Name: Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin, hücrelerle kaplı modüler mikro dokuların üretimini. Kollajen jelleri kullanarak silindirik modüller oluşturun ve endotel hücreleriyle kaplayarak doku mühendisliği deneyleri için in vitro ve in vivo çalışmalarda kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman Ulusal Sağlık Enstitüsü (EB 001.013), Fen Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından sağlanmıştır. Biz onun uzmanlık için Dr. AP McGuigan&#39;ın teşekkür ve modüllerin geliştirilmesi yardımcı.

1) Boru hazırlanması <ol><li> Polietilen borular 2 ila 3 m uzunluğunda (0,76 mm ID x 1.22 mm OD) kesin. </li><li> Hortumun bir ucunu 20 G1 İğneyi. </li><li> Dönüştürücüler kendini kapatmalı (7 1 / 2 "x 13") Bobin boru ve yer. Hortumun iki ucu çanta kaplanmadan sonunda yerleştirilir ve yerde gaz sterilizasyon bandı ile bantlanmış olmalıdır. </li><li> Mühür çanta ve gaz sterilize edin. </li></ol> 2) Nötralizasyon Kollajen Not: 1 ml kollajen, yaklaşık 2 metre polietilen boru doldurur. <ol><li> 15 ml konik bir tüp içine boru istenilen uzunlukta için gerekli kollajen gerekli miktarda koyun ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 128 uL 10x α-MEM başına mL tüp ve art arda çözüm pipetleme karıştırın kollajen. Not: (1) çözüm asitlendirilmiş kollajen α-MEM sarı karışık açmalısınız ve (2) karıştırma kabarcıkları en aza indirmeye çalışın. </li><li> Kollajen 7.4 pH kadar 0.8 M sodyum bikarbonat ekleyerek kollajen nötralize. PH eklemek sodyum bikarbonat genel bir tahmin için sarı kollajen çözümü açık pembe renk olana kadar. Not: Bu genellikle kollajen her ml başına 30 ila 60 mcL alır. </li><li> Nötralize kolajen olarak kullanmak için hazır olana kadar jel 4 tutulması değilse etkisiz hale kollajen buz üzerinde tutun ° C </li></ol> 3) Hücre Gömme (isteğe bağlı) Not: hücreler, hücre tipine bağlı olarak bir konsantrasyon ml başına 20 milyon hücre ml başına 1 milyon hücre arasında gömülü olabilir. Gömmek istediğiniz hücreleri için gerekli ortamı kullanın. <ol><li> Hücrelerden ortamı çıkarın ve 5 ml PBS ile yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve 3 ml tripsin-EDTA ekleyin. </li><li> 37 °, 5 dakika boyunca tripsin-EDTA hücrelerin inkübe ° C </li><li> 7 ml medya hücrelerin tekrar </li><li> Hücreleri saymak. </li><li> 15 ml konik tüp gömmek için gerekli sayıda hücre aktarın. </li><li> Pelet 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri. </li><li> Kapalı hücre pelletini medya aspire. </li><li> Nötralize kolajen hücrelerinin yeniden süspanse edin ve buz üzerinde tutmak. </li></ol> 4) Jelleşme Kollajen <ol><li> Biyolojik güvenlik kabini polietilen boru içeren torba mühürlü ucunu kesti. </li><li> Bir ucunu sterilize cımbız kullanarak boru için 3 ml şırınga 20G iğne takın. Tüp torba içinde saklayın. </li><li> Hortumun diğer ucunu steril cımbız kullanarak konik tüp alt ucu kadar nötralize kollajen içine yerleştirin. Konik tüp buz üzerinde tutun. </li><li> Polietilen boru içine yavaş yavaş şırınga pistonu geri çekilmeden kollajen çekin. Not: kollajen hızlı kollajen sonra kabarcıklar oluşturacak boru içine çekilir. </li><li> Tüp yoluyla kollajen çekilmesinden sonra, boru 20G iğne çekin ve her iki ucunda çantaya geri koymak. Teyp çanta kapattı. </li><li> 60 dakika için 37 ° C çanta inkübe edin. Kollajen hücreler içeriyorsa, her 15 dakika içinde çanta çevirin. böylece hücrelerin modülün bir tarafında razı olmayın. </li></ol> 5) Boru kesimi jel Kollajen İçeren <ol><li> Otoklav başlıkları ve bıçak kesme cihazı ve tüp tutmak için tepsi. </li><li> Kesme cihazı birleştirin. </li><li> Kesme aleti önünde steril bir tepsiye yerleştirin boru ve boru kesme cihazı yerleştirin. </li><li> 50 ml konik boru kesme cihazı çıkışında kesme modülleri toplamak için 25 ml medya içeren bir ayarlayın. Not: modülleri medya FBS olmadan boru ayrı olarak sadece kolajen modüller için bile FBS içeren medya kullanın. Eğer modülleri içeren hücrelerin gömülü hücreler için gerekli olan medya kullanımı. Modüller hiçbir gömülü hücreler endotel hücreleri için ortam varsa kullanın. </li><li> 2 mm uzunlukta boru kesme ve boru kesmek için kesme cihazı ayarlayın. </li><li> 37 ° kesme modülleri inkübe ° C 50 ml konik tüp içinde 60 dk. </li></ol> 6) Boru Kollajen Modüllerini Çıkarma <ol><li> 10 sn için tüp modülleri içeren Vortex 50 ml konik boru. Not: kırılmaları önlemek için yüksek hücre yoğunluğu ile gömülü modüller ayıran zaman nazik olun. </li><li> Modülleri tüpün dibine dinlendiriniz. Yaklaşık 5 dakika sürer. </li><li> Geniş bir ağız 10 ml serolojik pipet kullanarak yerleşik modülleri 15 ml konik tüp transferi. </li><li> 6,1-6,3 adımları iki kez tekrarlayın. </li><li> Olmayan bir doku kültürü tedavi plaka endotel hücreleri ya da transfer modülleri ile kat modülleri için 7. adıma gidin. </li></ol> 7) Kaplama endotel hücreleri ile modülleri <ol><li> Th için medya 5 ml, 15 ml konik tüp dibine modülleri Settlee gömülü hücreler. </li><li> Endotel hücreleri medya çıkarın ve 5 ml PBS ile yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve 3 ml tripsin-EDTA ekleyin. </li><li> 37 °, 5 dakika boyunca tripsin-EDTA hücrelerin inkübe ° C </li><li> 7 ml medya hücrelerin tekrar </li><li> Hücreleri saymak. Konik tüpün dibinde paketlenmiş modülleri mL başına 5x10 6 endotel hücreleri ihtiyacınız var. </li><li> Pelet 300 xg'de 5 dakika ve 5 ml endotel hücre medya tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Modülleri endotel hücreleri içeren medyanın 5 ml ekleyin. Not: Bu, biz, her iki hücre tipinin sağkalım ve işlevi için çalışmak bulduk iki medya türleri 50:50 oranı verir. Kullanmadan önce, iki hücre tiplerinin fenotipleri uygun bakım sağlamak için formüle edilmiş bir ko-kültür ortamında test edin. </li><li> Endotel hücreleri ile hem statik ve dinamik modülleri inkübe edin. </li><li> Tersine çevirerek statik inkübasyon karışımı endotel hücreleri ile modülleri ve 37 ° dik tüp seti ° C de 15 dakika. Tekrarlayın. </li><li> 37 ° tüp hafifçe sallanan tarafından dinamik tohum endotel hücreleri ° C de 60 dakika. </li><li> Statik inkübasyon iki kez tekrarlayın. </li><li> Olmayan doku kültürü tedavi plaka modülleri yerleştirin ve 37 ° gece inkübe ° C </li><li> Taze medya ile yeni bir non-doku kültürü tedavi plaka ertesi gün yerine modülleri (50:50 karışımı kullanmadan ko-kültür sistemi) unattached endotel hücreleri çıkarmak için. </li><li> Modülleri yüzeyinin% 100 kapağı kadar endotel hücreleri ile kaplı modüllerin inkübe edin. Bu genellikle 7 gün sürer. </li></ol> 8) Temsilcisi Sonuçlar: Ilk tüp çıkarılır modülleri silindirik bakacağız. Modülleri gömülü hücreleri içeren ve / veya endotel hücreleri ile kaplı hacim olarak% 50 kadar sözleşme ve oval bir şekil (Şekil 1) geliştirmek. Modülleri de ışık mikroskobu (Şekil 1) bakıldığında daha yoğun ve daha opak hale gelecektir. Ayrıca endotel hücreleri, modülleri yüzeyinde konfluent zaman VE-Cadherin immünofloresan boyama (Şekil 2) tarafından görülebilir sıkı bağlantıları bir oluşum var. Kütle transferi analizi modülleri, yetersiz oksijen taşıma, (örneğin büyük çaplı modülleri, D = 1.4, büyük dokular genellikle sorunlu nedeniyle nekrotik çekirdek gelişmekte olmadan yüksek hücre yoğunluğu (8x10 7 hücre / cm 3) destekleme yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir mm) (Şekil 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Modül imalat ve daralma. Modül daralma tohumlama daha küçük modül çapı ve uzunluğu (p &lt;0,001) (A) sonuçları HUVEC-C (endotelyal hücre hattı) takip eden üç gün boyunca oluştu. Gömülü HepG2 hücreleri düzgün uydurmalarla zamanda modülleri içinde dağıtılmış ve (B) yüksek canlılığını korudu. [Hücreleri yeşil Live ölü hücreleri kırmızı], [2010 Corstorphine adapte] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: bir modül yüzeyi kaplı AT RAEC 10 gün sonra sıkı hücre kavşak VE Cadherin immunofluorescent boyama. Ölçek çubuğu = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: Masson tipik modülleri trikrom boyama (0.76 mm başlangıç ​​çapı) ve büyük modüller (1.4 mm başlangıç ​​çapı), oksijen difüzyon sınırlamaları etkisi göstermektedir . Imalat aşağıdaki yedi gün, ölü hücrelerden çok sayıda canlı hücreler sadece ince bir jant (~ 200μm kalın) bırakarak, büyük modülleri (sağ alt panel) çekirdek içinde kurmuştu. Tersine, küçük modülleri canlı hücreler bir üniforma ve yüksek dağıtım korudu. [Modülleri, HepG2 hücreleri ile gömülü ve endotel hücreleri ile kaplı.] [Corstorphine 2010 tarihinden itibaren Çekildiği] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: (A) poloxamine HMEC-1 numaralı seribaşı kollajen modülleri. Poloxamine-kollajen modülleri, silindir şeklinde korumak ve sınırlı hücre eki özellikleri kollajen sadece modülleri göre ekim 1 Gün sonra. Ölçeği bar = 200 mm. PLGA tabanlı biyobozunur mikroküreler içeren bir kollajen modülü (B) Işık mikroskop görüntüsü. Ölçeği bar = 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5: in vitro tayinlerde örnekleri. (A) Anjiyogenez tahlil: kapiller benzeri oluşumlar endotel hücreleri ile seribaşı modül yağ elde edilen kök hücreleri ile kolayca tespit edilir ve inkübasyon 5 gün sonra sayısal olabilir. (B) s modülleri canlı / ölü testinin mikroskopisi görüntülericanlı hücreler için yerleştirme yazılımı yeşil ve ölü hücreleri için kırmızı. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6: Kollajen gömülü mezenkimal kök hücreleri ve endotel hücreleri bir yüzey tabakası içeren modüller. Modüller mikroakışkan odasında 7 gün kayma gerilmesi (~ 0.64 dyn / cm 2) maruz kalan ve temas noktalarında füzyon göstermeye başlar. Endotel hücreleri vWF (kahverengi) ile boyandı ve mezenkimal kök hücre çekirdekleri mavi (H &amp; E) görünür. Ölçek çubuğu = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7: Yağ elde edilen kök hücreler (ASC) ve İnsan mikrovasküler endotel hücreleri ile kaplı içeren kollajen modülleri yüzlerce (HMEC) ASC / HMEC yağ rejenerasyon uygulamalar için in vivo etkileşim çalışmasında fare cilt altına yerleştirilir.

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
<li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li>
<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+tissue+engineering%3A+fabrication+of+a+gelatin-based+construct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

Biz farklı hücre tipleri 1-11 gömülü modüllerini kullanarak birçok farklı mikro-dokulara fabrikasyon var. Biz başarıyla birincil kardiyomiyositlerde, adacıklar, yağ kök hücreler ve mezenkimal stromal hücrelerinin yanı sıra HepG2, NIH 3T3 ve klon 9 karaciğer hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre hatları gömülü. Biz, sıçan aort endotel hücreleri, insan umbilikal ven endotel hücreleri ve insan mikrovasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere endotel hücreleri çeşitli modülleri kaplı. Modüller aynı ...

<table><tbody><tr><td>Intramedic PE60 hortum</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>Modüllerin çapını değiştirmek için farklı hortum çapları kullanılabilir</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Purcol asitlendirilmiş kolajen, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>20G iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>İğne çapının hortum çapına benzer olması gerekir</td></tr><tr><td>3 mL şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Convertors Kendi Kendine Kapanan Poşet 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Geniş Uçlu serolojik pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serolojik pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serolojik pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

kollajen, modüller kullanarak micro-dokuların fabrikasyon İçeren hücreleri jel

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Bu protokol, modüller olarak adlandırılan mikro-dokuların bir tür fabrikasyon açıklamaktadır. Modülü yaklaşım, üniforma, ölçeklenebilir ve vaskülarize doku üretir. Modülleri kollajen yanı sıra diğer gelable veya çapraz bağlanabilir malzemeler yapılabilir. Onlar imalat üzerine çapı yaklaşık 2 mm uzunluğunda ve 0.7 mm ama gömülü hücreleri veya modülleri endotel hücreleri ile kaplıdır boyutu küçültmek. Modüllerin ayrı ayrı gömülü hücreler oksijen ve diğer besinleri difüzyon sınırı içinde ama modülleri perfusable olan büyük dokular oluşturmak için birlikte paketlenmiş olabilir bu kadar küçük. Bu dokular, farklı hücre türleri, karmaşık dokuları oluşturmak için birlikte paketlenmiştir önce gömülü veya modülleri kaplı olabilir çünkü inşaat modüler. Modülleri yapmak için üç temel adım vardır: (1) kollajen nötralize ve bu hücreleri gömerek, tüp içinde (2) jelleşme kolajen ve endotel hücreleri ile modülleri ve (3) kaplama modülleri kesme.

Gömülü hücreler ve yüzey içeren modüller olarak adlandırılan silindirik kollajen jeller, mikro-dokuların oluşturulması endotel hücreleri ile kaplanmıştır.

Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

Bu protokol, modüller olarak adlandırılan bir mikro doku türünün üretimini açıklamaktadır. Modül yaklaşımı; tekdüze, ölçeklenebilir ve vaskülarize ...

Bu prosedürün genel amacı, doku mühendisliği deneylerinde kullanılabilecek modüler mikro dokular üretmektir. Bu işlem, önce bir şırınga yardımıyla kolajen çözeltisinin bir polietilen tüp içine çekilmesi ve ardından kolajenin jelleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, mikro doku modüllerini oluşturmak için polietilen tüp iki milimetrelik uzunluklarda kesilir.Prosedürün üçüncü adımı modüllerin tüplerden ayrılmasıdır ve son olarak modüller endotel hücreleri ile kaplanır. Nihayetinde, elde edilen mikro dokular, bir mikroakışkan bölme aracılığıyla hücrelerin etkileşimini incelemek için in vitro hücresel analizlerde kullanılabilir. Ek olarak, mikro dokuların in vivo ortamdaki etkileşimini ve yeniden yapılanmasını incelemek amacıyla doku üretmek için bu mikro dokular implante edilebilir.Merhaba, ben Toronto Üniversitesi'ndeki Sepan Laboratuvarı'ndan Brendan Long. Büyük boyutlu 3D doku ikamelerinin oluşturulmasındaki temel engellerden biri, implantasyon sonrası hızlı vaskülarizasyonun eksikliğidir. Bu videoda, bu sınırlamanın aşılmasına yardımcı olmak için endotel hücreleri ile kaplanmış modüler dokuların nasıl oluşturulacağını göstereceğiz.Prosedürü, Septin laboratuvarından ameliyat sonrası dönem uzmanı Chamberlain gerçekleştirecektir. Nötralize edilecek kolajen miktarı, polietilen tüpün uzunluğuna bağlı olacaktır. Bu gösterimde, 0.76 milimetre iç çaplı ve 1.22 milimetre dış çaplı, iki metre uzunluğunda bir polietilen tüp kullanacağız.Tüpleri hazırlamak için, bir adet 20 G iğneyi tüpün bir ucundan geçirin ve ardından tüpü gaz sterilizasyonu için bir konvertör kendi kendini onaran poşete yerleştirin. Bir mililitre kolajen yaklaşık iki metre polietilen tüpü doldurduğundan, bir mililitre kolajeni nötralize edeceğiz. Kolajeni 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve tüpü buz üzerinde tutun.Tüpe, mililitre başına 128 µL 10 x alpha-MEM kolajen ekleyin ve çözeltiyi tekrarlayan pipetleme işlemiyle karıştırın. Kabarcık oluşumunu minimize etmeye dikkat edin; alpha-MEM asitlenmiş kolajene karıştıkça çözelti sarı renge dönecektir. Ardından, 0,8 M sodyum bikarbonat ekleyerek kolajeni nötralize edin. pH hakkında genel bir tahmin yürütmek için, sarı kolajen çözeltisi açık pembe renge dönene kadar sodyum bikarbonat ekleyin.7,4 pH değerine ulaşmak için genellikle mililitre başına 30 ila 60 µL kolajen kullanılır. Nötralize edilmiş kolajenin jelleşmesini önlemek için, kullanılmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kolajen jelleştirme işlemine başlamak için, sterilize edilmiş polietilen tüpü içeren torbayı bir biyolojik güvenlik kabinine götürün ve tüp torbanın içinde kalacak şekilde torbanın kapalı ucunu kesin.Sterilize edilmiş cımbız kullanarak, önceden tüpün bir ucuna takılmış olan 20 gauge iğneye üç mililitrelik bir şırınga takın. Tüpün diğer ucunu, buz üzerinde tutulan konik tüpün dibine ulaşana kadar nötralize edilmiş kolajenin içine yerleştirin. Bir sonraki adımı yavaşça gerçekleştirmeniz gerekir; aksi takdirde kolajenin içine hava kabarcıkları girecektir.Kolajeni polietilen tüpün içine çekmek için şırınga pistonunu yavaşça geri çekin. Kolajen tüp boyunca çekildiğinde, 20 gauge iğneyi çıkarın ve tüpün her iki ucunu tekrar torbanın içine yerleştirin. Torbayı bantla kapattıktan sonra, 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.Tüpleri kesmek için önceden monte edilmiş bir kesme cihazı kullanılacaktır. Bu prosedüre başlamak için, tüpleri kesme cihazının önündeki steril bir tepsiye yerleştirin ve tüpleri kesme cihazının çıkış kısmından cihaza yükleyin; 25 mililitre endotel hücre medyumu içeren 50 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın. Kesilen modülleri toplamak için kesme cihazını iki milimetre uzunluğunda tüp kesecek şekilde ayarlayın ve ardından tüpleri kesin.Kesilmiş modülleri 50 mL'lik konik tüp içerisinde 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Kollajen modülleri tüpten ayırmak için, modülleri içeren 50 mL'lik konik tüpü orta hızda 10 saniye boyunca vorteksleyin; modüllerin tüpün dibine çökmesi yaklaşık beş dakika sürer.Tüpün dibinde gevşek bir modül peleti oluşurken, tüpler medyanın üzerinde bir tabaka oluşturacaktır. Modüller çöktükten sonra, onları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş ağızlı, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. 15 mililitrelik konik tüpü vorteksleyin ve ardından modüllerin iki kez daha çökmesine izin verin.İkinci ve üçüncü girdaptan çöken modüller de 15 mililitrelik tüpe aktarılır. Tüm modüller tüplerden çıkarılıp bir araya getirildikten sonra, tüpteki besiyeri hacmi beş mililitreye tamamlanır. Modüller artık endotel hücreleri ile kaplanmaya hazırdır; bir sonraki bölümde modülleri kaplamak için endotel hücrelerinin nasıl hazırlanacağı gösterilecektir.İlk olarak, hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve PBS ile yıkayın. PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra, üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri yedi mililitre besiyeri içinde süspanse edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın; konik tüpün dibindeki paketlenmiş modüller için mililitre başına 5 × 10⁶ endotelyal hücreye ihtiyacınız olacaktır. Hücreleri 300 G'de beş dakika boyunca pelletleyin. Hücre pelletini beş mililitre endotelyal hücre besiyerinde yeniden süspande edin.Şimdi modüllere endotel hücreleri içeren beş mililitre besiyeri ekleyin. Modüller, endotel hücreleri ile hem statik hem de dinamik olarak inkübe edilir; statik inkübasyon için endotel hücreli modüller ters çevrilerek karıştırılır ve ardından tüp 37 °C'de 15 dakika boyunca dik konumda bekletilir. 15 dakika sonra tüpü tekrar ters çevirin ve 37 °C'de 15 dakika daha inkübe edin.Modülleri endotel hücreleri ile dinamik olarak inkübe etmek için, 15 mililitrelik tüpü 37 °C'de 60 dakika boyunca hafifçe sallayın. Endotel hücreleri ile inkübasyon tamamlandığında, modülleri doku kültürü işleminden geçmemiş bir plakaya aktarın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin; ertesi gün, yapışmamış endotel hücrelerini uzaklaştırmak için modülleri taze medyum içeren yeni bir doku kültürü işleminden geçmemiş plakaya yerleştirin. Endotel hücreleri ile kaplanmış modülleri, hücreler modül yüzeyinin %100'ünü kaplayana kadar 37 °C'de inkübe edin.Bu işlem genellikle yaklaşık yedi gün sürer. Modüller tüpten ilk çıkarıldıklarında silindirik görünecektir. Endotel hücreleri ile kaplandıkları takdirde, hacimce %50'ye kadar büzülebilir, oval bir şekil alabilir ve ışık mikroskobu altında bakıldığında daha yoğun ve daha opak hale gelebilirler.Bu görüntülerde modüllerin çapı ve uzunluğu sırasıyla d ve l ile belirtilmiştir. Bir sonraki görüntü, üretim anında modüller içerisinde homojen olarak dağılmış gömülü Hep G two hücrelerini göstermektedir. Canlı hücrelerin yeşil renginden anlaşıldığı üzere, hücreler yüksek canlılıklarını korumuştur.Endotel hücreler konfluent hale geldiğinde, ölü hücreler kırmızı renkte olacaktır. Modüllerin yüzeyinde, immünofloresan ile görülebilen sıkı bağlantıların (tight junctions) oluşumu gerçekleşir. VE cadherin kütle transfer analizi boyaması, modüllerin, daha büyük dokularda sıklıkla sorun teşkil eden yetersiz oksijen transportuna bağlı nekrotik çekirdek gelişimi olmadan yüksek hücre yoğunluklarını destekleyebildiğini göstermiştir.Bu örnekte, tipik küçük modüllerin massen Tri chro boyaması, modüllerin üretimden yedi gün sonra canlı hücrelerin homojen ve yüksek bir dağılımını koruduğunu göstermektedir. Buna karşılık, büyük modüllerin çekirdek kısmında çok sayıda ölü hücre oluşmuş ve geriye yalnızca ince bir canlı hücre halkası kalmıştır. Modüller ayrıca kolajen ve ince polimer karışımıyla veya ilaç salınımlı mikroküreler içerecek şekilde de üretilmiştir.Burada, h hm EC hücreleri palin kolajen modüller üzerine yerleştirildiğinde, modüller silindirik şekillerini korumakta ve sadece kolajenden oluşan modüllere kıyasla hücre tutunma özellikleri sınırlı kalmaktadır. PLGA tabanlı biyobozunur mikroküreler içeren bir kolajen modülün ışık mikroskobu görüntüsü burada gösterilmektedir. Çeşitli in vitro analizlerin modüllerle uyumlu olduğu gösterilmiştir.Örneğin, bir anjiyogenez deneyinde, endotel hücreleri ile yerleştirilmiş bir modül üzerindeki kılcal damar benzeri oluşumlar, adipoz kaynaklı kök hücrelerle beş günlük inkübasyonun ardından kolayca tespit edilebilir ve nicelendirilebilir. Başka bir örnekte, modüller üzerindeki canlı-ölü analizin konfokal mikroskopi görüntüleri, yeşile boyanmış canlı hücreleri ve kırmızıya boyanmış ölü hücreleri göstermektedir. Son olarak modüller, farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimi ve mikro dokuların konak yanıtı tarafından nasıl yeniden şekillendirildiğini incelemek amacıyla mikroakışkan odacıklarda kullanılmış ve fareler ile sıçanlara implante edilmiştir.Prosedürün ardından modüller, bir Petri kabında veya biyoreaktör ya da mikroakışkan cihaz gibi diğer kaplarda kültüre edilebilir. Bu yöntem, farklı hücre tipi kombinasyonları kullanılarak veya farklı çaplarda tüpler kullanılarak farklı dokular oluşturmak için de uyarlanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler.

fabrication-micro-tissues-using-modules-collagen-gel-containing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, kolajen doku, iskelet matür içeren yapıları imalatı göstermektedir. Bu 3-D mühendislik yapıları dokuların değiştirmek veya onarmak için kullanılan...

MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Bir yöntem olup kollajen tip I ve primer insan fibroblast oluşan bir 3-boyutlu matrisi hazırlanması için tarif edilmektedir. Bu doku stroma temel özelliklerini taklit eder ve mikroskopi birçok formları için müsait olduğundan bu organotipik jel invaziv hücre göçü değerlendirmek için yararlı bir substrat olarak hizmet vermektedir.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Bu çalışmada, kollajen, düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin doğrudan kültürlenmesi yoluyla canlı vasküler dokuların hızlı bir şekilde üretilmesi için bir teknik sunuyoruz. Ek olarak, tasarlanmış vasküler dokuların mekanik karakterizasyonu için yeni bir protokol tanımlanmıştır.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Doku mühendisliği genellikle doku rejenerasyonu için Otogreft yaratmak için in vitro genişlemesinde içerir. Bu çalışmada, genişleme, doku, yenilenme ve in vivo olarak yeniden yapılanma için bir yöntem olup vücut dışında hücreleri ve biyolojik malzemelerin işlenmesi en aza indirmek için geliştirilmiştir.

Sıkıştırılmış Kolajen kıyılmış Doku: Tek aşamalı Rekonstrüktif Onarım için Cep içeren Biotransplant

Mikroakışkan cihazlar içinde fonksiyonel mikro dokuların oluşturulması, geleneksel hücre kültürü tekniklerinin mikrocihazlardaki sınırlı mekansal boyutlara uyarlanarak hücre fenotiplerinin stabilizasyonunu gerektirir. Kollajenin modifikasyonu, hepatositler gibi birincil hücreleri mikroakışkan doku modelleri olarak stabilize edebilen ultra ince kollajen düzeneklerinin katman katman birikmesine izin verir.

Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Bu protokol, lifleri bir 3D kollajen hidrojel (kalınlığı &lt;250 μm) hizalamak için uzatma gerinim (germe) oluşturmak için sıvı akış yönü boyunca değişen geometriye sahip bir mikroakışkan kanalın kullanımını göstermektedir. Ortaya çıkan hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır ve uzatma gerinim hızından etkilenir.

Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri

Aşağıdaki protokol, çok çeşitli doku mühendisliği uygulamalarına uygulanabilen nano ölçekli desenli fibrillere sahip kollajen hidrojellerin üretimi için kesme tabanlı bir ekstrüzyon yöntemi sunar.

Doku Mühendisliği İçin Nanofibriler Desenli Kollajen Üretimi

Öğrenin, hücrelerle kaplı modüler mikro dokuların üretimini. Kollajen jelleri kullanarak silindirik modüller oluşturun ve endotel hücreleriyle kaplayarak doku mühendisliği deneyleri için in vitro ve in vivo çalışmalarda kullanın.

Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

Daha fazla video keşfet