Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis

Bu prosedürün genel amacı, ısı şok proteini GP 96'nın, kurbağa *Xenopus laevis*'te antijene özgü CD8 T hücresi yanıtlarını teşvik etme konusundaki evrimsel korunmuş yeteneğini incelemektir. Bu, öncelikle peritonal lavaj yoluyla peritonal lökositlerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, inkübasyon ve yıkama işlemlerinin ardından, peritonal lökositlerin, minör ve tümör antijenlerine şaperonluk yapan tümör kaynaklı GP 96 ile pulse edilmesidir.

Tümör veya minör histokompatibilite antijenlerine karşı bu kurbağaları duyarlı hale getirmek amacıyla, peritoneal lökositler intraperitonal enjeksiyon yoluyla naif kurbağalara adaptif olarak transfer edilir. Prosedürün üçüncü adımı, duyarlı hale getirilmiş kurbağalara ya deri grefti uygulamak ya da tümör ile challenge etmek ve ardından deri grefti reddinin başlangıcını veya tümör oluşumunu izlemektir. Prosedürün son adımı, deri reddi ve anti-tümör yanıtlarında rol oynayan T hücrelerini karakterize etmek için periferik kan örneği almaktır.

Nihayetinde, deri greftleme ve tümör challenge deneyleri aracılığıyla sırasıyla, GP 96 ile ön işlem yapılmış kurbağalarda deri grefti reddinin önemli ölçüde hızlandığını ve tümör oluşumunun geciktiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Christina Koska, Rochester Tıp Merkezi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde Dr. Jacque Robert'in laboratuvarındayım. Ben de Dr. River'ın laboratuvarından Tanya Cruz.

Bugün sizlere, peritoneal lökositlerin adoptif transferiyle klon kurbağaların primelenmesi işlemini, ardından cilt grefti ve tümör transplantasyonu deneylerini göstereceğiz. Ayrıca, bu hayvanlardan periferik kanın nasıl alınacağını da göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, ısı şoku proteini GP 96'nın Xenoallograftlarda antijen spesifik CD4+ T hücrelerini teşvik etme yeteneğini ve sürece dahil olan hücre tiplerini incelemek için kullanıyoruz.

Tamam, başlayalım. Deneylerimizde kullandığımız kurbağalar, Rochester Üniversitesi'ndeki üretim kolonisinden alınan izojenetik klonlardır. Hasat için peritonel lökositleri veya PL'leri uyarmak amacıyla, anestezi altındaki kurbağanın intraperitonal bölgesine 25 gauge beş sekizlik bir iğne ile ısı ile öldürülmüş E. coli preparatı enjekte edin. Enjeksiyondan üç gün sonra PL'ler, intraperitonal lavaj yoluyla hasat edilir.

Bu prosedüre başlamak için, anestezi altındaki kurbağanın abdomenini az miktarda %70 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, periton boşluğuna beş mililitre steril amfibi fosfat tamponlu salin veya oda sıcaklığında ön ısıtma yapılmış bir PBS enjekte etmek için 18 gauge 1,5 iğne kullanın. İğneyi çıkarın ve enjekte edilen tamponun vücut boşluğundaki sıvı ile karıştığından emin olmak için kurbağaya bir dakika boyunca nazikçe masaj yapın.

Ardından, şırıngasız yeni bir 18 gauge 1,5 iğneyi kurbağanın abdomenine yerleştirin. Kan damarlarından kaçınarak, iğnenin arka kısmından damlayacak olan periton sıvısını temiz bir 50 mililitre konik tüpe toplayın. pls toplandıktan sonra, başlangıçta enjekte edilen hacmin mümkün olduğunca fazlasının geri alındığından emin olun.

Kurbağayı, uyanana kadar sığ sulu bir kaba koyun; uyandıktan sonra tekrar kafesine yerleştirilebilir. pls toplandıktan sonra, 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin, sup, natant ve resus'u uzaklaştırın. pls'yi soğuk A PBS içinde süspande edin.

SÜSPANSE edilen plazmaları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Plazmaları GP 96 ile pulse edin. Plazmalara uygun miktarda GP 96 ekleyin ve pipetleyerek karıştırın; bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin, bir saat sonra.

Hücreleri 14, 000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Bağlanmamış GP 96'yı uzaklaştırmak için süpernatanı alın. Soğuk A PBS ekleyin ve resüspansiyon yapın.

PLS santrifüj işlemini tekrar askıya alın. Son yıkamadan sonra hiçbir kalıntı G 96 kalmadığından emin olmak için S'yi soğuk A-P-B-S-A ile toplam üç kez yıkayın. Naif LG altı alıcılarına adaptif olarak transfer etmek için, darbeli pls'yi 300 microliters PBS başına beş kez 10⁵ pls konsantrasyonunda yeniden süspande edin.

Hayvan başına 300 µL pulslanmış pls'yi intraperitonal olarak enjekte edin. Kurbağaların, bir sonraki aşamada gösterilecek olan deri grefti veya tümör challenge deneylerinden en az üç gün önce ön hazırlığının (priming) yapılması gerekir. Greftleme için kullanılacak deri, anestezi uygulanmış LG 15 donör kurbağadan temin edilir.

Makas kullanarak, gümüşi renkte görünen karın derisi olan ventral deriden küçük bir parça kesin ve çıkarın. Grefti işlerken ARI varlığı nedeniyle dört pigmente hücreye dikkat edin. Dokuya mümkün olduğunca az müdahale edilmesi kritik önem taşır, çünkü bu durum greft hasarına yol açacaktır.

Cildi pensle çok nazikçe tutun ve soğuk A PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Petri kabını üzerinde tutun. Cildi temiz bir lam üzerine yerleştirin ve bir jilet kullanarak münferit greftleri beş milimetreye beş milimetrelik parçalar halinde kesin.

Deri parçalarını, LG six alıcı kurbağaya nakletmek üzere buz üzerinde PBS içinde bekletin. Öncelikle, anestezi altındaki alıcının sırt derisinde küçük bir insizyon yapın. Ardından, beş milimetreye beş milimetrelik grefti, gümüş rengi tarafı yukarı gelecek şekilde derinin altına yerleştirin.

Greftler üzerindeki makas ve pens izlerini not ettiğinizden emin olun, çünkü bunlar greft reddi olarak sayılmaz. 24 saat sonra skorlama başladığında, konakçının greftin üzerindeki deri kısmının bir bölümünün kaldırılması gerekir. Greftin rahatça görüntülenebilmesi için greftin etrafında makasla bir pencere açın.

Donör deriye dokunmamaya veya kanamaya yol açmamaya dikkat edin. Hemen bir taslak çizerek greftin sınırlarını belirlemeye başlayın. Deri grefti.

Reddetme, greftlenen deri üzerindeki aridol'ün yıkım yüzdesi ile belirlenir. Greft, her iki ila üç günde bir stereo mikroskop altında kontrol edilmelidir. Tümör hücrelerini transplantasyon için, 300 µL başına 5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda tümör kültür ortamında süspanse ederek hazırlayın.

Hücreleri, hayvanın sırt bölgesinin bir tarafına deri altına enjeksiyon yoluyla nakledin. Kurbağa başına 300 µL hacimde 5 × 10⁵ hücre enjekte edilir. Tümör büyümesi, tümör yüklemesinden sonraki iki ila üç hafta içinde başlayacaktır.

Tümörün başlangıç görünümünü not edin. Kurbağadan kan lökositleri toplanmadan önce, her iki ila üç günde bir tümörün boyutlarını kumpasla ölçün ve hacmini kaydedin. Pasta peppes camlarını alev üzerinde çekerek cam iğneler hazırlayın.

Pipetin ince ucu stereo mikroskop altında sivriltildikten sonra, pipet bir aspirasyon plastik tüpüne bağlanır. Kan toplamaya başlamak için, anestezi altındaki kurbağanın arka ayağının üzerindeki deri, dorsal tarsus venini açığa çıkaracak şekilde kesilir. Cam iğne, bir ila iki mililitre buz gibi soğuk A PBS artı heparin çözeltisi ile doldurulur.

Ardından cam iğneyi vene yerleştirin ve ağızla yavaşça aspire ederek kan toplamaya başlayın. Ortalama büyüklükteki bir kurbağadan bir ila iki mililitre kan elde edilebilir. Kurbağanın bacağındaki küçük kesinin dikilmesine gerek yoktur.

Yara bir hafta içinde iyileşecektir. Transplantasyondan 12 gün sonra gerçekleştirilen deri grefti reddinin stereo mikroskobik analiz sonuçları burada gösterilmiştir. MHC özdeş bir LG altı donörden deri grefti alan bir LG altı klonlanmış kurbağada red görülmemiştir.

Yıldız işareti, reddedilme kaynaklı olmayan marker pensini göstermektedir. Buna karşılık, MHC uyumsuz bir outbred donörden deri grefti alan bir LG altı klonlanmış kurbağa %80 reddedilme göstermektedir. Her iki görüntüde de oklar, reddedilmemiş sağlıklı greftlenmiş dokuyu işaretleyen gümüşi iridofor pigmente hücrelerini göstermektedir.

Bir sonraki deneyde, LG 15 plazmaları negatif kontrol olarak PBS ile veya e coli kültüründen saflaştırılmış rekombinant GP 96 ya da 15 zero tümör doku hücrelerinden saflaştırılmış GP 96 ile pulse edildi; ardından bunlar LG 15 yetişkin alıcılara adaptif olarak transfer edildi ve üç gün sonra canlı 15 zero tümör hücreleri subkütan enjeksiyonla transplant edildi. Challenge sonrası ilk ortaya çıkan tümörler izlendi ve tümör boyutu periyodik olarak ölçüldü; bu grafiklerde her eğri, bir kurbağadaki tümör büyüme kinetiğini temsil etmektedir. Sonuçlar, 0,5 veya 1 µg GP 96 ile prime edilen hayvanlarda, kontrol gruplarına kıyasla tümör ortaya çıkışının anlamlı düzeyde geciktiğini göstermektedir. Bu nedenle, GP 96, xenopus'ta tümör antijenlerinin çapraz sunumunu kolaylaştırmaktadır.

Böylece, deri greftleme ve tümör transplantasyonu deneyleri aracılığıyla, kurbağa *Xenopus laevis*'te GP 96'nın hem minör hem de tümör antijenlerini sunma yeteneğinin nasıl incelendiğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, bir kan damarı hasar görmüşse periton lavajı toplamaktan kaçınmak önemlidir; çünkü hücrelerin çoğunluğu makrofajlar değil, eritrositlerdir. Ayrıca, deri greftini manipüle ederken hasarı önlemek amacıyla dokuyu forsepsle sıkmamaya özen gösterilmelidir.

İşte bu kadar. Yıkama işlemi için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.