Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis

Bu prosedürün genel amacı, kurbağa xenopus kılıflarında antijene özgü CD sekiz T hücresi tepkilerini teşvik etmek için ısı şoku proteini G 96'nın evrimsel koruma yeteneğini incelemektir. Bu, ilk olarak peritoneal lökositlerin periton lavajı ile hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, peritoneal lökositlerin inkübasyon ve yıkama işleminden sonra tümör antijenlerini şaperon eden tümör kaynaklı GP 96 ile nabız

Peritoneal lökositler, bu kurbağaları tümör veya minör doku uyumluluk antijenlerine karşı hazırlamak için naif kurbağalara intraperitoneal enjeksiyon yoluyla evlat edinilmiş olarak aktarılır. Prosedürün üçüncü adımı, deri grefti veya tümörü, astarlanmış kurbağalara meydan okumak ve deri grefti, reddi veya tümör görünümünün başlangıcını izlemektir. Prosedürün son adımı, cilt reddi ve anti-tümör yanıtlarında yer alan T hücrelerini karakterize etmek için periferik kan elde etmektir.

Sonuç olarak, GP 96 astarlı kurbağalarda sırasıyla deri grefti ve tümör zorluğu deneyleri yoluyla deri grefti reddinde önemli bir hızlanma ve ayrıca tümör görünümünde gecikmeler gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Christina Koska, Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde Dr.Jacque Robert'ın laboratuvarındayım. Ben de Dr.River'ın laboratuvarından Tanya Cruz.

Bugün size peritoneal lökositlerin evlat edinilerek transferi ve ardından deri grefti ve tümör nakli tahlilleri ile klon kurbağaların astarlanması için bir prosedür göstereceğiz. Ek olarak, size bu hayvanlardan nasıl periferik kan alacağınızı da göstereceğiz. Bu prosedürü, proteininiz GP 96'nın Salla'daki antijene özgü CDAT hücrelerini teşvik etme yeteneğini incelemek ve ilgili hücre tiplerini incelemek için kullanıyoruz.

Tamam, hadi başlayalım. Deneylerimizde kullanılan kurbağalar, Rochester Üniversitesi'ndeki üreme kolonimizden ISO genetik klonlarıdır. Hasat için peritoneal lökositleri veya pls'leri ortaya çıkarmak için, anestezi uygulanmış kurbağaya intraperitoneal olarak ısıyla öldürülmüş bir e coli preparatı enjekte etmek için 25 gauge beş sekiz iğne kullanın Enjeksiyondan üç gün sonra pls intraperitoneal lavaj ile hasat edilir.

Bu işleme başlamak için, anestezi uygulanmış kurbağanın karnını az miktarda% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, periton boşluğuna beş mililitre steril amfibi fosfat tamponlu salin veya oda sıcaklığında bir PBS savaş öncesi enjekte etmek için 18 gauge 1.5 iğne kullanın. İğneyi çıkarın ve enjekte edilen tamponun vücut boşluğundaki sıvıya eşit olduğundan emin olmak için kurbağaya bir dakika boyunca hafifçe masaj yapın.

Ardından, kurbağanın karnına şırınga olmadan yeni bir 18 gauge 1.5 iğne sokun. Kan damarlarından kaçınırken, iğnenin arkasından damlayacak olan periton sıvısını 50 mililitrelik temiz bir konik tüpe toplayın. Lütfen hasat edildikten sonra ilk enjekte edilen hacmin mümkün olduğunca çoğunu aldığınızdan emin olun.

Kurbağayı uyanana kadar sığ su içeren bir kaba koyun, bu noktada kafesine geri yerleştirilebilir. Pls hasat edildikten sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin, sup, natant ve resus'u çıkarın. Pls'yi soğuk A PBS'de askıya alın.

RESUSPENDED pls'yi 1.5 mililitrelik bir mikro çöp tüpüne aktarın. PLS'yi GP 96 ile nabızlamak için. Pls'ye uygun miktarda GP 96 ekleyin ve pipetleyerek karıştırın, bir saat sonra buz üzerinde bir saat inkübe edin.

Hücreleri bir dakika boyunca 14.000 RPM'de santrifüjleyin. Bağlı olmayan herhangi bir GP 96'yı çıkarmak için süpernatanı çıkarın. Soğuk A PBS ve resüs ekleyin.

PLS santrifüjünü tekrar askıya alın. Son yıkamadan sonra G 96 kalıntısı kalmadığından emin olmak için S'yi soğuk A-P-B-S-A ile toplam üç kez yıkayın. Resus, darbeli pls'yi, bir PBS'nin 300 mikrolitresi başına beş kez 10 ila beş pls'lik bir konsantrasyonda askıya alır ve pls'yi saf LG altı alıcısına evlat edinir.

İntraperitoneal, hayvan başına 300 mikrolitre darbeli pls enjekte eder. Kurbağaların, daha sonra gösterilecek olan deri grefti veya tümör meydan okuma deneylerinden en az üç gün önce astarlanması gerekir. Greftleme için deri, anestezi uygulanmış bir LG 15 donör kurbağasından elde edilir.

Simli görünen karın derisi olan küçük bir ventral deri parçasını kesmek ve çıkarmak için makas kullanın. Greft işlenirken ARI dört pigmentli hücrenin varlığı nedeniyle. Greft hasarına neden olacağından, dokuda mümkün olduğunca az manipülasyon yapılması çok önemlidir.

Cildi forseps ile çok nazikçe tutun ve soğuk A PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Petri kabını açık tutun. Cildi taze bir cam slayt üzerine yerleştirin ve tek tek greftleri beş milimetreye beş milimetre parçalar halinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.

Cildi LG altı alıcı kurbağasına aşılamak için parçaları buz üzerinde bir PBS'de tutun. İlk olarak, anestezi uygulanan alıcının sırt derisi üzerinde küçük bir kesi yapın. Daha sonra beş milimetreye beş milimetre grefti gümüşi tarafı yukarı bakacak şekilde derinin altına yerleştirin.

Greftlerin üzerindeki makas ve forsep işaretlerine dikkat ettiğinizden emin olun çünkü bunlar greft reddi olarak sayılmaz. Skorlama 24 saat sonra başladığında, üst üste binen konakçının derisinin bir kısmının greftten çıkarılması gerekir. Greftin serbestçe görüntülenebilmesi için greftin etrafında bir pencere açmak için makas kullanın.

Donör cildine dokunmamaya veya kanamaya neden olmamaya dikkat edin. Bir eskiz çekerek grefti hemen puanlamaya başlayın. Deri grefti.

Reddetme, aridolün aşılanmış cilt üzerindeki tahribat yüzdesi ile belirlenir. Greft her iki ila üç günde bir stereo mikroskop altında kontrol edilmelidir. Tümör hücrelerini resüs ile transplantasyon için hazırlayın, bunları tümör kültürü Ortamında 300 mikrolitre başına beş kez 10 ila beş hücre yoğunluğunda süspanse edin.

Hücreleri, hayvanın sırt tarafının bir tarafına deri altı enjeksiyonla nakledin. Kurbağa başına 300 mikrolitre hacimdeki beş hücreye beş kez 10 kez enjekte edilir. Tümör büyümesi, tümör tehdidinden iki ila üç hafta sonra başlayacaktır.

İlk tümör görünümüne dikkat edin. Tümörün boyutlarını ölçmek için kaliperler kullanın ve kurbağadan kan lökositlerinin toplanmasından önce her iki ila üç günde bir hacmini kaydedin. Makarna pepplerini ateşte çekerek cam iğneler hazırlayın.

Pipetin ince ucunu stereo mikroskop altında keskinleştirdikten sonra, pipeti bir aspirasyon plastik tüpüne bağlayın. Kan alımına başlamak için, dorsal tarsus damarını ortaya çıkarmak için anestezi uygulanmış kurbağanın arka ayağının üzerindeki cildi kesin. Cam iğneyi bir ila iki mililitre buz gibi soğuk A PBS artı heparin solüsyonu ile doldurun.

Daha sonra cam iğneyi damar içine sokun ve ağız ile yavaşça aspire ederek kan toplamaya başlayın. Ortalama büyüklükte bir kurbağadan bir ila iki mililitre kan elde edilebilir. Kurbağanın bacağındaki küçük kesiğin dikilmesine gerek yoktur.

Yara bir hafta içinde iyileşir. Transplantasyondan 12 gün sonra deri grefti reddinin stereo mikroskobik analizinin sonuçları burada gösterilmektedir. MHC ile özdeş bir LG altı donöründen deri grefti alan bir LG altı klonlanmış kurbağa, herhangi bir reddetme göstermedi.

Yıldız işareti, reddedilme nedeniyle olmayan işaretleyici forsepsleri gösterir. Buna karşılık, MHC'den farklı bir soylu donörden deri grefti alan bir LG altı klonlanmış kurbağa% 80 reddedilme gösterir. Her iki görüntüde de oklar, sağlıklı reddedilmemiş greftlenmiş dokuyu işaretleyen gümüşi iridli dört pigmentli hücreyi gösterir.

Bu sonraki deneyde, LG 15 pls, bir e coli kültüründen saflaştırılmış negatif kontrol rekombinant GP 96 veya 15 sıfır tümör dokusu hücresinden saflaştırılmış GP 96 olarak bir PBS ile darbelendirildi ve daha sonra LG 15 yetişkin alıcılarına evlat edinerek aktarıldı ve üç gün sonra canlı 15 sıfır tümör hücresi, meydan okumadan günler sonra ilk kez ortaya çıkan deri altı enjeksiyon tümörleri tarafından nakledildi ve tümör boyutu periyodik olarak ölçüldü. Bu grafikler, her eğri bir kurbağadaki tümör büyümesinin kinetiğini temsil eder. Sonuçlar, 0.5 veya bir mikrogram GP 96 ile hazırlanan hayvanların, kontrol gruplarına kıyasla tümör görünümünü önemli ölçüde geciktirdiğini göstermektedir. Bu nedenle, GP 96, ksenopusta tümör antijenlerinin çapraz sunumunu kolaylaştırır.

Bu nedenle, size GP 96'nın kurbağa xap lavisindeki hem minör hem de tümör antijenlerini deri grefti ve tümör nakli tahlilleri ile temsil etme yeteneğini nasıl keşfedeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, bir kan damarı hasar görmüşse, hücrelerin çoğunluğu eritrositler içinde olduğu ve makrofajlar olmadığı için periton lavajı toplamaktan kaçınmayı unutmamak önemlidir. Hasarı önlemek için deri greftini manipüle ederken dokuyu forseps ile sıkmaktan kaçınmak da önemlidir.

İşte bu kadar. Yıkadığınız için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.