Name: Kompleks Biyolojik örnekler seçerek glikozile Peptitler zenginleştirin lektin HPLC Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Öğrenin, insan plazmasından glikozile peptitleri lektin konjuge POROS boncukları ve HPLC kullanarak zenginleştirme yöntemini. Bu teknik biyobelirteç keşfi çalışmalarında kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kanser girişimi, 5U24CA126477-04 Klinik Proteomik Technologies tarafından desteklenmiştir.

1) lektin-konjuge Poros sütun hazırlayın <ol><li> Poros-AL boncuk adımları 1.1 - 1.2 sırasında inhalasyon karşı korumak için bir maske koyun. Poros boncuk istenilen miktarda (100 mg beads/300 ul son hacim) tartılır ve temiz bir Eppendorf tüp içine aktarmak. </li><li> 1 ml fosfat tamponlu salin (PBS) eklenmesi ile boncuk yıkayın. Pelet boncuk, 3 dakika boyunca maksimum hızda bir mikrosantrifüj santrifüj. Süpernatantı ve yıkama tekrarlayın. </li><li> Indirekt lektin istenen miktarda (1 - 4 mg / 200 ul boncuk) tartılır ve temiz bir Eppendorf tüp transfer. 5 formu için PBS - 20 mg / ml. Bu çözüm Rezerv 25 ul. </li><li> Poros boncuk kalan lektin çözüm aktarın. Nihai konsantrasyonu 50 mM sodyum cyanoborohydride ekleyin. Bir rocker tüp yerleştirin ve oda sıcaklığında bir gece tepki. (Not: sodyum cyanoborohydride toksik ve davlumbaz ele alınması gereken Kontamine atıklar uygun şekilde bertaraf edilmelidir.) </li><li> Pelet Poros boncuk adım 1.2 &#39;deki gibi. Süpernatantı ve sonrası konjugasyon çözüm olarak kaydetmek. </li><li> Boncuk 1 ml Quenching Buffer (1 M Tris-Cl, pH 7.4) ile yıkayın. Adım 1.2 ve güvenli bir şekilde Pelet boncuk supernatant atın. </li><li> 1 ml Quenching Tampon Poros boncuk kalan reaktif siteleri engelleme. Nihai konsantrasyonu 50 mM sodyum cyanoborohydride ekleyin. Bir rocker tüp yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Pelet adım 1.2 gibi boncuk ve supernatant atın. </li><li> Boncuk, 1 mL 1 M NaCl ile yıkayın. Pelet boncuk ve supernatant atın. Beş yıkama olmak üzere toplam dört kez tekrarlayın. Boncuk paketi hazır. </li><li> Poros boncuk konjuge protein miktarını belirlemek için, bir protein konsantrasyonu tahlil öncesi konjuge ve post-konjuge lektin çözümleri uygulayın. Konsantrasyonlarda fark boncuklar konjuge protein miktarı. Boncuk hacim başına konjuge protein miktarı boncuklar lektin konsantrasyonu eşittir. Hedef lektin konsantrasyonları 2 -20 mg / ml arasında. </li></ol> 2) bir PEEK sütuna lektin-konjuge Poros boncuk Paketleme <ol><li> (Açıklaması) paketleme sistemi kurma ve bir metal halka standı destek. Paketleme sistemi, alttan üst basınç kısıtlayıcı, sonunda sütun elemanı 1, frit, kolon (2 x 50 mm), son sütun coupler 2, sütun konektörü, son sütun elemanı 3, kolon (4.5 x 50 mm), son sütun coupler 4 ve son montaj. Üst kolon ambalaj materyalleri için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. </li><li> Tampon istenilen hacmi Poros boncuk yeniden süspanse (10 mM Tris tamponu, pH 7.4, 150 mM sodyum klorür, 10 mM kalsiyum klorür, 10 mM magnezyum klorür). Eğer ambalaj 400 ul Tampon A. tekrar süspansiyon bir sütun (~ 200 ul yatak hacmi) </li><li> Üst kolon (rezervuar) konjuge Poros boncuk aktarın. Tampon sütunun üst ulaşıncaya kadar rezervuar Bir Bellek ekleyin. Yavaşça, sütun hava kabarcıklarını önlemek için çalışıyoruz, sütun üstüne son montaj yerleştirin. HPLC sistemi üst sütunun sonuna uydurma bağlayın. </li><li> Tampon sistem üzerinden akan sütun paketleyin. 0.5 ml / dak akış hızı ile başlayın. 4 mL / dak veya maksimum basınç (3000 psi) ya ulaşıncaya kadar akış hızı 0.5 ml / dk her dakika artırın. Mümkün olan en yüksek akış hızında Buffer en az 35 ml A sütunu sayesinde geçene kadar devam edin. </li><li> Pompaların kapatın ve &lt;20 psi düşmesi sütun üzerindeki baskıyı izin. </li><li> Yavaşça, üstten başlayarak, paketleme sistemi sökmeye. Son sütun coupler 2 ulaşıldığında, dikkatli bir şekilde kaldırın. Bazı paketlenmiş malzeme sütun üst ekstrüzyon olmalıdır. Bir jilet veya benzer keskin kenar hafifçe sütun üstüne bile bir boncuk yüzeyinde bırakarak, ekstrüzyon boncuk silerek temizleyin. Bunu yaparken boncuklar basınç uygulama yapmayınız. </li><li> Halka standından dolgulu kolon ayırın. Yeni bir bitiş bağlaştırıcısına yeni bir frit yerleştirin ve açık (eski üst) sütun ucunda frit / bitiş coupler ile bağlamak için dolgulu kolon ters çevirin. </li><li> Sütunu uygun şekilde etiketleyin. Artık kullanıma hazırdır. 6 aya kadar, sütun 4% 0.02 sodyum azid ° C ile PBS içinde saklanabilir olabilir. </li></ol> 3) Program HPLC yöntemi <ol><li> HPLC programlama ayrıntıları üretici yazılım özelliklerine göre değişecektir. Biz bir Michrom Paradigma MG4 HPLC kullanın. Bu makine üzerinde, ekranın üst kısmında yöntemleri inşa ve &quot;Setup&quot; sekmesi altında erişilebilir. Programı aşağıdaki yöntemi: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Zaman </td><td> Akış hızı (ul / dak) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> 10 mM Tris tamponu, pH 7.4, 150 mM sodyum klorür, 10 mM kalsiyum klorür, 10 mM magnezyum klorür: arabelleğe Tampon B: 0,5 M asetik asit 280 nm UV detektör 0:00 ile 19:50 okumak için programlanabilir olmalıdır. - 50 AU y ekseni düşük absorbans seviyeleri, örneğin, 0 algılamak için ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> Otomatik örnekleyici, program fraksiyon toplanması için aşağıdaki programa ise. Aksi takdirde, kromatografi performans zaman belirtildiği gibi elle kesirleri toplamak. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Kesir </td><td> Numune enjeksiyon toplama gecikme </td><td> Toplama süresi (dakika) </td></tr><tr><td> Flow-through </td><td> 2,8 </td><td> 4,1 </td></tr><tr><td> Bağlı </td><td> 9 </td><td> 2,6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) HPLC için örnek hazırlayın <ol><li> Bu protokolü kullanmak için önce, insan plazma MARS sütun (Santa Clara, CA Agilent) kullanarak 14 en bol proteinler tükenmiş olmalıdır. Tüketilmiş plazma, insan laktoferrin ve maya invertaz ayrı ayrı tripsin sindirilir ve önceden 1&#39;de açıklandığı gibi, desalted olmalıdır . </li><li> Lektin özel laktoferrin standart hazırlamak için, Bölüm 3 yöntemi kullanarak AAL veya SNA sütun üzerinde 50 ug tripsin-sindirilmiş laktoferrin kromatografi gerçekleştirin. Bağlı fraksiyonu lektin özel laktoferrin glikopeptid içerecektir. Bölüm 6 Kısım 4.4 &#39;te gibi örnekleri ve desalt nötralize eder. Çıkan örnek kullanıma hazırdır, 1 ml Tampon A. örnek tekrar </li><li> Üç deneysel yapılacaktır çoğaltır. Üç numune hazırlamak için çoğaltır, 30 ul MARS-tükenmiş, tripsin-sindirilmiş, plazma benzerleri (PE), tripsin sindirilir invertaz 3 pmol ve lektin özel laktoferrin (ya AAL-LAC veya SNA-LAC) 1 ul ekleyin. PE işlenmiş plazma (MARS yetersizliği ve tripsin sindirilir) belirli bir miktar elde edildiği non-processed/intact/original plazma hacmi olarak tanımlanır. 330 ul son bir hacme ulaşmak için örnek bir Tampon ekleyin. </li><li> Eluat toplayacak numune şişeleri, nötralizasyon tampon (1 M Tris pH: 8.0) ekleyin. Sizinle birlikte çalışmaktan şişeleri sayısı ve hacmi, sizin otosampler kısıtlamaları bağlıdır. MG4 Paradigma için, bir flakon flow-through ve iki eluat toplamak toplar. Yaklaşık 1.5 ml Tris tampon eluat 1 mL nötralize gerekecektir. Hedef nötralize pH 7,0-8,0; pH indikatör kağıdı ile test test nihai pH. </li></ol> 5) kromatografisi gerçekleştirin <ol><li> Izleyen tüm boş ve örnek çalışır Bölüm 1&#39;de anlatılan yöntemi kullanın. Sütun ve tamponlar, kullanım sırasında oda sıcaklığında. Tamponlar oda sıcaklığında saklandığında ise sütunlar, 4 ° C&#39;de saklanır. </li><li> HPLC sistemi ya AAL veya SNA lektin sütununda takın ve iki boş yöntemleri (sadece Tampon enjekte A) çalıştırın. Lektin sütun lektin özel laktoferrin (Bölüm 2) uygun olduğundan emin olun. </li><li> Toplam 7 HPLC çalışır, her enjekte örnek arasında boş bir enjekte üç plazma numuneleri kromatograflanır. Boş çalışır Kesirler toplanmasına gerek yoktur. </li></ol> 6) Desalt toplanan fraksiyonları Her bir kısmı aşağıdaki gibi bir 1 ml Waters Oasis HLB SPE kartuş kullanmak için: <ol><li> Vakum manifoldunun için gerekli kartuşları takın. </li><li> Her bir kartuş% 1 formik asit 1 ml% 80 ACN (20 lnHg manifoldu vakum göstergesi 5 okumalısınız) ile ıslatın. </li><li> 1.5 ml 0.1% Formik asit (20 lnHg manifoldu vakum göstergesi 5 okumalısınız) ile kartuşları dengelenmesi </li><li> Bir kartuş (- 2,5 lnHg ve akış hızı 1 ml / dk geçmemelidir manifoldu üzerinde Vakum göstergesi 2 okumalısınız) üzerine bir örnek tüm hacim yükleyin </li><li> 3 x 1 ml% 0.1 formik asid (20 lnHg manifoldu vakum göstergesi 5 okumalısınız) ile kartuşları yıkayın </li><li> 1 x 1 ml% 0.1 formik asit% 80 asetonitril içine Zehir peptidler / glikopeptid Eppendorf tüpleri etiketli. Tek bir toplama tüpü her kartuş için kullanılmalıdır (2.5 lnHg, ve akış hızı 1 ml / dk geçmemelidir manifoldunun üzerine Vakum göstergesi 2 okumalısınız.) </li><li> Her bir toplama tüpüne 60 ul 0.5 M amonyum bikarbonat ekleyerek eluat nötralize. Hedef nötralized pH 7,0-8,0; pH indikatör kağıdı ile test nihai pH. </li><li> ~ 2 saat 35 ° C (örneğin, Thermo Savant SpeedVac) bir vakum santrifüj çalışan tarafından yıkandı, peptidler / ~ 50 mcL glikopeptid Konsantre </li></ol> 7) PNGase F-sindirim. <ol><li> Emin olmak için test örneği pH 7,0 - 8,0 arasındadır. Gerekirse, 50 mM pH artırmak için amonyum bikarbonat ekleyin. Ul 50-100 arasında olduğu kadar son örnek hacmi&gt; 100 ul, speedvac örneğidir. </li><li> 37 ° C gecede her bir numune tüpü ve inkübe ul 0.5 (250 U) gliserol-PNGase F ekleyin. </li></ol> 8) Zip İpucu örnekleri <ol><li> PNGase F-sindirilmiş örnekleri ile başlayarak, aşağıdaki gibi her biri ziptip. </li><li> 10 ul 100% asetonitril, 10 ul% 80 asetonitril,% 0.1 formik asit takip Islak ziptip. </li><li> 20 ul% 0.1 formik asite ziptip dengeye. </li><li> Ziptip matris üzerinden 10 kat yukarı ve aşağı pipetleme ziptip üzerine örnek yükleyin. </li><li> 10 ul% 0.1 formik asit, 5 kez pipetleme ziptip yıkayın. </li><li> 10 ul% 80 asetonitril,% 0.1 formik asit ile temiz bir Eppendorf tüp içine örnek Zehir. </li><li> Elüsyon tekrarlayın ve aynı tüpe ikinci 10 ul eklemek. </li><li> &lt;2 ul bir ses örnekleri Speedvac. </li><li> 20 ul% 0.1 formik asite süspanse edin örnekleri. Örnekleri LC-MS/MS analiz için hazır. </li></ol> 9) Temsilcisi Sonuçlar: 20 mg / ml - Poros konjugasyon genellikle 2 aralığında on-boncuk lektin konsantrasyonları elde edilir. Bu afinite kromatografisi için en uygunudur. Tripsin sindirilir MARS-tükenmiş insan plazma lektin kromatografi genellikle bağlı bir fraksiyon olarak glikopeptid zenginleştirir. Glikopeptid PNGase önce LC-MS/MS F-tedavi olarak, N-bağlantılı bir konsensüs sırası ile peptitler olarak tanımlanır asparajin dönüştürülür edildiği NXS / T (burada X herhangi bir kalıntı ama prolin), PNGase F. Peptitler eylem yoluyla bu özelliklere sahip bir aspartik asit deglycosylated peptidler (veya &quot;deglycopeptides&quot;) olarak kabul edilir. Bağlı bir fraksiyon olarak ele peptidlerin% 30-50 deglycopeptides ise ortalama akış-through (FT) AAL veya SNA kromatografisi fraksiyonu,% 2-4 oranında deglycopeptides bulunur. Tipik olarak, bir QStar Elite kullanarak, 1000-1300 peptidler FT fraksiyonu tespit olacak ve 200-400 peptidler bağlı bir fraksiyon olarak tespit edilecektir. İki veya daha fazla farklı Invertase deglycopeptides FT fraksiyonu ve bağlı fraksiyonu (Tablo 1) iki veya daha fazla farklı laktoferrin deglycopeptides dikkat edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tablo 1" /> Tablo 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Bu protokol, glikopeptid glukanıdır özel bir şekilde izole etmek ve tanımlamak için hızlı bir yöntem sağlar. Glikozilasyon geliştirme ve patogenezi sırasında bir organizmanın içinde yaygın olarak değişir, bu teknik sorular geniş bir yelpazede adresi için geçerli olabilir. Özellikle, kanser ilişkili epitoplar biyomarker keşfi yolunda bir ilk adım olarak modifiye edilmiş glikopeptid seçici zenginleştirmek için yöntem kullanıyor.

<table><tbody><tr><td>İnsan plazması</td><td></td><td></td><td>Bunu kurum bünyesinde hazırlıyoruz.</td></tr><tr><td>İnsan laktoferrini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Kullanmadan önce tripsin ile sindirin</td></tr><tr><td>Maya invertazı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Kullanımdan önce tripsinle sindirin</td></tr><tr><td>Oass HLB SPE kartuşları</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>1 cc hacim</td></tr><tr><td>ZipTip pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, 10 ml'lik pipet için C18</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99.7%</td></tr><tr><td>pH ayraç kağıdı</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Aralık 0-14</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99.9%</td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Gliserol içermeyen</td></tr><tr><td>Vakum filtrasyon balonları</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>0,2 mm gözenekler</td></tr><tr><td>POROS-AL boncukları</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;EM (Elektron Mikroskobu)&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; lektin</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; aglütinin</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum siyanoborohidrür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>5,0 M çözelti</td></tr></tbody></table>

kompleks biyolojik örnekler seçerek glikozile peptitler zenginleştirin lektin hplc yöntemi

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glukanlardır post-translasyonel modifikasyonlar önemli bir sınıf vardır. Genellikle salgılanır ve hücre dışı moleküller üzerinde bulunan, glukanıdır yapıları, hücrenin iç durum sinyali. Tümör hücreleri üzerinde glukanlardır bol miktarda sialik asit ve fucose moieties sahip olma eğilimindedir. Biz, bu kanser ilişkili glukanıdır varyantları erken evre hastalık teşhis amacıyla biyomarker geliştirme için istismar edilmesi öneriyoruz. Buna göre, biz bir kitle lektinleri belirli glukanıdır yapıları bağlayan proteinleri oluşan yakınlık matrisleri kromatografi içermektedir spektrometresi tabanlı iş akışı geliştirdi. Sırasıyla, sialik asit ve fucose bağlayan lektin Sambucus nigra (SNA) ve Aleuria aurantia (AAL), kovalent Poros boncuk (Uygulamalı Biyosistem) birleştiğinde ve yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) PEEK sütunlar halinde dolu. Kısaca, bir çok ilgisi temizleme sistemi (Agilent MARS-14) kullanarak ondört en bol bulunan proteinlerin plazma tükenmiş oldu. Tüketilmiş plazma tripsin-sindirilir ve akış yoluyla ve SNA veya AAL HPLC bağlı fraksiyonları ayrılır. N-bağlı glukanlardır kaldırmak için kesirler PNGaseF ile tedavi ve QStar Elite LC-MS/MS tarafından incelendi. Veriler Maskot yazılımı kullanılarak analiz edildi. Deneysel tasarım kontrolleri fucosylated ve sialylated olumlu dahil insan laktoferrin glikopeptid ve Saccharomyces negatif kontroller yüksek mannoz glikopeptid cerevisiae lektin yakalama özgüllüğü izlemek için kullanılır. Bu iş akışının temel özellikleri glikoprotein standartlar kullanılarak HPLC biçimi, kendi deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifleri yakalanan ve tedavi edilen PNGaseF glikopeptid olumlu kimlik ve kalite değerlendirmesi türetilen tekrarlanabilirlik. Protokolü optimizasyonu da uygun sütun kapasitesinin malzeme başlayan, en verimli yakalama ve yıkama tamponları tespit ve tam deglycosylation emin olmak için PNGaseF tedavi izleme oranının tespitinde dahildir. Gelecek yönde meme kanseri hastalarında ve kontrol bireylerin plazma kütle spektrometresi tabanlı keşif deneyler gerçekleştirmek için bu iş akışını kullanarak.

Lektin-konjuge Poros boncuk HPLC için istihdam edildi. Glikopeptid standartları, pozitif ve negatif kontroller olarak görev yaptı. MARS-14 tükenmiş, tripsin-sindirilmiş insan plazma Kromatografi ve flow-through (FT) ve bağlı kesirler ESI-LC-MS/MS analizler için toplanmıştır. FT&#39;ye göre glikopeptid bağlı fraksiyon zenginleştirilmiş.

Kompleks Biyolojik örnekler seçerek glikozile Peptitler zenginleştirin lektin HPLC Yöntemi

Glikanlar, önemli bir translasyon sonrası modifikasyon sınıfıdır. Genellikle salgılanan ve hücre dışı moleküller üzerinde bulunan glikan yapıları, ... sinyalini verir.

Bu prosedür, insan plazmasından spesifik olarak glikozillenmiş glikopeptitleri izole eder. Plazma, peptitler ve glikopeptit glikopeptit standartlarından oluşan bir karışım elde etmek için tripsin ile sindirilir. Lektin kromatografisi için pozitif ve negatif kontroller plazmaya eklenir.Numuneye yüksek basınçlı sıvı kromatografisi tabanlı lektin afinite kromatografisi uygulanır. Kullanılan lektinler sırasıyla fuko ve siyalik asite bağlanır; peptitler ve ilgisiz glikopeptitler ise akış yolu fraksiyonu ile kolondan elüye olur. Bağlı fraksiyonu kolondan elüye etmek için asetik asit kullanılır.Bu, özellikle modifiye edilmiş glikopeptitler için zenginleştirilmiştir. Merhaba, ben California Üniversitesi San Francisco, Kadın Hastalıkları, Doğum ve Üreme Bilimleri Bölümü'ndeki Susan Fisher laboratuvarından ve San Lamore kütle spektrometrisi merkez tesisinden Penny Drake. Ben de Sandler Moore kütle spektrometrisi merkez tesisinden ve Fisher Laboratuvarı'ndan Eric Johansen.Bugün size, insan plazması ve diğer karmaşık karışımlardan glikopeptitleri zenginleştirmek için lektin kromatografisi gerçekleştirme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, çok sayıda uygulaması olan genel bir araç olarak kullanıyoruz. Örneğin, meme kanseri biyobelirteç keşif iş akışımızda önemli bir rol oynamaktadır.Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, boncukların solunmasını önlemek amacıyla maske takın. Ardından, 100 miligram porro boncuğu tartın ve temiz bir einor tüpüne aktarın.Bir kolonun doldurulması için yaklaşık 300 µL boncuk gereklidir. Ek olarak, konjuge edilmemiş lektini tartın ve temiz bir einor tüpüne aktarın. SNA ve A A L lektinleri kullanılır.Lektine, 5 ila 20 mg/mL konsantrasyonunda bir çözelti oluşturacak şekilde PBS ekleyin. Bu ön konjuge çözeltiden 25 µL ayırın. Ardından, 1 mL PBS ekleyip bir mikro santrifüjde maksimum hızda santrifüj ederek poro beads'leri yıkayın.Üç dakika boyunca süpernatanı uzaklaştırın ve yıkama işlemini tekrarlayın. Artık çeker ocak altında çalışın ve kalan lektin solüsyonunu yıkanmış porro hızlarına aktarın. Ardından, 50 millimolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde sodyum siano borohidrür ekleyin.Sodyum borohidrürün toksik olduğuna ve atıkların uygun şekilde bertaraf edilmesi gerektiğine dikkat edin. Kapalı tüpü parafilm ile sabitleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca reaksiyona girmesi için bir sarsıcının üzerine yerleştirin. Lektinin boncuklara gece boyunca bağlanmasının ardından, boncukları tekrar çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve boncuklar üzerindeki geri kalan reaktif bölgeleri bloke etmek için konjugasyon sonrası solüsyon olarak saklayın.İlk olarak, pH 7.4'te 1 M CL içeren bir mililitre söndürme tamponu ile santrifüj ederek boncukları yıkayın. Ardından, bir mililitre söndürme tamponu ve son konsantrasyonu 50 mM olacak şekilde sodyum borohidrür ekleyin. Tüpü bir sallayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Söndürme işlemi tamamlanmıştır. Boncukları santrifüjleyin. Daha önce yapıldığı gibi.Süpernatantı uzaklaştırın ve boncukları her seferinde bir mililitre bir molar sodyum klorür ile beş kez yıkayıp süpernatantı atarak işleme devam edin. Konjuge öncesi ve konjuge sonrası lektin çözeltilerine protein konsantrasyon analizi uygulayın ve porro boncuklarına konjuge olan protein miktarını belirlemek için aradaki farkı kullanın. Hedef lektin konsantrasyonları, boncuk hacimi başına konjuge olan protein miktarı olarak hesaplandığında iki ile 20 miligram per mililitre arasındadır.Konjuge porro boncukları artık bir kolona paketlemeye hazırdır. Boncukları bir kolona paketlemek için, metal bir halka standı üzerinde desteklenen iki kolondan oluşan paketleme sistemini kurun. Üst kolon, paketleme materyali için bir rezervuar görevi görür.Paketleme sistemi, aşağıdan yukarıya doğru basınç sınırlayıcı, hedef kolonun önündeki birinci kolon uç kuplörü, kolon uç kuplörü, ikinci kolon konnektörü, üçüncü kolon uç kuplörü, rezervuar kolonu, dördüncü kolon uç kuplörü ve uç bağlantı parçasından oluşur. Ardından, 300 µL porro speeds'i 600 içinde yeniden süspanse edin.Bir kolon doldurmak için, boncukları üst rezervuar kolona aktarın. Kolonun üst kısmına ulaşana kadar tampon A ekleyin. Uç bağlantı parçasını nazikçe kolonun üzerine yerleştirin.Kolonda hava kabarcıklarının oluşmasını önlemeye çalışın. Üst kolonun uç bağlantı aparatını HPLC sistemine bağlayın. Sistemden tampon A veya PBS akıtarak kolonu doldurun.0,5 ml/dk akış hızıyla başlayın. Akış hızını, her dakika 0,5 ml/dk artırarak 4 ml/dk'ya veya maksimum basınca ulaşana kadar devam edin. Kolondan en az 35 ml tampon geçene kadar mümkün olan maksimum akış hızında devam edin.İşlem tamamlandığında pompaları kapatın ve kolon üzerindeki basıncın 20 PSI altına düşmesini bekleyin. Kolon doldurulduğuna göre, doldurma sistemini üstten başlayarak nazikçe sökün. Son kolon bağlayıcı ikiye ulaştığınızda, onu dikkatlice çıkarın.Bir jilet kullanarak kolonun üst kısmından taşan doldurma malzemesini nazikçe sıyırın. Bu işlem sırasında boncuklara basınç uygulamayın. Doldurulmuş kolonu ring standından ayırın.Yeni bir friti yeni bir uç bağlayıcının içine yerleştirin ve paketlenmiş kolonu, açık kolon ucundaki FR artı uç bağlayıcıya bağlamak için ters çevirin. Kolon artık HPLC çalışması için hazırdır. Kullanılmadığında kolon, dört santigrat derecede, %0,5 sodyum azid içeren PBS içerisinde altı aya kadar saklanabilir.HPLC cihazınızın programlama detayları, kurulumunuza ve üretici yazılımının özelliklerine göre farklılık gösterecektir. Burada, bu makine üzerinde bir microme paradigm MG four HPLC kullanılmıştır. Yöntemler, ekran programının üst kısmındaki kurulum sekmesi altında oluşturulur ve erişilir.Gösterilen yöntem, beraberindeki yazılı protokolde de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bir otomatik örnekleyici programı kullanılıyorsa, yazılı protokole uygun hareket edilmelidir. HPLC'yi çalıştırmak için daha önce olduğu gibi tampon A ve tampon B kullanın; ayrıca tamponların ve kolonların oda sıcaklığında tutulmasını sağlayın.UV detektörü, sıfırdan 19 dakika 50 saniyeye kadar 280 nanometrede okuma yapacak şekilde programlayın. Y eksenini, sıfır ile 50 absorbans birimi aralığındaki düşük absorbans seviyelerini tespit edecek şekilde ayarlayın. Ardından, numuneleri hazırlayın.Test örnekleri, bir Mars kolonu kullanılarak en bol bulunan 14 proteinden arındırılmış insan plazmasından elde edilmiştir. Arındırılmış plazma örnekleri ve iki standart kullanılmıştır. İnsan laktoferrini ve maya invertazı, daha önce açıklandığı üzere her biri ayrı ayrı tripsin ile sindirilmiş ve tuzdan arındırılmıştır.Numuneleri nötralize etmek için, MG dört paradigması için EIT toplayacak olan numune tüplerinde nötralizasyon tamponu hazır bulundurun; bir tüp akışla geçen kısmı, üç tüp ise elüatı toplar. 1 mL EIT'yi nötralize etmek için yaklaşık 1,5 mL tampon gerekecektir. Hedeflenen nötralize pH değeri 7,0 ile 8,0 arasındadır.Nihai pH değerini pH indikatör kağıdı ile test ettiğinizden emin olun. Örnekleri bu protokolün ilerleyen bölümlerinde açıklandığı şekilde tuzdan arındırın. Ve en iyi sonuçlar için örneği bir mililitre tampon A içinde yeniden süspanse edin.Verilerin karşılaştırılabilmesi ve birleştirilebilmesi için üç deneysel tekrar gerçekleştirin. Üç tekrar için örnekleri hazırlamak üzere; 30 µL Mars ile tüketilmiş tripsin sindirilmiş plazma eşdeğerlerine (pe) üç picaMol tripsin, sindirilmiş invertaz ve 1 µL HPLC ile saflaştırılmış laktoferrine özgü lektin ekleyin. Bu, her bir tekrar için kullanılan yaklaşık 50 µg plazma proteinine karşılık gelir. Örneğe, toplamda 330 µL veya deneysel tekrar başına 110 µL nihai hacme ulaşana kadar tampon A ekleyin. Önce AAL veya SNA lektin kolonunu kullanarak, yalnızca tampon A enjekte ederek iki boş metod çalıştırın. Lektin kolonunun, standart olarak kullanılan ve daha önce kromatografisi ile saflaştırılmış laktoferrine özgü lektin ile uyumlu olduğundan emin olun.Her enjekte edilen örnek arasında bir boş (blank) enjekte edilerek toplam yedi HPLC çalışmasıyla üç plazma örneği işlenir. Boş çalışmalardan elde edilen fraksiyonların toplanmasına gerek yoktur. Örneklerin, tuz giderme ve P-N-G-A-F sindirimi sonrası elüatı toplayan örnek tüplerinde nötralizasyon tamponu bulundurarak nötralize edildiğinden tekrar emin olun; böylece örnekler kütle spektrometrik analiz için hazır hale gelecektir.Laktoferrin standardı ve deneysel örneklerden elde edilen her bir HPLC fraksiyonunu tuzdan arındırmak için bir adet bir mililitrelik Waters Oasis HLB SPE kartuşu kullanın. Gerekli sayıdaki kartuşu vakum manifolduna takarak başlayın. Her bir kartuşu, %1 Formik asit içeren %80 acetonitrile'in bir mililitresi ile ıslatın.Manifold üzerindeki vakum göstergesi beş ile 20 inç cıva arasında değer okumalıdır. Kartuşları 1,5 mililitre %0,1 formik asit ile dengeleyin. Vakum göstergesi yine beş ile 20 inç cıva arasında değer okumalıdır.Bir örneğin tüm hacmini bir kartuşa yükleyin. Bu aşamada, manifolduaki vakum göstergesi 2 ila 2.5 inç değerini göstermelidir. Akış hızı ise dakikada bir mililitreyi geçmemelidir.Her kartuş için etiketlenmiş tek bir toplama tüpü kullanarak, kartuşları 1 mL %0,1 formik asit ile üç kez yıkayın. Glikopeptidleri 1 mL %0,1 formik asit içeren %80 asetonitril ile elüe edin; her toplama tüpüne 60 µL 0,5 molar amonyum bikarbonat ekleyerek EIT'yi nötralize edin. Hedeflenen nötralize pH 7,0 ile 8,0 arasıdır.Final pH'ın pH indikatör kağıdı ile test edildiğinden emin olun. Elüye edilen peptidleri, Thermo Savant SpeedVac gibi bir vakumlu santrifüj kullanarak yaklaşık 35 °C'de yaklaşık iki saat boyunca yaklaşık 50 µL'ye kadar konsantre edin. Konsantrasyondan sonra, pH'ın 7,0 ile 8,0 arasında olduğunu doğrulamak için örnek pH'ını tekrar test edin. Gerekirse, pH'ı yükseltmek için 50 mM amonyum bikarbonat ekleyin.Final örnek hacmi 100 µL'den büyükse, örneği vakum santrifügasyonu ile 50 ile 100 µL arasına gelene kadar konsantre edin. Son olarak, her örnek tüpüne 250 unit gliserol içermeyen peptide N-glycosidase F veya P-N-G-A-F ekleyerek peptidlerden N-bağlı karbonhidratları uzaklaştırın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. P-N-G-S-F ile yapılan gece boyu inkübasyonun ardından, başlamadan önce örnekleri tuzdan arındırmak için ters faz C18 matrisi içeren zip tip pipet uçları kullanın.Yıkama ve elüsyon işlemleri için bir parça parafilm üzerine biri %0,1 formik asit, diğeri %80 asetonitril artı %0,1 formik asit olan iki damla hazırlayın. Damlacıklar, numuneler arasında peptidlerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için kullanılır ve her ZipTip numunesi için yeni damlacıklar hazırlanır. ZipTip'i asetonitril çözeltileri ile ıslatarak başlayın. ZipTip'i, 10 µL %0,1 formik asit ile üç kez yukarı-aşağı pipetleyerek dengeleyin.Örneği, pipetle 10 kez yukarı-aşağı çekerek yükleyin. Ardından ucu, 10 µL %0.1 formik asit ile beş kez yıkayın. Son olarak, örneği %1 Formik asit içeren %80 acetonide trial ile iki kez elüye edin ve elüye edilen peptitleri bir einor tüpünde toplayın.Örnek hacmini vakumlu santrifüj ile konsantre ederek iki µL'nin altına düşürün ve örnekleri 20 µL %0.1 formik asitte yeniden süspanse ederek işlemi tamamlayın. Örnekler artık L-C-M-S-M-S ile analiz için hazırdır. Porro konjugasyonu genellikle boncuk başına 2 ila 20 mg/mL aralığında lektin konsantrasyonu sağlar ki bu, afinite kromatografisi için optimaldir.Trypsin ile sindirilmiş Mars tükenmiş insan plazmasının lektin kromatografisi, genellikle bağlı fraksiyondaki glikopeptitleri zenginleştirir. İş akışımız, X'in prolin dışındaki herhangi bir kalıntı olduğu NXS veya NXT bağlanmamış konsensüs dizilerini içeren N bağlı glikopeptitleri tanımlar. PNGF işlemi, bağlanmamış glikanları uzaklaştırır ve glikanların bağlı olduğu asparajin kalıntisini deamine eder.Deamidasyon, deglikozile peptid veya deglikopeptidin modifiye edilmemiş peptide göre bir Daltonluk kütle kaymasıyla sonuçlanır. Bu nedenle DEG glikopeptidler, N-bağlı konsensüs dizisini içeren ve bu konsensüs dizisindeki asparajin kalıntısının deamidasyonu sonucu modifiye edilmemiş bir asparajin kalıntısına kıyasla artı bir kütle farkı şeklinde gözlemlendiği peptidlerle tanımlanır. Burada iki örnek spektrum bu kavramı örneklendirmektedir.Üstteki spektrum, EnLink konsensüs dizisini içeren modifiye edilmemiş bir peptidin fragmantasyonunu göstermektedir. Alttaki spektrum, EnLink konsensüs dizisi içindeki deamine asparajin kalıntısına sahip aynı peptidin fragmantasyonunu göstermektedir. Deamide peptidin Y seven, Y eight ve B three fragmanlarından gelen daire içine alınmış moleküler iyonlar, modifiye edilmemiş peptitteki karşılıklarına kıyasla kütle bakımından bir Dalton artış göstermektedir.Bu kütle kayması, alttaki spektrumda bulunan peptidin deamidize bir asparajin kalıntısı içerdiğini göstermektedir. Tipik olarak bir QStar elite kullanıldığında, akış yolu (flow through) fraksiyonunda 1000 ila 1300, bağlı (bound) fraksiyonunda ise 200 ila 400 toplam peptit tanımlanacaktır. Ortalama olarak, Al veya SNA kromatografisinden gelen akış yolu fraksiyonu %2 ila 4 oranında deglikopeptit içerirken, bağlı fraksiyonda geri kazanılan peptitlerin %30 ila 50'si deglikopeptiddir.Kütle spektrometrik analiz sırasında deglikozillenmiş deamidasyon molekülleri gözlemlendiği için glikopeptidler yerine deglikozillenmiş glikopeptidler terimini kullanmaktayız. Bununla birlikte, örneklerimizdeki DEG glikopeptidlerin çoğunluğunun, daha önce bağlanmamış olan ve PNGase F işlemiyle deglikozillenen ve deamine olan glikopeptidler olduğunu öne sürüyoruz. Bağlanmış örneğimizdeki deglikozillenmiş glikopeptidlerin zenginleşmesi bu hipotezi desteklemekte ve deglikozillenmiş glikopeptidlerin tespitini, lektin afinite kromatografisi protokolümüz tarafından yakalanan glikopeptidler için bir vekil gösterge olarak kullanmamıza olanak sağlamaktadır.Akış fraksiyonunda iki veya daha fazla belirgin invertaz d glikopeptit ve bağlı fraksiyonda iki veya daha fazla belirgin laktoferrin de glikopeptit gözlemlenmelidir. Size lektin kolonlarının nasıl hazırlanacağını ve HPLC formatında lektin afinite kromatografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, yüksek kaliteli glikopeptit örnekleriyle başlamak, deney boyunca örneklerin pH değerini izlemek ve kromatografi kalitesini glikopeptit standartlarıyla doğrulamak önemlidir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, memeli hücrelerinde biyosentezi sonra glikoproteinler erken ömrü boyunca N-bağlı glukanlardır değişiklik analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu darbe-kovalamaca metabolik etiketli glukanlardır, glikoproteinler ve HPLC ile incelenmesi enzimatik serbest analizi ile elde edilir.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Bu video, hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi kullanılarak hidrofilik polar bileşiklerin ayrılması ilkesini göstermektedir. Bu teknik, N-glikanlar dahil olmak üzere çeşitli polar analitlerin saflaştırılmasına yardımcı olur.

Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi: Hidrofilik Polar Analitleri Hidrofilik Boncuklar Kullanarak Ayırmak İçin Bir Teknik

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) protein yapılarını ve fonksiyonlarını değiştirir. Birden fazla PTM tipinin aynı anda zenginleştirilmesi yöntemleri, analizlerde kapsama alanını en üst düzeye çıkarabilir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisini ve ardından pankreas dokularında protein N-glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı zenginleştirilmesi ve analizi için kütle spektrometresini kullanan bir protokol sunuyoruz.

İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

İlaç ürünlerinden (DP) konak hücre proteinlerini (HCP'ler) zenginleştirmek ve proteom zenginleştirme boncukları kullanarak peptitleri tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, performans açısından farklı yöntemleri değerlendirmek ve karşılaştırmak için iyi karakterize edilmiş bir referans materyal olan, kurum içinde üretilmiş bir monoklonal antikor (mAb) ilaç maddesi (DS) kullanılarak gösterilmiştir.

Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Daha önce glikanların proteinler üzerinde otomatik ve hızlı analizi için bir sistem geliştirilmiştir. Bu makale, biyofarmasötikler ve diğer glikokonjugat malzemelerdeki glikan yapılarını analiz etmekle uğraşanlar gibi geniş bir kullanıcı yelpazesi için optimize edilmiş "gliko-kalitatif analiz" protokolünü sunmaktadır.

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Öğrenin, insan plazmasından glikozile peptitleri lektin konjuge POROS boncukları ve HPLC kullanarak zenginleştirme yöntemini. Bu teknik biyobelirteç keşfi çalışmalarında kritik öneme sahiptir.

Kompleks Biyolojik örnekler seçerek glikozile Peptitler zenginleştirin lektin HPLC Yöntemi

Daha fazla video keşfet