.
    Not: floresan görüntüleme yaparken yağ arka plan sinyalini artırabilir çünkü aorta yağ çıkarmak için önemlidir.
  7. , Göğüs boşluğunda kalp kaldırmak dikkatle proksimal aort ayrılmakta ve atın. iliak bifurkasyonundan distal aort transect. bir insülin iğne kullanarak, kalan kan hücrelerini yıkamak için aortik arktan aort içine serum fizyolojik enjekte edilir. tamamen kaldırılması, arkus damarları ile birlikte aort ayırmakvücuttan.
  8. görüntüleme için hazır olana kadar buz üzerinde normal tuzlu su çözeltisi içinde aorta yerleştirin.

4. Aort Görüntüleme

  1. Görüntü aorta ex vivo hemen yakın kızılötesi floresan yansıma görüntülemesi ile hasattan sonra. 25
    1. Daha önce tarif edildiği gibi, kalsiyum NIR ve katepsin NIR enjekte edilen farelerin aortlarından floresans sinyali yoğunluklarına ölçmek için uygun bir çok kanallı dalga boylarındaki floresans görüntüleyici ayarlayın. 25 Üreticiye göre, kalsiyum NIR ~ 650-678 nm ışığı ile uyarılmakta edilebilir ~ 680-700 nm aralığında maksimum emisyonu. Katepsin NUR ~ 770 nm maksimum emisyon ile ~ 745-750 nm ışık heyecanlı olabilir.

Primer fare aort Vasküler düz kas hücrelerinin 5. Yalıtım

  1. Yukarıda açıklandığı gibi adımlar 3.1-3.7 gerçekleştirin.
  2. diseksiyonlar tamamlanıncaya kadar soğuk HBSS aorta yerleştirin. Dikkatli bir rem kesipsadece aort bırakarak periaortik yağ ve yumuşak doku Aining.
  3. Steril doku kültürü kaputu altında, 35 mm x 10 mm doku kültürü yemekleri Aort Sindirim Çözüm aorta aktarın. yumuşak aralıklı çalkalanarak 30 dakika 37 ° C'de bir kuluçka yerleştirin. sindirim sonra, aorta uzatılmış veya yıpranmış bir görünüm sergiler.
  4. sağlam medial katmanı tutarak diseksiyon mikroskobu ve steril forseps ile, aort dış adventisyal tabakayı kaldırmak. adventisya kaldırmak için bir teknik bir ucunda aort dış katmanını uzak soyun ve çorap geri soyulmuş ve kaldırılmış olabilir gibi altta yatan medial tabakasındaki onu kaldırmaktır.
  5. Adventisya katman çıkarıldı sonra, 2-4 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, hücre kültür ortamı ve mağaza ile yeni bir doku kültürü çanağı içinde kalan aort yerleştirin.
  6. steril bir kaput ve steril 3 mm mikro diseksiyon makas kullanarak altında, geniş 1-2 mm içine aorta kestihalkalar.
  7. Aort Dijestiyon çözeltisi içeren yeni bir doku kültür tabağına, bu halkalar yerleştirin ve yumuşak aralıklı 120 dakika boyunca sallanarak 37 ° C'de inkübe edin. hücrelerin tekrar süspansiyon için bu inkübasyon sırasında çözüm yukarı ve aşağı birkaç kez pipetle.
  8. 15 ml konik tüp, sindirim çözeltisi ve transfer, sıcak hücre kültür ortamının 5 ml.
  9. Santrifüj 200 x g'de 5 dakika boyunca boru.
  10. Hücre kültür ortamı (örneğin, 5 mi) istenen hacmi içinde medya ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
  11. 25 cm 2 hücre kültürü şişesi içinde, her aortundan izole hücrelerin tüm miktarını Plate ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe edilir. Daha önce tarif edildiği gibi, kuluçka ilk 7-10 gün boyunca 25,48., Standart teknikler kullanarak hücreleri yayma ortamı her 72-96 saat değiştirin. Hücreler izdiham yaklaşırken, daha sık (her 48 saat) medya doldurmak.
    Not: yeterli nereye büyümek için birçok hafta sürebilirhücrelerin ntity.
  12. Birleşmiş sonra tripsin ile geçiş hücreleri 37 ° C'ye kadar ısıtıldı olduğundan emin olun.
    1. Her bir kültür şişesine tripsin 0.5-1.0 ml ilave edilir ve 3-5 dakika inkübe edilir; yüzeyden hücreleri ayırmak için gerektiği gibi yavaşça her 30-60 sn balonun yan dokunun.
    2. Hücreler şişe tabanından ayırmak sonra tripsin hücrelere hücre medya 10 ml. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Hücre pelet medya ve tripsin aspire. Taze hücre medya (örneğin, 5-10 mi) istenen miktarda hücrelerin tekrar (a odacık slayt aktarılır, bazı hücreler), yeni bir şişeye aktarın.
  13. Daha önce α-düz kas aktin karşı bir antikor kullanılarak, 49 tarif edildiği gibi hücre ilk geçiş de, standart immünositokimya teknikleri ile yumuşak kas hücre soyunu teyit etmektedir.

Kültür Düz Kas 6. Yaratma kalsifikasyonuhücreler

  1. Plaka hücreler 6-çukurlu formatta 5.12 den elde edilmiştir. Not: de önerilir ortalama hücre medya 2.0 ml'lik toplam hacim içinde 1 x 10 5 hücre / göz ile başlayarak.
  2. Hücreler, 6 gözlü bir levha formatında en az 7 gün boyunca kalsifikasyon Ortam A veya B büyümeye olanak sağlar. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
  3. Hücre Ortam her 48 saat değiştirin.

7. von Kossa Boyama Yöntemiyle VSMC kalsifikasyon Değerlendirilmesi

Not:. Dokular ya da kültürlenmiş hücreler hücre dışı matriks kalsifikasyonu ölçmek için von Kossa yöntemi gümüş iyonları ile fosfat bağlı kalsiyum iyonları yerine göre 50 hafif ve organik bileşiklerin varlığında, gümüş iyonları azaltılabilir ve metal olarak görselleştirilebilir gümüş. . Reaksiyona girmemiş gümüş sodyum tiyosülfat ile işlenerek 50, aşağıdaki gibi çıkanlır von Kossa boyama protokolü bulunmaktadır:

  1. Hücre cu aspire medyalture plakalar.
  2. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin 1 ml yerleştirerek hücreleri saptamak.
  3. formalin çıkarın ve 5 dakika için damıtılmış su ile sabitleştirilmiş hücreler yıkayın.
  4. 1-2 saat için 60-100 W ampul altında,% 5 gümüş nitrat çözeltisi 1 ml hücreleri inkübe edin.
  5. Gümüş nitrat solüsyonu aspire edildi ve 5 dakika için damıtılmış su ile yıkayın.
  6. 5 dakika için damıtılmış su içinde çözelti (ağ / hac),% 5 sodyum tiyosülfat 1 ml hücre yerleştirerek tepkimemiş gümüş çıkarın.
  7. 5 dakika için damıtılmış su ile hücrelerin yıkayın. Tekrarlayın yıkar 3x. Von Kossa leke standart ters ışık mikroskobu ile görüntüleme için hazırdır.
  8. İsteğe bağlı Adım: 5 dakika süreyle nükleer fast red 1ml Counterstain. damıtılmış su (her biri 5 dakika) ile üç yıkama ile takip etmektedir.

VEYA

8. Yakın kızılötesi Floresan Görüntüleme ile VSMC kalsifikasyon değerlendirilmesi

Not: kabiliyetini benzerFare aorta içinde kireçlenme tespit etmek, kalsiyum NUR kolayca kültürlü hücreler tarafından yatırılan kalsifik minerali bağlar. Uzun dalga boyu filtreleri ile bu tekniği, floresan mikroskop ve plaka okuyucuları kullanarak görüntü ve sırasıyla in vitro kalsifikasyon ölçmek olabilir. Kalsiyum NUR uzun dalga boyu emisyonu diğer özellikleri tespit etmek alt dalga boyu yayan fluorophores eşzamanlı kullanımı için izin verir. aşağıdaki gibi kalsiyum NUR boyama protokoldür:

  1. Bölüm 1.1.1 tarif edildiği gibi, kalsiyum NIR 24 nmol ihtiva eden şişeye 1x PBS 1.2 ilave edin.
  2. Kalsiyum NIR stok 1 seyreltin: 100 uygun kalsifikasyon veya kontrol medyada.
  3. Aspire hücre kültür plakaları medya ve kültür ortamı NUR içeren kalsiyum ile değiştirin.
  4. gece boyunca 37 ° C'de kalsiyum NIR ortam kültür inkübe edin.
  5. Kuyulardan medya aspire ve bir kez PBS ile kuyu yıkayın.
    Not: Bu noktada,orijinal kültür ortamı, oyuklara ilave edilebilir ve hücreler, canlı görüntülenebilir. Aksi takdirde, aşağıdaki adımlara devam edin.
  6. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin 1 ml yerleştirerek hücreleri saptamak.
  7. formalin çıkarın ve 5 dakika için damıtılmış su ile sabitleştirilmiş hücreler yıkayın. Tekrarlayın yıkar 3x.
  8. İsteğe bağlı adım. Immünofloresan boyama veya ilgi duyulan proteinlerin diğer counterstains gerçekleştirme 8,9
  9. Görüntü veya (örneğin, kalsiyum NUR 650-678 nm ışık heyecanlı olabilir) uygun floresan uyarma dalga boylarını ve emisyon filtreleri (~ 680-700 nm) kullanılarak kalsiyum NIR leke algılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

- / - Aort MGP kireçlenme ve vahşi tip fare, kalsiyum NIR floresans görüntüleme kullanılarak ölçülmüştür. Resim kalsiyum NIR sinyal kalsifikasyon yokluğu (Şekil 2) gösteren, vahşi tip farelerden aorta saptandı. Güçlü bir kalsiyum NIR sinyali ileri vasküler kalsifikasyon ile tutarlıdır MGP eksikliği olan farelerde, gelen aorta saptandı. Yabani tip ve gelen aorta doku kesitleri MGP - / - vahşi tip farelerde tespit Resim kalsifikasyonla MGP eksikliği o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Arter kalsifikasyon insanlarda kardiyovasküler hastalık için önemli bir risk faktörüdür ve kardiyovasküler olayların patogenezinde doğrudan katkıda bulunabilir. Aterosklerotik hastalığın ince fibröz kapaklar 1,5,52 intimal kalsiyum birikimi yerel biyomekanik stresi arttıran ve katkıda bulunmak için öne sürülmüştür plak rüptürü. kardiyak hipertrofi neden ve kalp fonksiyonunu etkileyebilir arteriyel sertlik, artırarak 53,54 medial kalsifikasyon etkileri klinik sonuçları. 55 Bu nedenle, ins...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Massachusetts General Hospital, BMP tip I reseptörlerinin küçük moleküllü inhibitörleri ve ateroskleroz ve vasküler kalsifikasyonu tedavi etmek için ALK3-Fc uygulaması ile ilgili patentler için başvuruda bulunmuştur ve MD, PBY, KDB ve RM telif ücreti alma hakkına sahip olabilir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sarnoff Kardiyovasküler Araştırma Vakfı (MFB ve TET), Howard Hughes Tıp Enstitüsü (TM), Harvard Tıp Okulu'ndan (DKR) Ladue Memorial Burs Ödülü, RWTH Aachen Tıp Fakültesi START Programı (MD), Alman Araştırma Vakfı (DE 1685/1-1, MD), Ulusal Göz Enstitüsü (R01EY022746, ESB), Leducq Vakfı (Kemik Morfogenetik Protein Sinyalinin Rolünü Aydınlatmak için Multidisipliner Program) tarafından desteklenmiştir. Pulmoner ve Sistemik Vasküler Hastalıkların Patogenezinde, PBY, KDB ve DBB), Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (R01AR057374, PBY), Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK082971, KDB ve DBB), Amerikan Kalp Derneği Fakülte Üyesi Ödülü #11FTF7290032 (RM) ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL114805 ve R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ml konik tüpFalcon352096
30 G iğneBD305106
Alfa düz kas aktin antikoruSigmaSAB2500963
Odası slaytıNunc Lab-Tek154461
Kollajenaz, Tip 2 WorthingtonLS004176
DeksametazonSigmaD4902
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta Yaşam Teknolojileri11965-084
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin, kalsiyumGibco14190-144
ElastazSigmaE1250
Fetal sığır serumuGibco16000-044
Forseps, ince noktaRobozRS-4972
Forseps, tam eğri tırtıklıRobozRS-5138
Formalin (%10)ElektronMikroskobu Bilimleri15740
Hank'in Dengeli Tuz ÇözeltisiGibco14025-092
İnsan koroner arter düz kas hücreleriPromoCellC-12511
İğneli insülin şırıngasıTerumoSS30M2913
L-askorbik asitSigmaA-7506
Mikro diseksiyon yaylı makas (13 mm)RobozRS-5676
Mikro diseksiyon yaylı makas (3 mm)RobozRS-5610
NIR, katepsin (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR, osteojenik (OsteoSense-680EX)Perkin ElmerNEV10020EX
Normal SalinHospira0409-4888-10
Nükleer hızlı kırmızıSigma-AldrichN3020
Odyssey Görüntüleme SistemiLi-CorOdyssey 3.0
Penisilin / StreptomisinCorning30-001-CI
Gümüş nitrat (% 5)Ricca Kimya Şirketi6828-16
Sodyum fosfat dibazik heptahidratSigma-AldrichS-9390
Sodyum tiyosülfatSigmaS-1648
ß-gliserofosfat disodyum tuzu hidratSigmaG9422
Doku kültürü şişesi, 25 cm2Falcon353108
Doku kültürü plaka (35 mm x 10 mm)Falcon353001
Doku kültürü plakası, altı kuyuluFalcon353046
TripsinCorning25-053-CI
Tüp kemirgen tutucuKent ScientificRSTR551
Vakum tahrikli filtrasyon sistemiMillipore SCGP00525

Kaynaklar

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098(2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889(2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aortik Kalsifikasyon G r nt lemeYak n K z l tesi Floresan G r nt lemeFare Aortik D z Kas H creleriKalsifikasyon Medyumu nd ksiyonuVon Kossa BoyamaKuyruk Venine EnjeksiyonAortik Digestiyon Sol syonuMakrofaj nfiltrasyon De erlendirmesiImageJ Kantifikasyonu

İlgili makaleler