Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

Bu prosedürün genel amacı, doku mühendisliği deneylerinde kullanılabilecek modüler mikro dokular üretmektir. Bu işlem, öncelikle kolajen solüsyonunun bir şırınga yardımıyla polietilen tüp içerisine çekilmesi ve ardından kolajenin jelleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, mikro doku modüllerini oluşturmak için polietilen tüp iki milimetrelik uzunluklarda kesilir.

Prosedürün üçüncü adımı, modüllerin tüplerden ayrılmasıdır ve son olarak modüller endotel hücrelerle kaplanır. Nihayetinde, elde edilen mikro dokular, bir mikroakışkan oda aracılığıyla hücre etkileşimlerini incelemek için in vitro hücresel deneylerde kullanılabilir. Ek olarak, mikro dokuların in vivo etkileşimlerini ve yeniden şekillenmelerini incelemek amacıyla doku üretmek için mikro dokular implante edilebilir.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi'ndeki Sepan Laboratuvarı'ndan Brendan Long. Büyük boyutlu 3D doku ikameleri oluşturmadaki temel engellerden biri, implantasyon sonrası hızlı vaskülarizasyonun eksikliğidir. Bu videoda, bu kısıtlamanın aşılmasına yardımcı olmak için endotel hücreleriyle kaplanmış modüler dokuların nasıl oluşturulacağını göstereceğiz.

Prosedürü, Septin laboratuvarından ameliyat sonrası dönem uzmanı Chamberlain gerçekleştirecektir. Nötralize edilecek kolajen miktarı, polietilen tüpün uzunluğuna bağlı olarak değişecektir. Bu gösterimde, iç çapı 0,76 mm ve dış çapı 1,22 mm olan iki metre uzunluğunda bir polietilen tüp kullanacağız.

Tüpleri hazırlamak için, 20 G'lik bir iğneyi tüpün bir ucundan geçirin ve ardından tüpü gaz sterilizasyonu için bir konvertör kendi kendini iyileştiren poşete yerleştirin. Bir mililitre kolajen yaklaşık iki metre polietilen tüpü doldurduğu için, bir mililitre kolajeni nötralize edeceğiz. Kolajeni 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve tüpü buz üzerinde tutun.

Tüpe mililitre başına 10 x alpha-MEM'den 128 µL kolajen ekleyin ve çözeltiyi tekrarlayan pipetleme işlemiyle karıştırın. Kabarcık oluşumunu en aza indirmeye dikkat edin; alpha-MEM asitlendirilmiş kolajenle karıştıkça çözelti sarı renge dönecektir. Ardından, 0,8 M sodyum bikarbonat ekleyerek kolajeni nötralize edin. pH hakkında genel bir tahmin için, sarı kolajen çözeltisi açık pembe renge dönene kadar sodyum bikarbonat eklemeye devam edin.

7.4 pH değerine ulaşmak için genellikle mililitre başına 30 ila 60 µL kolajen kullanılır. Nötralize edilmiş kolajenin jelleşmesini önlemek için, kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kolajeni jelleştirme prosedürüne başlamak için, sterilize edilmiş polietilen tüpleri içeren torbayı biyolojik güvenlik kabinine götürün ve tüpleri torbanın içinde tutarak torbanın kapalı ucunu kesin.

Sterilize edilmiş cımbızlar kullanarak, daha önce tüpün bir ucuna yerleştirilmiş olan 20 gauge iğneye üç mililitrelik bir şırınga takın. Tüpün diğer ucunu, buz üzerinde tutulan konik tüpün tabanına ulaşana kadar nötralize edilmiş kolajenin içine yerleştirin. Sonraki bu adımı yavaşça gerçekleştirmeniz gerekir, aksi takdirde kolajenin içine hava kabarcıkları girecektir.

Kolajeni polietilen tüpe çekmek için şırınganın pistonunu yavaşça geri çekin. Kolajen tüp boyunca çekildikten sonra, 20 gauge iğneyi çıkarın ve tüpün her iki ucunu tekrar torbanın içine yerleştirin. Torbayı bantla kapattıktan sonra, 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.

Tüpleri kesmek için önceden monte edilmiş bir kesme cihazı kullanılacaktır. Bu prosedüre başlamak için, tüpleri kesme cihazının önündeki steril bir tepsiye yerleştirin ve tüpleri kesme cihazının çıkış kısmından cihaza yükleyin, 25 mililitre endotel hücre medyumu içeren 50 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın. Kesilen modülleri toplamak için, kesme cihazını iki milimetrelik tüp uzunluklarını kesecek şekilde ayarlayın ve ardından tüpleri kesin.

Kesilmiş modülleri 50 milliliter konik tüp içerisinde 37 degrees Celsius'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Kolajen modülleri tüpten ayırmak için, modülleri içeren 50 liter konik tüpü orta hızda 10 saniye boyunca vorteksleyin; modüllerin tüpün dibine çökmesi yaklaşık beş dakika sürer.

Tüpün dibinde gevşek bir modül peleti oluşacak, borular ise medyanın üzerinde bir tabaka oluşturacaktır. Modüller çöktükten sonra, onları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş ağızlı, 10 mililitrelik serolojik bir pipet kullanın. 15 mililitrelik konik tüpü vorteksleyin ve ardından modüllerin iki kez daha çökmesini bekleyin.

İkinci ve üçüncü vorteksten çöken modüller de 15 mililitrelik tüpe aktarılır. Tüm modüller tüplerden çıkarılıp bir araya getirildikten sonra, tüpteki medya hacmi beş mililitreye tamamlanır. Modüller artık endotelyal hücrelerle kaplanmaya hazırdır; modülleri kaplamak için endotelyal hücrelerin nasıl hazırlanacağı bir sonraki bölümde gösterilecektir.

İlk olarak, hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve PBS ile yıkayın. PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra, üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri yedi mililitre besiyeri ile süspanse edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın; konik tüpün dibindeki paketlenmiş modüller için mililitre başına 5 × 10⁶ endotel hücreye ihtiyacınız olacaktır. Hücreleri 300 G'de beş dakika boyunca pelletleyin. Hücre pelletini beş mililitre endotel hücre medyumunda yeniden süspande edin.

Şimdi modüllere endotel hücreleri içeren beş mililitre besiyeri ekleyin. Modüller, endotel hücreleri ile hem statik hem de dinamik olarak inkübe edilir; statik inkübasyon için endotel hücreli modüller ters çevrilerek karıştırılır ve ardından tüp 37 °C'de 15 dakika boyunca dik konumda bekletilir. 15 dakika sonra tüpü tekrar ters çevirin ve 37 °C'de 15 dakika daha inkübe edin.

Modülleri endotel hücrelerle dinamik olarak inkübe etmek için, 15 mililitrelik tüpü 37 °C'de 60 dakika boyunca nazikçe sallayın. Endotel hücrelerle inkübasyon tamamlandığında, modülleri doku kültürü ile işlem görmemiş bir plakaya aktarın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin; ertesi gün, yapışmamış endotel hücrelerini uzaklaştırmak için modülleri taze medyalı yeni bir doku kültürü ile işlem görmemiş plakaya yerleştirin. Endotel hücrelerle kaplanmış modülleri, hücreler modül yüzeyinin %100'ünü kaplayana kadar 37 °C'de inkübe edin.

Bu işlem genellikle yaklaşık yedi gün sürer. Modüller tüpten ilk çıkarıldıklarında silindirik görünecektir. Endotel hücreleriyle kaplandıklarında, hacimlerinde %50'ye kadar büzülme meydana gelebilir, oval bir şekil alabilirler ve ışık mikroskobu altında incelendiğinde daha yoğun ve opak hale gelebilirler.

Bu görüntülerde, modüllerin çapı d ve uzunluğu ise l ile belirtilmiştir. Bir sonraki görüntü, üretim aşamasında modüller içinde tekdüze şekilde dağılmış gömülü Hep G two hücrelerini göstermektedir. Canlı hücrelerin yeşil renginden anlaşıldığı üzere, hücreler yüksek canlılıklarını korumuştur.

Endotel hücreler konfluent hale geldiğinde, ölü hücreler kırmızı renkte görünecektir. Modüllerin yüzeyinde, immünofloresan ile gözlemlenebilen sıkı bağlantıların (tight junctions) oluşumu meydana gelir. VE kadherin boyamasıyla yapılan kütle transfer analizi, modüllerin, daha büyük dokularda sıklıkla sorun teşkil eden yetersiz oksijen taşınımına bağlı nekrotik çekirdek gelişimi olmaksızın yüksek hücre yoğunluklarını destekleyebildiğini kanıtlamıştır.

Bu örnekte, tipik küçük modüllerin massen Tri chro boyamaları, modüllerin üretimden yedi gün sonra canlı hücrelerin üniform ve yüksek bir dağılımını koruduğunu göstermektedir. Buna karşılık, büyük modüllerin merkezinde çok sayıda ölü hücre oluşmuş ve yalnızca ince bir canlı hücre halkası kalmıştır. Modüller ayrıca, kolajen ve ince bir polimer karışımıyla veya ilaç salımlı mikroküreler içerecek şekilde de üretilmiştir.

Burada, h hm EC hücreleri düz kolajen modüllere yerleştirildiğinde, modüller silindirik şekillerini korurlar ve sadece kolajen içeren modüllere kıyasla hücre tutunma özellikleri sınırlıdır. PLGA tabanlı biyobozunur mikroküreler içeren bir kolajen modülünün ışık mikroskobu görüntüsü burada gösterilmiştir. Çeşitli in vitro analizlerin modüllerle uyumlu olduğu gösterilmiştir.

Örneğin, bir anjiyogenez analizinde, endotel hücreleri ile yerleştirilmiş bir modül üzerindeki kapiler benzeri oluşumlar, adipoz kaynaklı kök hücrelerle beş günlük inkübasyonun ardından kolayca tespit edilebilir ve miktar tayini yapılabilir. Başka bir örnekte, modüller üzerindeki canlı-ölü analizine ait konfokal mikroskopi görüntüleri, yeşile boyanmış canlı hücreleri ve kırmızıya boyanmış ölü hücreleri göstermektedir. Son olarak modüller, farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimi ve mikro dokuların konak yanıtı tarafından nasıl yeniden şekillendirildiğini incelemek amacıyla mikroakışkan odacıklarda kullanılmış ve fareler ile sıçanlara implante edilmiştir.

Prosedürün ardından modüller, bir Petri kabında veya biyoreaktör ya da mikroakışkan cihaz gibi diğer kaplarda kültüre edilebilir. Bu yöntem, farklı hücre tipi kombinasyonları kullanılarak veya farklı çaplardaki tüpler kullanılarak farklı dokular oluşturmak için de uyarlanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler.