Bireysel Presinaptik Terminalleri Dopamin Yayın FFNs ile görüntülendi

Floresan yalancı nörotransmitter. FFN 511, beyin kesitlerine uygulandığında sinaptik fiziksel monoamin taşıyıcısı için bir substrat olarak görev yapabilen floresan monoamindir. FFN 511, monoamin taşıyıcısı aracılığıyla dopaminerjik sinaptik veziküller tarafından alınır ve S stratumundaki gibi monoaminerik nöronların presinaptik terminallerinden gerçekleşen transmitter salınımını doğrudan görselleştirmek için kullanılabilir. Terminallerden transmitter salınımı, kesitte noktasal floresan sinyallerdeki azalma şeklinde gözlemlenebilir.

Bu videoda, FFN 511 ile boyanmış ve çok fotonlu lazer mikroskobu kullanılarak görüntülenmiş, 250 µm kalınlığında koronal sal dilimleri hazırlanmaktadır. iCal salınımının frekans bağımlı heterojenliğini ortaya çıkaran detaylandırma deneyleri gösterilmektedir. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Nöroloji Bölümü'ndeki David'in laboratuvarından HU.

Merhaba, ben de Soldier Laboratuvarı'ndan Minerva. Bugün size, beyin kesitlerindeki dopamin terminallerinin floresan yalancı nörotransmitterlerle işaretlenmesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda dopamin salınımını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Haydi başlayalım. Akut sagital dilimler hazırlamadan önce, yapay beyin omurilik sıvısı (A CSF) oksijenlendirilmeli ve beyin çıkarılmadan önce en az 15 dakika boyunca buzla soğutulmalıdır; A CSF'yi buz gibi soğuk ve oksijenlendirilmiş halde tutun. Diseksiyon sırasında, tüm beyin fareden çıkarılmalı ve hızlı yapıştırıcı kullanılarak vibratom tepsisine yerleştirilmelidir. Beynin çıkarılması ve sabitlenmesi iki dakika içinde tamamlanmalıdır.

Tepsiyi, +1,54 ile +0,623 arasında 250 µm kalınlığında kesilmiş koronal düzlemde beyin dilimleri veya düz beyin dilimleri ile soğutulmuş oksijenli A CSF ile doldurun. Bir iğne yardımıyla altı yarım dilime bölünebilen üç tam dilim elde edilecektir. Beyin dilimleri inkübe edilirken, bunları oda sıcaklığındaki oksijenli A CSF içerisinde en az bir saat bekletin.

Oksijenlendirilmiş A CSF içerisinde, 10 millimolar FFN 511 stok çözeltisini A CSF'ye ekleyerek 10 micromolar FFN 511 yükleme çözeltisini hazırlayın. Ardından, A CSF içerisinde yüz micromolar A-D-V-A-S-E-P seven çözeltisi hazırlayın; her iki çözeltiyi de dilimlere tek tek yüklemeden önce en az 15 dakika boyunca oksijenlendirin. Her bir beyin dilimini, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca FFN 511 yükleme çözeltisi ile inkübe edin.

Ardından, yüklü kesiti oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oksijenle zenginleştirilmiş 100 µM advers, seven A CSF içinde inkübe ederek hücre dışı dokuya bağlı olan di'yi uzaklaştırın; kesitler artık görüntüleme için hazırdır. FFN 511 boyaması, kesitlerde bir prairie Ultima Multiphoton lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülenecektir. FFN 511 yüklü kesiti kayıt haznesine yerleştirin ve dakika başına 1-2 mL akış hızında oksijenle zenginleştirilmiş A CSF ile süperfüze edin. Daha sonra hareketi en aza indirmek için kesitin üzerine naylon telli platin bir harp yerleştirin.

Hareketi daha da en aza indirmek için, görüntüleme öncesinde dilimlerin oda içerisinde en az 10 dakika boyunca stabilize olmasına izin verin. 10 x su daldırma objektifi altında parlak alan lüminesansı ile dorsal stri AUM'u görselleştirip konumlandırın ve stimülasyon deneyini gerçekleştirmek için bipolar bükümlü tungsten elektrotları bu bölgeye yerleştirin. Boşta kalan görüntüleme alanı 300 mikrometre mesafe içerisindedir.

Stimüle eden bipolar elektrodun iki ucu arasına, 63x su daldırma ultraviyole objektifi altında FFN 511 ile işaretlenmiş Sal terminallerinin bulunduğu bu bölgeyi görsel alan görüntüsünün merkezine yerleştirin. FFN 511, Spectral Physics marka mi tai lazer ile 760 nanometrede uyarılır. SAL terminallerinin optimal floresansı bir bant geçiren filtre aracılığıyla görülür; görüntüleri 12 bit formatında, 512 x 512 piksel çözünürlükte ve 75 x 75 mikrometrelik ilgi bölgeleri ile yakalayın. FFN 511 ile işaretlenmiş Sal dopamin terminallerini içeren örnek bir görüntü burada gösterilmiştir.

FFN 511 etiketi, potasyum klorür amfetamin sülfatın yüksek konsantrasyonları ile veya potasyum klorür giderme deneyindeki elektriksel stimülasyonla giderilebilir; beyin dilimine yüksek potasyumlu bir BOS solüsyonu uygulandığında FFN 511 etiketi dört dakika içinde giderilir. Elektriksel stimülasyonla FFN 511 giderimini takip etmek için zaman içinde FFN 511 giderimini izleyen XYZT görüntüleri kaydedin. Dilimin minimum düzeyde hareket ettiğinden ve kontrol görüntülerinin alınmasını takiben lazerle fotobeyazlama meydana gelmediğinden emin olmak için, stimülasyon öncesinde en az beş dakika boyunca Zack'in kontrol zaman serisi görüntüsünü elde edin.

Bipolar elektrotlar kullanılarak, bir master eight darbe jeneratörü tarafından tetiklenen bir isof lex stimülasyon izolatörü ile striatuma lokal olarak 1, 4 veya 20 hertz frekanslarında stimülasyon başlatırken XYZT görüntülemeye devam edin. Bu video, bir sal beyin diliminde ekzositoz sırasında FFN 511'in dağılımını göstermektedir. Hazırlık aşamasında FFN 511'in SAL'a yüklemesi tamamlandığında; striatumda yoğun etiketleme, kortekste seyrek etiketleme ve corpus callosum'da ise hiç etiketleme görülür.

Dopamin terminallerinin seçici etiketlenmesi, potasyum klorür öncesindeki ve 70 millimolar potasyum klorür uygulamasından iki dakika sonraki bu temsilci görüntülerde gösterildiği gibi, yüksek potasyum klorür ile ortadan kaldırılabilir. FFN 511 etiketlemesinin CSF kaybı, amfetamin ile de gerçekleştirilebilir. Bu görüntü ise amfetamin öncesindeki striatumdaki FFN 511 etiketlemesini göstermektedir.

Bu görüntü striatumun 20 µM amfetamin ile detaining işleminden 20 dakika sonrasını gösterirken; lokal elektriksel stimülasyonla FFN 511 etiketlemesinin detaining işlemi, stimülasyon öncesindeki, stimülasyonun başlamasından 217 saniye ve 514 saniye sonrasındaki striatumda FFN 511 etiketlemesini gösteren bu görüntülerde örneklendirilmiştir. Normalize edilmiş floresan yoğunluğunun zamana göre değişimini gösteren bu grafik, FFN 511 detaining işleminin kalsiyum ve frekans bağımlı olduğunu göstermektedir; içi boş üçgenlerle temsil edilen kontroller herhangi bir stimülasyon almamıştır. İçi boş dairelerle temsil edilen kadmiyum klorür ile yapılan detaining işlemi, stimüle edilmemiş kontrollerle aynıydı.

Renkli dairelerle temsil edilen her bir stimülasyon frekansı için sönümlenme eğrileri, tek bir eksponansiyel azalma fonksiyonu ile fit edilmiş ve yarı ömür değerleri tau'nun 0.693'e bölünmesiyle hesaplanmıştır. Akut dilimdeki dopamin terminallerine floresan kuvvet nörotransmitter FFN five 11'in nasıl yükleneceğini, yüksek potasyum ile nasıl serbest bırakılacağını ve stimülasyonun nasıl uyarılacığını size göstermiş olduk. Bu, nörotransmitter salınımını tekil sinaptik terminaller düzeyinde optik olarak incelemek için geliştirilen ilk yöntemdir.

Bu prosedürü uygularken, kesitlerin çok sağlıklı tutulmasının önemli olduğunu hatırlamak ve yükleme süresi, arka plan ağartma ve hareket artefaktları konusunda dikkatli olmak gerekir; kesitler, hazırlıktan sonra dört saate kadar iyi FFN beş 11 yüklemesi ve görüntüleme sergiler. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.