Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

Bu prosedürün genel amacı, doku mühendisliği deneyleri için kullanılabilecek modüler mikro dokular üretmektir. Bu, önce kollajen çözeltisini bir şırınga kullanarak bir polietilen boruya çekerek ve ardından kollajeni jelleştirerek gerçekleştirilir. İkinci adım, mikro doku modüllerini oluşturmak için polietilen boruyu iki milimetre uzunluğunda kesmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, modülleri borudan ayırmaktır ve son olarak modüller endotel hücreleri ile kaplanır. Sonuç olarak, elde edilen mikro dokular, hücrelerin bir mikroakışkan oda yoluyla etkileşimini incelemek için in vitro hücresel testler için kullanılabilir. Ek olarak, mikro dokular, in vivo olarak mikro dokuların etkileşimini ve yeniden şekillenmesini incelemek için dokular oluşturmak üzere implante edilebilir.

Merhaba, benim adım Toronto Üniversitesi'ndeki Sepan Laboratuvarı'ndan Brendan Long. Büyük 3D doku ikamesi oluşturmadaki en büyük engel, implantasyondan sonra hızlı vaskülarizasyon eksikliğidir. Bu videoda, bu sınırlamanın üstesinden gelmeye yardımcı olmak için endotel hücreleri ile kaplanmış modüler dokunun nasıl oluşturulacağını göstereceğiz.

Prosedürü göstermek, Septin laboratuvarından bir ameliyat sonrası araştırmacı olan Chamberlain olarak kabul edilecektir. Nötralize edilecek kollajen miktarı, polietilen borunun uzunluğuna bağlı olacaktır. Bu gösteride, iç çapı 0,76 milimetre ve dış çapı 1,22 milimetre olan iki metrelik bir polietilen boru kullanacağız.

Boruyu hazırlamak için, borunun bir ucuna 20 G'lik bir iğne geçirin ve ardından boruyu gaz sterilizasyonu için dönüştürücü kendi kendini iyileştiren bir torbaya yerleştirin. Bir mililitre kollajen yaklaşık iki metre polietilen boruyu doldurduğundan, bir mililitre kollajeni nötralize edeceğiz. Kolajeni 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve tüpü buz üzerinde tutun.

Tüpe mililitre kollajen başına 128 mikrolitre 10 x alfa, MEM ekleyin ve çözeltiyi tekrar tekrar pipetleyerek karıştırın. Kabarcık oluşumunu en aza indirmeye özen göstererek, alfa MEM asitlenmiş kollajen içine karıştırılırken çözelti sararmalıdır. Daha sonra, 0.8 molar sodyum bikarbonat ekleyerek kollajeni nötralize edin PH'ın genel bir tahmini için, sarı kollajen çözeltisi açık pembe bir renge dönene kadar sodyum bikarbonat ekleyin.

7.4'lük bir pH elde etmek için tipik olarak mililitre kolajen başına 30 ila 60 mikrolitre gerekir. Nötralize edilmiş kolajenin jelleşmesini önlemek için, kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kollajeni jöleleme prosedürüne başlamak için, sterilize edilmiş polietilen boruyu içeren torbayı biyolojik bir güvenlik kabinine alın ve boruyu torbada tutarken torbanın kapalı ucunu kesin.

Daha önce borunun bir ucuna yerleştirilmiş olan 20 gauge iğneye üç mililitrelik bir şırınga takmak için sterilize edilmiş cımbız kullanın. Borunun diğer ucunu, uç buz üzerinde tutulan konik tüpün dibine gelene kadar nötralize edilmiş kollajenin içine yerleştirin. Bu sonraki adımı yavaşça yapmanız gerekir, aksi takdirde kollajenin içine hava kabarcıkları girersiniz.

Kollajeni polietilen boruya çekmek için şırınganın pistonunu yavaşça geri çekin. Kollajen borudan çekildiğinde, 20 gauge iğneyi dışarı çekin ve borunun her iki ucunu da torbaya geri koyun. Torbayı bantladıktan sonra, 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edildi.

Boruyu kesmek için önceden monte edilmiş bir kesme cihazı kullanılacaktır. Bu işleme başlamak için, boruyu kesme cihazının önündeki steril bir tepsiye yerleştirin ve boruyu kesme cihazının çıkışındaki kesme cihazına yükleyin, 25 mililitre endotel hücre ortamı içeren 50 mililitrelik konik bir tüp kurun. Kesilen modülleri toplamak için, kesme cihazını iki milimetre uzunluğunda boruyu kesecek şekilde ayarlayın ve ardından boruyu kesin.

Kesilen modülleri 50 mililitrelik konik tüpte 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Kollajen modüllerini borudan çıkarmak için, modülleri içeren 50 litrelik konik tüpü orta hızda girdaplayın. 10 saniye boyunca modülün tüpün dibine yerleşmesine izin verin, bu yaklaşık beş dakika sürer.

Borunun altında gevşek bir modül peleti oluşacak, boru ise ortamın üzerinde bir tabaka oluşturacaktır. Modüller yerleştikten sonra, bunları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş ağızlı, 10 mililitrelik serolojik bir pipet kullanın. Vorteks, 15 mililitrelik konik tüp ve ardından modüllerin iki kez daha yerleşmesine izin verin.

İkinci ve üçüncü girdaptan yerleşen modüller de 15 mililitrelik tüpe aktarılır. Tüm modüller borudan çıkarıldıktan ve bir araya getirildikten sonra, tüpteki ortam hacmini beş mililitreye getirin. Modüller artık, modülleri kaplamak için endotel hücrelerinin hazırlanmasının yanında gösterilecek olan endotel hücreleri ile kaplamaya hazırdır.

İlk olarak, ortamı hücrelerden çıkarın ve PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri yedi mililitre ortamda askıya alın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın, konik tüpün altındaki paketlenmiş modüllerin mililitresi başına altıncı endotel hücrelerine beş kez 10 kez ihtiyacınız olacaktır. Hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de peletleyin. Hücre peletini beş mililitre endotel hücre ortamında yeniden süspanse edin.

Şimdi modüllere endotel hücreleri içeren beş mililitre ortam ekleyin. Modüller, statik inkübasyon için hem statik hem de dinamik olarak endotel hücreleri ile inkübe edilir, modüller inversiyon yoluyla endotel hücreleri ile karıştırılır ve daha sonra tüpü 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede dik olarak ayarlar. 15 dakika sonra, tüpü tekrar ters çevirin ve 37 santigrat derece 15 dakika daha inkübe edin.

Modülleri endotel hücreleri ile dinamik olarak inkübe etmek için, 15 mililitrelik tüpü 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca hafifçe sallayın. Endotel hücreleri ile inkübasyon tamamlandıktan sonra, modülleri doku kültürü ile muamele edilmemiş bir plakaya aktarın ve ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, modülleri bağlanmamış endotel hücrelerini çıkarmak için taze ortam ile doku kültürü ile muamele edilmemiş yeni bir plakaya yerleştirin. Endotel hücreleri ile kaplanmış modülleri, hücreler modüllerin yüzeyinin% 100'ünü kaplayana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu genellikle yaklaşık yedi gün sürer. Modüller tüpten ilk çıkarıldıklarında silindirik görünecektir. Endotel hücreleri ile kaplanırlarsa, hacim olarak %50'ye kadar büzülebilir ve oval bir şekil geliştirebilirler, ayrıca ışık mikroskobu ile bakıldığında daha yoğun ve daha opak hale gelebilirler.

Bu görüntülerde, modüllerin çapı ve uzunluğu sırasıyla d ve l ile belirtilmiştir. Bu sonraki görüntü, imalat sırasında modüller içinde eşit olarak dağılmış iki hücrenin gömülü Hep G'yi göstermektedir. Hücreler, canlı hücrelerin yeşil rengiyle gösterildiği gibi yüksek canlılığı korudu.

Endotel hücreleri birleştiğinde ölü hücreler kırmızı renkte olur. Modüllerin yüzeyinde, immünofloresan ile görülebilen sıkı bağlantıların oluşumu vardır. VE kaderin kütle transferi analizinin boyanması, modüllerin, genellikle daha büyük dokularda sorunlu olan yetersiz oksijen taşınması nedeniyle nekrotik bir çekirdek geliştirmeden yüksek hücre yoğunluklarını destekleyebildiğini göstermiştir.

Bu örnekte, tipik küçük modüllerin massen Tri chro boyaması, modüllerin fabrikasyondan yedi gün sonra tek tip ve yüksek bir canlı hücre dağılımını koruduğunu göstermektedir. Buna karşılık, büyük modüllerin çekirdeği içinde çok sayıda ölü hücre oluşmuş ve geriye sadece ince bir canlı hücre kenarı kalmıştır. Modüller ayrıca bir kollajen ve bir ine polimer karışımı veya ilaç salınımlı mikro küreler içeren olarak üretilmiştir.

Burada, h hm EC bir hücre palin kollajen modülleri üzerine oturduğunda, modüller silindirik şekillerini korur ve sadece kollajen modüllerine kıyasla sınırlı hücre bağlanma özellikleri vardır. PLGA bazlı biyobozunur mikro küreler içeren bir kollajen modülünün ışık mikroskobu görüntüsü burada gösterilmektedir. Birkaç in vitro testin modüllerle uyumlu olduğu gösterilmiştir.

Örneğin, bir anjiyogenez testinde, endotel hücreleri ile oturtulmuş bir modül üzerindeki kılcal damar benzeri oluşumlar, adipoz türevli kök hücrelerle beş günlük inkübasyondan sonra kolayca tespit edilebilir ve ölçülebilir. Başka bir örnekte, modüller üzerindeki canlı bir ölü tahlilinin konfokal mikroskopi görüntüleri, canlı hücrelerin yeşile boyandığını ve ölü hücrelerin kırmızıya boyandığını gösterir. Son olarak, modüller mikroakışkan odalarda da kullanılmış ve farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimi ve mikro dokuların konakçı tepkisi tarafından nasıl yeniden şekillendirildiğini incelemek için farelere ve sıçanlara implante edilmiştir.

Prosedürü takiben, modüller bir Petri kabında veya bir biyoreaktör veya bir mikroakışkan cihaz gibi diğer kaplarda kültürlenebilir. Bu yöntem aynı zamanda çeşitli hücre tipi kombinasyonları kullanılarak veya farklı çaplarda borular kullanılarak farklı dokular oluşturmak için uyarlanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler.