İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

Merhaba, Calor D-U-I-D-U boyama protokolüne hoş geldiniz. Bugün videomuz üçüncü adım olan rehidrasyon, permeabilizasyon ve antijen geri kazanımı ile başlayacaktır. Slaytlarınızı taşıyıcıya yerleştirerek başlayın.

Slaytlarınız yüklendikten sonra, onları beş dakika boyunca bir ksilen banyosuna yerleştirin. Bunu beş dakika sürecek ikinci bir ksilen banyosu takip edecektir.

Slaytlarınızı, %100'lük çözelti ile başlayıp %50'lik çözelti ile bitirerek etanol solüsyonlarına aktararak rehidrasyon işlemine devam edin. Ardından, hücre membranlarını permeabilize etmek için slaytlarınızı beş dakika boyunca 1X PBS içerisine yerleştirerek slayt rehidrasyonunu tamamlayın. Slaytlarınızı beş dakika boyunca %0,2'lik Triton X solüsyonuna daldırın. Slaytlarınızı, solüsyonun slaytların üst kısmının 5 cm üzerine çıkacağı şekilde yeterli hacimde 0,01 molar sodyum sitrat tamponu içeren cam bir behere yerleştirerek mikrodalga doku antijen geri kazanımı için hazırlayın.

Buharlaşma kaybını önlemek için, çözelti kaynayana kadar lamları mikrodalgada ısıtın. Bu işlem tam güçte yaklaşık üç ila 10 dakika sürmelidir. Lamların kaynadığını kontrol edin.

Mikrodalga gücünü %10 ile %80 arasına düşürün ve lamları 20 dakika daha yavaşça kaynatmaya devam edin. Kaynatma işleminin ardından, lamların bulunduğu beheri oda sıcaklığına ulaşana kadar yaklaşık iki saat boyunca yavaşça soğumaları için tezgah üzerine yerleştirin. Lamların oda sıcaklığında olduğunu doğrulayın.

Slaytları oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 1.5 doğal hidroklorik asit içerisinde bekletin. Slaytları hidroklorik asitten çıkarın ve beş dakika boyunca 1x PBS yıkama çözeltisine yerleştirin. Bunu ikinci bir 1x PBS yıkama işlemi takip edecektir.

Slaytlarınızı 1X PBS erişim solüsyonundan çıkarın ve sıvı bloklama balmumu kalemi kullanın. Her bir doku kesitini daire içine alın ve slaytı tekrar PBS'ye yerleştirin. Hava geçirmez bir kabın tabanına ıslak bir kağıt havlu yerleştirerek nemli bir inkübasyon odası hazırlayın.

1X PBS içinde seyreltilmiş %10'luk bloklama serumu ile bloklama çözeltisi hazırlayın. Yaklaşık 1 x 1,5 santimetre boyutlarındaki tipik doku kesitleri için her bir doku kesitinin tamamen çözelti ile kaplanması önemlidir. 50 µL bloklama çözeltisi hacmi yeterlidir.

Fare anti BRDU antisera'sını %5'lik eşek serumu ile seyrelterek primer IDU antikorunu hazırlayın. 1/250 oranında konsantrasyon ekleyin. Primer çözeltiyi her bir lam kesitinin üzerine pipetleyin.

Lamlarınızı dört °C sıcaklıktaki bir buzdolabına yerleştirin. Gece boyu sürecek bir inkübasyon için yüksek stringensli bir yıkama çözeltisi hazırlayın. TBST bu işlem için uygundur.

Lamların sırt sırta gelecek şekilde yönlendirilmesi. Lamları yaklaşık 35 ila 40 milliliters TBST Çözeltisi içerisine yerleştirin. Tüpleri 37 degrees Celsius sıcaklıktaki çalkalamalı bakteri kültür inkübatörüne yerleştirin.

Bunları 20 dakika boyunca 225 RPM'de çalkalayın. Şimdi lamlarınızı bir taşıyıcıya yerleştirin. Beş dakikalık bir PBS yıkaması için lamlarınızı bir XPBS içine yerleştirin.

Ardından beş dakika boyunca ikinci bir XPBS yıkaması yapılacaktır. Sıçan anti BRDU'yu %5 eşek serumunda seyrelterek birincil CLDU antikor çözeltisini hazırlayın. 1:250 konsantrasyonda ekleme yapın, lamları bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve ardından balmumu kalemle işaretleyin.

Her bir doku kesitini primer CLDU çözeltisi ile kaplamak için bir pipet kullanın. Her doku kesitinin tamamen kaplandığından emin olmak için yaklaşık 50 µL çözelti kullanın. Lamlarınızı gece boyunca inkübasyon için 4 °C'lik bir buzdolabına yerleştirin.

Lamlarınızı bir taşıyıcıya yerleştirin ve ardından beş dakika boyunca 1X PBS yıkama çözeltisine koyun. Lamlarınızı beş dakika boyunca ikinci bir 1X PBS yıkama çözeltisine yerleştirin; sekonder antikorları, CY2 donkey anti-RAD ve PS5 donkey anti-mouse antikorlarını %5'lik donkey serumda seyrelterek hazırlayın. Çekirdek boyaması için DAPI de kullanılacaktır; doku kesitlerini sekonder antikorlarla tamamen kaplayın.

Dokunuzu tamamen kaplamak için 50 µL çözelti yeterli olacaktır. Rehidrasyon haznesini oda sıcaklığında, karanlık bir yerde bir saat boyunca inkübe edin. Lamlarınızı bir taşıyıcıya yerleştirin ve ardından beş dakika boyunca bir kez XPBS ile yıkayın.

Lamlarınızı ikinci bir 1X PBS yıkama işlemine beş dakika boyunca bırakın. Fazla PBS solüsyonunu bir kağıt havlu yardımıyla hafifçe dokunarak uzaklaştırın. Ardından, prolonged gold anti-fade montaj medyumunu alın ve her bir doku kesitinin üzerine küçük bir damla yerleştirin.

Bir lamel alın ve dikkatlice slayt kesitlerinizin üzerine yerleştirin. Slayt kesitleri ile lamel arasında hapsolmuş olabilecek fazla hava kabarcıklarını dışarı itmek için bir kağıt havluyu baskı aracı olarak kullanın. Son olarak, kalan fazla hava kabarcıklarını dışarı itmek için bir pipet ucu kullanın. Sonuçları nicelendirmek için, yüksek enerjili bir ışık kaynağı ve çoklu floresan kanallarla donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak ilgi alanınızdaki dokunun görüntüsünü alın.

Dabi pozitif hücrelerin sayısını sayarak başlayın. SI iki kanal görüntüsünü kullanarak CLDU pozitif hücrelerin sayısını sayın. SCI beş kanal görüntüsünü kullanarak IDU pozitif hücrelerin sayısını sayın.

Son olarak, SCI two ve SCI five kanal görüntü dosyaları arasında geçiş yaparak çift pozitif işaretli hücreleri sayın.