Name: Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin Xenopus laevis kurbağalarında gp96 ısı şok proteininin antijen spesifik CD8 T hücre yanıtlarını nasıl tetiklediğini. Bu yöntem, tümör ve deri antijenlerinin çapraz sunumunu araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tina Martin ve David Albright tarafından sağlanan uzman hayvancılık minnetle takdir edilmektedir. Bu araştırma, NIH hibe T32-AI-07.285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCK), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059.830-06 tarafından desteklenmiştir.

1. Hayvanlar X. laevis x X Gilli melezleri LG-6 ve LG-15 isogenetic klonlar 1 University of Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm) üreyen koloni. LG-6 ve LG-15 payı aynı heterozigot MHC haplotip (a / c), ancak küçük histokompatibilite (H) lokusların farklı. Bu klonlar Döl diploid yumurta dişi tarafından üretilen UV ışınlanmış sperm (döl hiçbir DNA katkısı) tarafından aktive edildiği gynogenesis tarafından üretilmektedir. Eldiven kullanımı fakültatif. Bazı insanlar kurbağaların işlemek için daha zordur (kaygan) ve aslında kurbağaları rahatsız görünüyor, çünkü onları giymek için tercih ediyor. 2. Tümör 15 / 0 (tümör H-Ag Minor ifade) saflaştırılması gp96 Gp96 arıtma, daha önce 2, 3 tarif edilmiştir. Kısaca, gp96 CONA-sepharose ve DEAE kromatografisi% 50-70 amonyum sülfat fraksiyonasyon arındırılır. Protein, 20-50 mg 1 ml tümör dokusu başına elde edilebilir. Hazırlık Saflık SDS-PAGE ve şerit boyama tarafından belirlenir. 3. Minör H-Ag-LG-6 Kurbağalar birbirinden farklı Periton lökositler (PL) ortaya çıkarılması ve Hasat <ol><li> 25 ml gecede E. büyütün 37 50 ml konik bir tüp içinde Coli kültür ° C sallayarak ile . </li><li> Ertesi gün ısı 1 saat kaynatarak bakterileri öldürmek. </li><li> E. öldürülen ısı Santrifüj 2,000 rpm (1.500 g), 4 ° C 15 dakika için Coli </li><li> Süpernatantı ve 1 / 10 th APBS özgün kültür hacmi (2,5 ml) bakteriyel pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bu noktada bakteri kültürü kullanıma hazırdır ve 24 saat içinde kullanılması gerekir. </li><li> Intraperitoneal (ip) 200 (2 inç kurbağa için) veya 25 gauge 5 / 8 iğne kullanarak kurbağa ortalama ısı ile öldürülmüş bakteri hazırlık 300 mcL (3 inç kurbağa için) enjekte edilir. </li><li> Intraperitoneal lavaj enjeksiyon PL üç gün sonra hasat edilir. </li><li> PL hasat önce tüm hareketleri geçene kadar (süre boyutu ve yaş bağlıdır), erişkin kurbağalar, 5 dakika kadar sodyum bikarbonat ile tampon tricaine metan sülfonat (TMS, MS-222),% 0.1 'lik sulu çözelti daldırma tarafından anestezi. Hayvanlar tedaviden sonra 10-20 dakika içinde uyanıyorum. </li><li> Kurbağa karın% 70 etanol küçük bir miktarı ile dezenfekte edin. </li><li> 5 ml (2 inç kurbağa için) ya da 10 ml steril APBS oda sıcaklığında 18 gauge 1 ½ iğne kullanarak periton boşluğuna önceden ısıtılmış (3 inç kurbağa için) enjekte edilir. İğneyi çıkarın ve vücut boşluğunda sıvı enjekte tampon equilibrates sigortalamak için bir dakika kurbağa hafifçe masaj yapın. </li><li> Temiz bir 50 ml konik tüp içine iğne arka damla periton sıvısı toplamak için bir şırınga olmadan yeni bir 18 gauge 1 ½ iğne kullanın. Ilk enjekte edilen hacim olarak mümkün olduğunca çok almak emin olun. , Karın bölgesi, merkezi bir bölgede kan damarları önlemek için dikkatli olun. </li><li> Onun kafesine geri konabilir bu noktada uyanık kadar sığ su ile bir kap içinde bir kez PL kurbağa hasat edilir. </li></ol> 4. Lg-6 Pls Naive Lg-6 Alıcılar içine attığı Kabul edilmiş Transferi <ol><li> PL soğuk APBS ile bir kez yıkayın ve 10 dakika 4 ° C için 1.000 rpm (750 g) santrifüj </li><li> Süpernatantı ve APBS PL tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 5 x 10 5 PL başına 1 mg gp96 bir konsantrasyon gp96 PL Pulse. </li><li> Gp96 uygun miktarda PL eklendikten sonra 1 saat pipeting ve buz üzerinde inkübe karıştırın. </li><li> Bağlanmamış gp96 kaldırmak için 1000 rpm 10 dakika 4 ° C ya da 1 dakika 14.000 rpm'de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Hiçbir kalıntı gp96 sol olmadığından emin olmak için soğuk APBS 3X PL yıkayın. </li><li> Darbeli PL 300 mcL başına 5 x 5 10 PL bir konsantrasyon tekrar </li><li> PL Adoptively 25 gauge 5 / 8 iğne kullanarak ip enjeksiyon yoluyla aktarın. Darbeli PL (5 x 10 5 hücre) hayvan başına 300 mcL enjekte edilir. </li><li> Kurbağalar, deri grefti ya da tümör meydan deneyleri ile devam etmeden önce en az 3 gün astarlanmalıdır gerekir. </li></ol> 5. Cilt Greft Testi Deri grefti reddi Xenopus 4, 5, 6, köklü bir testtir. Xenopus, alıcının, 21-22, 18-22 gün içinde 1 veya 2 MHC haplotip uyumsuzlukları displaying bağış deri ° C reddeder Buna karşılık, LG-6 ve sadece küçük H-Ag tarafından farklı LG-15 klonları arasında deri grefti (fazla 30 gün olduğunu) daha yavaş reddedilir. Ancak, bu ret alıcıları tha hızlanırt önceki bir deri grefti ya da donör arınmış gp96 ile bağışıklama ya donör küçük H-Ag karşı astarlanmış edilmiştir. Hiç ret verici ve alıcının genetik (klonlanmış, örneğin ya da tamamen kendilenmiş hayvanlar) aynı zaman oluşur. Bu nedenle, bu basit tekniği, in vivo immün yanıtları karakterize gp96 tarafından ortaya çok güçlü . <ol><li> 3.7 'de açıklandığı gibi donör kurbağa anestezisi. Not: Xenopus toplam aseptik işlemler için ihtiyacı ortadan kaldırır ciltte güçlü anti-mikrobiyal peptidler (örneğin, magainin) üreten bu yana sadece minimum önlemler alınması gerekir. Aslında, herhangi bir dezenfektan ile kurbağa tedavisi, cilt için zararlı olacaktır. Buna ek olarak, insanlar için transfer edilebilir herhangi bir patojenlerin Xenopus zorunda değilsiniz . Bu nedenle, eldiven kullanımı isteğe bağlıdır. Ancak, kullanılan tüm diseksiyon aletleri otoklava gereken ve tüm çözümler, steril olması gerekir. </li><li> Makas kullanarak LG-15 donör kurbağa ventral deri parçası (irridophore pigmentli hücrelerin varlığı nedeniyle gümüşi görünen karın cilt) (X 5 mm 20 mm) kesin ve küçük bir çıkarın. </li><li> Petridish içeren APBS cilt koyun ve buz üzerinde tutmak. Çok nazik deri dokusunun işleyin; forseps arasında tutarak önlemek. </li><li> Bir jilet veya makas kullanmak, 5 mm X 5 mm adet bireysel greft içine kesti. Buz üzerinde APBS parçaları tutun. </li><li> Bu noktada uyanık antibiyotikler (5 mg / L konsantrasyonu az Penstrep) içeren su konur ve ardından kadar donör kurbağa sığ su ile bir kap konur. Kurbağa, iki gün boyunca normal su döndürülür noktası antibiyotik ile su tutulur. Cilt kaldırıldı yerinde küçük bir yara dikili olması gerekir ve bir hafta içinde iyileşir değildir. </li><li> Alıcı LG-6 kurbağa anestezisi. </li><li> Alıcının dorsal (arka) cilt üzerinde küçük bir kesi yapın ve gümüşi tarafı ile cilt altında 5 mm x 5 mm greft yerleştiriniz. Deplasman hatta greft kaybına yol açabilir, çünkü cilt altında büyük hava kabarcıkları tanıtmak için değil, dikkatli olun. </li><li> Puanlama başladığında bu greft reddi olarak sayılmaz çünkü greft makas ve forseps işaretler not emin olun. </li><li> 24 saat sonra kaplanacağı ana cildin bir parçası greft kaldırılması gerekiyor. </li><li> Alıcı LG-6 kurbağa anestezisi. 5.1 'de açıklandığı gibi hayvan tutun. </li><li> Greft serbestçe görüntülenmiştir böylece otoklavlanmış makas kullanılması greft etrafında bir pencere kesip. Donör cilde dokunmak veya kanamaya neden dikkatli olun. 5.5 'de açıklandığı gibi kurbağa kurtarmak olsun. </li><li> Bir kroki alarak greft puanlama hemen başlayın. Cilt greft reddi aşılı cilt irridophores imha yüzde belirlenir. </li><li> Greftler, her 2-3 günde bir kontrol edilmesi gerekiyor, ancak bu hayvanların anestezi gerekmez. Greft görselleştirmek için, kurbağa diseksiyon mikroskobu altında bir petridish yerleştirilmesi gerekir. </li></ol> 6. Tüm montaj nakledilen Cilt İmmunohistolojik Kurbağa bütün montaj İmmunohistolojik daha önce 6 tarif edilmiştir. Kısaca, kurbağa, anestezi ve steril bir kağıt havlu üzerine kurbağa su (çalışma alanı da aseptik olarak hazırlanmış) ile ön ıslak mikroskop altında yerleştirilir. Nakledilen deri daha sonra ev sahibi cilt çevreleyen küçük bir miktar ile birlikte hasat ve benzer antikorların akış sitometri analizi 6 için hücre boyama ile boyandı. Otoklavlı aletleri ve steril tamponlar kullanılması gerekir. Deri boyama sonra bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve yavaşça bir kapak kayma ile bastırdı. Bu noktada deri grefti sızmışlar farklı hücre popülasyonlarının floresan mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir. İşlemden sonra kurbağa bölüm 5.5 'de açıklandığı gibi, antibiyotik ile su tutulur. ve normal su döndü. Cilt kaldırıldı bıraktığı yerde küçük bir yara, bir hafta içinde iyileşir. 7. Kan lökosit Karakterizasyonu <ol><li> Kurbağa kan çıkarmadan önce, bir ateşte steril Pasteur pipetler çekerek "cam iğneler" hazırlamak gerekiyor. Pipet ince ekstremite stereomicroscope altında bilenmiş. Pipet sonra bir aspirasyon plastik tüp bağlıdır. Forseps ve makas gibi tüm araçları kullanmadan önce otoklava gerekir. </li><li> Ayrıca APBS, 1 ml başına heparin 50 ünite ekleyerek APBS ve heparin çözüm buz 10 ml hazırlamak. Çözüm buz üzerinde tutun. Kullanılan tüm çözümler, steril olması gerekir. </li><li> 3.7 'de açıklandığı gibi kurbağa anestezisi, ve 5.1' de açıklandığı gibi aynı hayvan işlemleri uygulayın. . </li><li> Kes cilt ortaya çıkarmak için arka ayak üstündedorsal tarsus ven. </li><li> 1-2 mL APBS + heparin çözüm Pasteur pipeti ile doldurun. </li><li> "Cam iğne" damar içine yerleştirin ve yavaş yavaş ağız ile aspire kan toplamaya başlar. Bu alınan kan pıhtılaşmasını ve iğne ucu tıkanmasını önlemek çünkü "cam iğne" APBS + heparin çözüm olması önemlidir. </li><li> 1 2 mL kan, bir ortalama büyüklükteki kurbağa elde edilebilir. </li><li> Kurbağa bacağı üzerinde küçük bir kesi dikilir olması gerekmez ve bir hafta içinde yara iyileşir. </li><li> 1000 rpm'de 10 dakika süreyle kan Santrifüj 4 ° C </li><li> Süpernatantı ve soğuk APBS 10 ml 1X hücreleri yıkayın. </li><li> Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma), kırmızı kan hücreleri kan lökosit ayırmak için oda sıcaklığında önceden ısıtılmış 1 ml üzerine kan Yerleşimi 2 mL (1-5 x 10 6 hücre) . </li><li> Herhangi bir fren ile oda sıcaklığında 1000 rpm'de 20 dakika santrifüj, ve sonra lökosit bant toplamak. </li><li> 4 10 dakika 1400 rpm'de santrifüj yoluyla APBS ile 2X hücreleri yıkayın ° C kalan Ficoll kaldırmak. </li><li> Bu noktada hücreler flow sitometri analizi için antikorlar ile boyanarak hazır, ya da in vitro kültür analizleri için kullanılacak olması . </li></ol> 8. Tümör Nakli Testi <ol><li> Yaklaşık bir hafta önce yeni bir 15 / 0 tümör hücrelerinin toplu ve hücreler büyümeye başlar emin olun dışarı deney çözülme. Kültür orta özlü bir sonraki bölümde ve 3 daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. </li><li> 15 / 0 tümör hücrelerinin genişletin. </li><li> Deney günü, hücre sayımı ve Tripan mavi dışlama hücre ölümü belirlemek. Hücre ölümü% 5'inden az olmalıdır. 4 1.000 rpm'de soğuk APBS 1X hücreleri ve santrifüj yıkayın ° C 10 dakika. </li><li> 300 mcL başına 5 x 5 10 15 / 0 hücre yoğunluğu, tümör kültür ortamı hücreleri tekrar </li><li> Nakli 5 hayvanın sırt (arka) kısmı bir tarafta 25 gauge 5 / 8 iğne ile cilt altı enjeksiyonu ile kurbağa başına 300 mcL hacmi x 10 5 hücre . </li><li> Tümör büyüme tümör meydan sonra 2-3 hafta içinde başlayacak. Ilk tümör görünüm belirtti ve tümör hacmi 2-3 günde kaydedilen gereken olmalıdır. Tümör hacmi (yükseklik X uzunluk x genişlik) kaliperler kullanılarak ölçülür. </li><li> Tümör 3.500 mm 3 büyür ya da kurbağa uyuşuk görünümlü başladıktan sonra, bu rahatsızlığı önlemek için ötenazi gerekir. </li></ol> 9 - Reaktifler Gerekli: <ul><li> 6.6 g / L NaCl, 1.15 g / L Na 2 HPO 4, 0.2 g / L KH 2 PO: Amfibi Fosfat Tamponlu Salin (APBS). 10N NaOH ve filtre kullanılarak pH 7.5 filtre 0.2 mikron ile sterilize. </li><li> Tricaine Metan sülfonat (TMS, MS-222) (Crescent Araştırma Kimyasallar CAS # 886-86-2). </li><li> Sodyum bikarbonat (Fisher Scientific S-233-500). </li><li> Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10.771-100 ml) </li><li> Heparin Sodyum Tuz (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Xenopus 15 / 0 tümörleri için kültür ortamı [3 Daha fazla bilgi için bakınız]: 10 ml İnsülin, 10 ml non-esansiyel amino asitler, 10 ml penisilin-streptomisin Iscove DMEM bazal orta 1 L (Gibco-Invitrogen 11.965); 10 mikrogram / mL Kanamisin; primatone (Sheffield Ürünleri Bölümü), β2-mercaptoethanol 1 mL ve su içinde 3.02 g NaHCO 3 (pH 7.0) 3 ml. Bu ortam,% 30 çift distile su ekleyerek amfibi ozmolarite seyreltilmiş ve% 5 fetal sığır serumu, Xenopus böbrek hücre hattı A6% 20 superantant, ve% 0.25 'normal Xenopus serum ile desteklenebilir. </li></ul> 10 Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 deri grefti reddi transplantasyon sonrası 12 gün stereomicroscopic analiz. LG-6 klonlanmış kurbağa (A) aynı MHC-LG-6 ya da bir deri grefti (reddi gösterir) veya (B) birbirinden farklı MHC-outbred bir donör (80% reddi). Oklar gümüşi iridophore pigmentli hücreleri sağlıklı (non-reddedilen) aşılı doku işaretleme gösterir. (*) Mark reddi nedeniyle forsepsi. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Gp96 Xenopus tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırır. APBS (negatif kontrol), 1 mg, bir E. arınmış rekombinant gp96 ya da buz üzerinde 1 saat darbeli LG-15 PL (5 x 10 5 ) Gp96 Coli kültür, ya da 1 veya 0.5 mg 15 / 0 tümör dokusu arınmış. 3 yıkar sonra, hücreler adoptively LG-15 yetişkin alıcılara transfer edildi (1 x 10 6 / bireysel). Üç gün sonra, 15 / 0 tümör hücrelerinin (5 x 10 5) canlısc enjeksiyon yoluyla nakledilen. Her eğri bir kurbağa tümör büyüme kinetiği temsil eder. Tümörler ilk ortaya çıktıkları gün sonrası meydan monitörize edildi ve tümör boyutu, bir kaliper (uzunluk x genişlik x kalınlık) ile periyodik olarak tespit edildi.

<ol><li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li>
<li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li>
<li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis%3A+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li>
<li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li>
<li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li>
<li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li>
<li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li>
<li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity%3A+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li>
</ol>

Amfibi Xenopus bağışıklık çalışmak için benzersiz çok yönlü olmayan memeli modeli. Biyomedikal ve immünolojik araştırmalar yaygın kullanımı MHC tanımlanan klonlar LG-6 ve LG-15 gibi farklı hücre hatları ve monoklonal antikorlar gibi birçok önemli araştırma araçları vermiştir. Güçlü Ag-özel, küçük bir anti-H-Ag ve anti-tümör T hücre yanıtları 7 arabuluculuk gibi gp96 ısı şok proteinleri yeteneği çalışma in vitro ve in vivo deneylerde farklı kurduk bu araçları kullanma . Bu model sistem bize d...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Gerekli Reaktifler:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amfibi Fosfat Tamponlu Tuzlu Solüsyon (APBS): </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 1.15 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.2 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trikain Metan Sülfonat (TMS, MS-222) </td><td>Crescent Research Chemicals</td><td>CAS#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat </td><td>Fisher Scientific</td><td>S-233-500</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Heparin Sodyum Tuzu </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus 15/0 tümörleri için kültür ortamı [daha fazla detay için bkz. 3]:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove DMEM bazal ortamı</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primatone</td><td>Sheffield Products Division</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%30 çift distile su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%5 fetal bovin serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%20 Xenopus böbrek hücre hattı A6 süpernatantı </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0,25 normal Xenopus serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Malzemeler ve Ekipmanlar:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ve 15 ml konik santrifüj tüpleri (steril)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 gauge 5/8 Precision Glide steril iğneler</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 gauge 1&amp;frac12; Precision Glide steril iğneler</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Tüberküloz Şırıngası, Slip Tip, steril</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Şırınga, Slip Tip, steril</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml MikroSantrifüj tüpleri (steril)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 X 15 mm Polistiren Petri Kapları, steril</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jiletler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Mikroskop Lamları </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm cam petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; Pasteur Pipetleri, Durex Borosilikat Cam, Pamuk Tıpalı, Tek Kullanımlık</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon hortum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İki adet # 5 İsviçre Saatçi&amp;rsquo; Penseti</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Yaylı Makas, McPherson-Vannas düz kesim kenarlı 6 mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helios kumpaslar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek yoğunluklu aydınlatma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bek sempurna beki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C çalkalamalı inkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

karşılaştırmalı in vivo</emkurbağa gp96 adjuvanlık> eğitim xenopus laevis</em

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Amfibi Xenopus geliştirilen chaperoned antijenlerin çapraz sunum kolaylaştırmak ve doğal ve adaptif T hücre tepkiler. Xenopus deri grefti reddi gibi gp96 olarak belirli bir ısı şok proteinleri (HSP) yeteneği çalışma olmayan eşsiz bir memeli modeli laevis klasik MHC sınıf Ia (sınıf Ia) kısıtlı T hücre yanıtlarını ortaya çıkarmak için gp96 yeteneğini araştırmak için mükemmel bir platform sağlar. Ayrıca, Xenopus model sistem, böylece bağışıklık gözetim kaçan kendi sınıf Ia molekülleri aşağı düzenlenmiş tümörlere karşı tepkiler oluşturmak için gp96 yeteneği keşfetmek için farelere de cazip bir alternatif sağlar . Son zamanlarda, peritoneal lökosit antijen sunan hücreler (APC) olarak kullanarak Xenopus klonları bir evlatlık hücre transferi tahlil ve gösterdi ki küçük histokompatibilite cilt antijenlere karşı yanı sıra, Xenopus timik tümör 15 karşı in vivo gp96. Başbakan CD8 T hücre yanıtlarını sınıf Ia molekülleri ifade etmez / 0. Burada periton lökositlerin ortaya çıkarma, attığı evlatlık transferi, yanı sıra deri grefti ve tümör nakli deneyleri dahil olmak üzere bu testleri gerçekleştirmek için ilgili metodoloji açıklanmaktadır. Ayrıca biz de, periferik kan lökositleri akım sitometri ve cilt ret ve anti-tümör cevapların yer efektör nüfus daha fazla karakterizasyonu için izin proliferasyon deneyleri için kullanılan toplama ve ayırma nitelendiriyor.

Kurbağa<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Antijen-spesifik CD8 T hücre yanıtları teşvik etmek gibi gp96 ısı şoku proteini yeteneği keşfetmek için cazip bir alternatif olmayan memeli modeli sağlar. Biz yöntemleri eğitim sunmak<em&gt; In vivo</em&gt; Gp96 tarafından cilt ve tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırma.

Karşılaştırmalı In vivo</emKurbağa gp96 adjuvanlık> Eğitim Xenopus laevis</em

gp96 gibi belirli ısı şok proteinlerinin (hsps) ... yeteneğini incelemek amacıyla, amfibi Xenopus laevis üzerinde benzersiz bir memeli dışı model geliştirdik.

Bu prosedürün genel amacı, ısı şok proteini GP96'nın kurbağa *Xenopus laevis*'te antijene özgü CD8 T hücresi yanıtlarını teşvik etme konusundaki evrimsel korunum yeteneğini incelemektir. Bu işlem, öncelikle peritoneal lavaj yoluyla peritoneal lökositlerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, inkübasyon ve yıkama işlemlerinin ardından, peritoneal lökositlerin, minör ve tümör antijenlerine şaperonluk yapan tümör kaynaklı GP96 ile pulse edilmesidir.Tümör veya minör histokompatibilite antijenlerine karşı bu kurbağaları duyarlı hale getirmek amacıyla, peritoneal lökositler intraperitoneal enjeksiyon yoluyla naif kurbağalara adaptif olarak transfer edilir. Prosedürün üçüncü adımı, duyarlı hale getirilmiş kurbağalara ya deri grefti uygulamak ya da tümör ile challenge etmek ve deri grefti reddinin başlangıcını veya tümör oluşumunu izlemektir. Prosedürün son adımı, deri reddi ve anti-tümör yanıtlarında yer alan T hücrelerini karakterize etmek için periferik kan örneği almaktır.Nihayetinde, deri greftleme ve tümör meydan okuma deneyleri aracılığıyla, sırasıyla GP 96 ile ön işlem görmüş kurbağalarda deri grefti reddinin önemli ölçüde hızlandığı ve tümör ortaya çıkışının ge

comparative-vivo-study-gp96-adjuvanticity-frog-xenopus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

DA sıçanlarda kronik relapsing deneysel otoimmün ensefalomyelit: Bu video, multipl skleroz bir hayvan modeli indüksiyonu ve klinik skorlama göstermektedir. Tüm sıçan omurilik ve tam Freund adjuvan içeren bir emülsiyon immunizing fareler tarafından uyarılan hastalık, insan hastalığına benzer klinik belirtiler sunar.

İndüksiyon ve Kronik Relaps Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Klinik Puanlama

Bazı fare suşlar miyelin temel protein olan deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) indüksiyon karşı edebiliyoruz. Burada anlatılan yanıtsızlık tersine çevirir ve birkaç tipik EAE dirençli fare lekeler paralitik hastalığın neden basit bir bağışıklama protokoldür.

Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Bu video, bir murin modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonu oluşturmak için etkili bir homojenizasyon tekniğini göstermektedir. Emülsiyon, inaktive edilmiş bir patojenik bakteri içeren sürekli bir yağ fazı ile çevrili su fazında bir otoantijen - miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) içerir. Emülsiyon, uzun süreli bir bağışıklık tepkisi için sürekli bir antijen salınımı sağlar.

Otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonunun hazırlanması

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

İnterferon-gamma ELISpot tahlil için eskiden şiling şimdi domuz PBMCs gelişimi bulaşıcı hastalıklar çalışmak için son derece alakalı bu modelde T hücreli yanıt karakterizasyonu sağlar. DNA aşıları intradermal teslimatla ilişkili T hücre yanıtları ölçmek için tahlil başvurdum.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund'un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi

Burada, transkriptomik ve proteomik çalışmalar için Afrika pençeli kurbağalarından doku örnekleri hazırlamak için etkili bir hızlı kan perfüzyon protokolü sunulmaktadır.

Ksenopusta etkili hızlı kan perfüzyonu

Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55'i kullanıyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi

Öğrenin Xenopus laevis kurbağalarında gp96 ısı şok proteininin antijen spesifik CD8 T hücre yanıtlarını nasıl tetiklediğini. Bu yöntem, tümör ve deri antijenlerinin çapraz sunumunu araştırmak için kullanılır.

Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis

Daha fazla video keşfet