PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, RNA bağlayıcı proteinlerin veya RVP'lerin transkriptom geniş bağlanma bölgelerini belirlemektir. Bu, ilk olarak, yeni ortaya çıkan transkriptlerin in vivo etiketlenmesi için fotoreaktif nükleosit analogları kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, RNA ve RNA bağlayıcı proteinleri 365 nanometre UV ışığı ile çapraz bağlamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, araştırılan RNA bağlayıcı proteini immüno-çökeltmek ve RNA'ya çapraz bağı geri kazanmaktır. Prosedürün son adımı, RNA'yı bir CD NA kütüphanesine ve derin diziye dönüştürmektir. Sonuç olarak, RVP'lerin transkriptom geniş bağlanma bölgelerini gösteren ve RNA tanıma elemanının tanımını ve bağlanma tercihlerini mümkün kılan sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, benim adım New York'taki Rockefeller Üniversitesi'ndeki Tom SEL'in laboratuvarından Marcus Hoffner. Bugün, par dudak veya fotoable kaburga nükleoziti, analog, geliştirilmiş çapraz bağlama ve immünopresipitasyon adı verilen bir yöntem göstereceğiz. Laboratuvarımızda, RNA bağlayıcı proteinlerin ölçek bağlanma yerlerini ve bunların bağlanma motiflerini ve tercihlerini bir transkriptom üzerinde tanımlamak için bu prosedürü kullanıyoruz.

Tamam, hadi başlayalım. İn vivo UV çapraz bağlama, laminer akış başlığında başlar. Bu protokolde steril teknik kullanılarak örnek model olarak etiketlenmiş IGF iki BP tek hücre kullanılacaktır.

HEK 2 93 hücre kültürü ortamında 100 ila 400 kez 10 kez altıncı hücrelere kadar kullanarak, HA etiketli IGF etiketli IGF iki BP bayrağını kararlı bir şekilde ifade eden HEK 2 93 hücrelerini genişletin ve bunları yaklaşık %80 co akıcılığına kadar büyütün. Çapraz bağlanmadan 14 saat önce, hücreler tiyo üridin veya SU için doğrudan hücre kültürü ortamına fotoreaktif ribozit analoguna sahipti. Alternatif olarak, fotoreaktif ribozit indükleyici ekspresyonunun eklenmesini takiben altı inci gine veya altı SG kullanılabilir, HA etiketli IGF iki BP, biri doksisiklin hücrelerinin eklenmesiyle daha sonra hücre inkübatörde gece boyunca inkübe edilir.

Ardından, büyüme ortamını boşaltın. Daha sonra hücreleri bir kez plaka başına 10 mililitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Ardından PBS'yi boşaltarak tamamen çıkarın.

Açıkta kalan plakaları buzlu bir tepsiye yerleştirin ve UV radyasyonunu takiben bir istifli bağlayıcı 2, 400 UV çapraz bağlayıcı veya eşdeğerinde 365 nanometre UV ışığı ile ışınlayın, hücreleri plaka başına bir mililitre PBS'de bir lastik polis memuru ile kazıyın. Hücreleri 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin. Süper adı atın ve hücre peletini koruyun.

Bu noktada, hücre peletleri sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulabilir ve en az 12 ay boyunca eksi 80 derecede saklanabilir. Prosedüre devam etmek için, reus peleti bir X NP 40 lizis tamponunun üç hacminde askıya alın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücre lizatını dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 13.000 G'de santrifüjleme ile temizleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, lizatı beş mikronluk bir membran şırınga filtresinden süzerek daha da temizleyin. Son olarak, mikrolitre başına bir birimlik nihai konsantrasyona RNA'lar T ekleyin ve 15 dakika boyunca 22 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Daha sonra, reaksiyonu buz üzerinde beş dakika soğutun.

İn vivo UV çapraz bağlamayı takiben. Manyetik boncukları immünopresipitasyon için hazırlayın. Bir mil hücre lizatı başına 10 mikrolitre dyna boncuk protein G manyetik partikülünü 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra boncukları içeren tüpü bir ila iki dakika manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve manyetik ayırıcı üzerindeyken tüpe bir mililitre sitrat fosfat tamponu ekleyin. Ardından, tüpü kapatın ve boncukları yeniden askıya almak için numuneyi girdaplayın.

Tüp kapağında kalan boncukları toplamak için kısa bir süre santrifüjleyin. Bu yıkamayı ilave bir mililitre sitrat fosfat tamponu ile tekrarlayın. Yıkama tekrarını takiben, boncukları ve sitrat fosfat tamponunu orijinal pancar süspansiyonu hacminin iki katı bir hacimde askıya alın.

Ardından, bir mililitre beat süspansiyonu başına 0.25 miligram Anti-Flag M iki monoklonal antikor ekleyin. Süspansiyonu inkübasyondan sonra oda sıcaklığında 40 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin, boncukları daha önce tarif edildiği gibi bir mililitre sitrat fosfat tamponunda iki kez yıkayın, bu yıkama, yıkama Resus'u takiben herhangi bir bağlanmamış antikorun çıkarılmasına hizmet eder, boncukları askıya alın ve sitrat fosfat tamponu dörtten önce olduğu gibi. İmmünopresipitasyona başlamak için, taze hazırlanmış antikor konjuge manyetik boncukları, RNA'ların T one ile muamele edilmiş hücre lizatına ekleyin.

Karışımı 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede bir saat döndürün. İnkübasyondan sonra, manyetik boncukları toplayın, süpernatan yeniden süspanse boncukları bir mililitre IP yıkama tamponunda atın ve bunları 1.5 mililitre santrifüj tüplerine aktarın. Boncukları daha önce anlatıldığı gibi bir mililitre IP yıkama tamponunda iki kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, boncukları IP yıkama tamponunun orijinal boncuk hacminde tekrar askıya alın. Ardından, mikrolitre başına 100 birimlik bir nihai konsantrasyona RNAT bir ekleyin. Boncuk süspansiyonunu 22 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra süspansiyonu buz üzerinde beş dakika soğutun. Daha sonra, boncukları bir mililitre yüksek tuzlu yıkama tamponunda üç kez yıkayın. Daha sonra boncukları bir orijinal boncuk hacminde defosforilasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Buzağı bağırsak alkalin fosfatazı mikrolitre başına 0.5 birimlik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve süspansiyonu 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Boncukları bir mililitre fosfataz yıkama tamponunda iki kez ve ardından DTT olmadan polinükleotid kinaz veya PNK tamponunda iki kez daha yıkayın. Son olarak, boncukları bir orijinal boncuk hacmi PNK tamponunda yeniden askıya alın.

Çapraz bağlı RNA'nın radyo etiketlemesine başlamak için. Taze hazırlanmış boncuk süspansiyonunun bir orijinal boncuk hacmine gama 32 PATP ve T dört PNK ekleyin. Süspansiyonu 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, süspansiyona radyoaktif olmayan bir TP ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra manyetik boncukları DTT olmadan 800 mikrolitre PNK tamponu ile beş kez yıkayın. Son olarak, boncukları 70 mikrolitre SDS sayfasında yeniden askıya alın.

Yükleme tamponu: İmmün çökeltilmiş RNA bağlayıcı proteinleri çapraz bağlı RNA ile denatüre etmek ve serbest bırakmak için radyo etiketi süspansiyonunu 95 santigrat derecede bir ısı bloğunda beş dakika inkübe edin. Daha sonra ayırıcı üzerindeki manyetik boncukları çıkarın ve süper natini temiz bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın Novox bis triss dört ila %12 prekast poli akrilamid jelin oyuğuna 40 mikrolitre süet yükleyin ve jeli 200 voltta 55 dakika çalıştırın. Jel çalıştıktan sonra, jel haznesini sökün ve plakaları sökün, jelin fosfo görüntüleyici kağıt çıktısına hizalanmasını kolaylaştırmak için jeli bir plaka üzerinde takılı bırakın.

Jel köşelerine asimetrik olarak üç küçük radyoaktif jel parçası implante edin. Kontaminasyonu önlemek için jeli Saran sargısı gibi plastik bir filme sarın. Jeli bir saat boyunca boş bir fosfo görüntüleyici ekranına ve bir fosfo görüntüleyiciye maruz bırakın.

Ardından, yönlendirme için implante edilmiş jel parçalarını kullanarak jeli fosfo görüntüleyici çıktısının üzerine hizalayın. RNA bağlayıcı proteinin veya RBP'nin beklenen boyutuna karşılık gelen bantları kesin. Bantları bir dtu diyalizör MIDI tüpüne aktarın ve 800 mikrolitre çalışan bir arabellek elektro elüt ekleyin.

Çapraz bağlı R-N-A-R-B-P kompleksi, üreticinin talimatlarına göre iki saat boyunca 100 voltta. Elektro elüsyonu takiben. Proteinaz K tamponu ve proteinaz K ekleyin, çözeltiyi 55 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

RNA'yı asidik fenol kloroform izoamil alkol ekstraksiyonu ve ardından bir kloroform ekstraksiyonu ile geri kazanın. Daha sonra bir mikrolitre glikojen ekleyin ve üç hacim etanol ekleyerek RNA'yı çökeltin. Son olarak elde edilen peleti 10,5 mikrolitre suda çözün.

RNA geri kazanıldıktan sonra, onu standart bir CDNA kütüphanesi hazırlama protokolünden geçirin ve dizi okumalarının dikkatli bir biyoinformatik analizini yapın. HK 2 ile gerçekleştirilen bir par klip için temsili sonuçlar, H ha etiketli IGF, iki BP bir bayrak ifade eden 93 hücre, fotoreaktif nükleosit analogları ile gösterilir, dört SU ve altı SG, alternatif fotoreaktif ribozit altı SG'nin çapraz bağlama verimliliği genellikle dört su'dan daha düşüktür. Daha düşük çapraz bağlama verimliliği, bol miktarda hücresel RNA'nın parçalarından türetilen dizilerin daha yüksek bir arka planına neden olabilir ve bu nedenle deney için başlangıçta daha fazla hücre kullanılmalıdır.

Farklı par klip fotoreaktif üridin analogları, burada görüldüğü gibi geleneksel UV 2 54 nanometre çapraz bağlama veya klips ile karşılaştırılır. UV 2 54 nanometre RNA proteini çapraz bağlama, sınırlı çapraz bağlama verimliliğine sahiptir. Uygun büyüklükteki radyoaktif bandın yoğunluğu, par klip deneyinin işe yarayıp yaramadığını ve küçük bir RNA dizileme protokolünü taşımak için yeterli RNA'nın izole edilip edilmediğini gösterir.

Biyoinformatik analizi takiben dizilenmiş okumalardaki karakteristik mutasyonların frekansları, başarılı bir şekilde çapraz bağlı dizilerin göstergesidir. Bu mutasyonlar, dört SU kullanıldığında T iki C geçişi ve başarı kullanıldığında G iki A geçişidir. G. Park dudağının tanımlayıcı özelliği, geri kazanılan RNA'lardan hazırlanan CD NA kütüphanelerinde bulunan karakteristik bir mutasyon için skorlama yaparak çapraz bağın yerini elde etme olasılığıdır.

Bu, özel olarak bağlı RNA'lardan türetilen sinyalin, bol miktarda hücresel RNA'nın birlikte izole edilmiş parçalarından türetilen dizilerin gürültüsünden kolayca ayrılmasına izin verir. Bu yüzden bugün size, özellikle RNA bağlayıcı proteinler tarafından tanınan RNA segmentlerini nasıl izole edeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken.

RNA'ların serbest çalışması önemlidir. İşte bu kadardı. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerde iyi şanslar.