Çevre Örneklerinde Organik P Yüksek Verim Ölçme ve Sınıflandırma

Bu prosedürün genel amacı, toprak veya gübre numunelerinin ekstraktlarında enzim hidrolize organik fosforu sınıflandırmaktır. Bu, önce numunelerin sodyum hidroksit EDTA çözeltisi ile ekstrakte edilmesi ve ekstraktların pH'ının ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra bu ayarlanmış ekstraktları iki farklı enzim çözeltisi ile inkübe edin.

96 oyuklu bir plaka üzerinde, son adım, molibden mavisi kolorimetri kullanılarak enzim salınan ortofosfatı ölçmektir. Sonuç olarak, çoğu doğal ortofosfat mono ester fosfor ve diaster fosfor formu, enzim hidroliz yöntemiyle ortofosfatın diferansiyel salınımına dayalı olarak toprak veya gübre numunelerinde sınıflandırılabilir. Bu yöntem, herhangi bir standart laboratuvarda ucuz bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Fosfor 31 nükleer manyetik rezonans spektroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, doğal toprak enzimlerinin gelecekte organik bezelye bileşiklerinden ortofosfat salma potansiyelini ölçebilmesidir. Bu nedenle, bu yöntemle elde edilen veriler, toprak verimliliğini veya toprağın zararlı miktarlarda alg mevcut ortofosfat salma potansiyelini tahmin etmeye yardımcı olabilir. 50 mililitrelik konik bir tüpte iki gram ıslak veya kurutulmuş numuneye 30 mililitre 0.25 molar sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 16 saat çalkalama ile inkübe edin. Numuneleri 30 dakika boyunca 3000 kez G santrifüjleyin, ardından 100 mikrolitreyi zaten asetat tamponu içeren 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ayarlanan numunenin toplam hacmi bir mililitredir ve pH'ı 5.0'dır.

10 mililitre taze hazırlanmış 0.1 molar sodyum asetat pH beşinde mililitre başına 0.5 birim asit fosfataz içeren iki stok çözeltisi hazırlayın. Şimdi, Sulandırılmış liyofilize nükleaz NP'yi Penicillium Citron'dan bir tane, 10 mililitrelik asit fosfataz stoklarından birine, mililitrede bir tane olmak üzere 2.5 birim NP'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin, birkaç kez ters çevrilerek hafifçe karıştırın, iki enzim çözeltisini 3000 kez G'de 30 dakika santrifüjleyin. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir mililitre bir milimolar potasyum fosfat stok çözeltisi ekleyerek başlayın ve yedi adet 0.5 mililitre tahıl seyreltmesi gerçekleştirin, böylece son seyreltme aralığı 20 al ila 0.625 nm fosfor olacak şekilde ilk tüpü atın.

Şimdi ORTOFOSFAT standartlarını, A satırında sıfır NM ortofosfat ile başlayan ve H satırında 20 nm ortofosfat ile biten plaka üzerindeki son iki sütuna, sütun 10'un ilk üç kuyusuna aktarın. Sütun 10'un sonraki üç kuyucuğuna 40 mikrolitre PP artı GP enzim çözeltisi ekleyin. 40 mikrolitre PP artı GP artı NP bir enzim çözeltisi ekleyin.

Son olarak, altı kuyucuğun tümüne 40 mikrolitre 100 milimolar asetat tamponu ekleyin. Şimdi, sütun 10'daki ilk altı kuyucuğun her biri, sonraki iki kuyuya 80 mikrolitre çözelti içermelidir. 10 M glikoz, altı fosfat ve 40 mikrolitre PP artı GP enzim çözeltisi içeren 40 mikrolitre sodyum asetat çözeltisi ekleyin.

Test edilen her numune için, tüm numuneler dağıtıldıktan sonra 40 mikrolitre pH ayarlı numune ekstraktını sekiz sıraya kadar bir ila dokuz kuyucuklara dağıtın. PP artı GP enzim çözeltisini bir ila üç PP artı GP artı NP'yi dört ila altı sütuna ve 0.1 molar sodyum asetat tamponunu yedi ila dokuzuncu sütuna dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Tüm numunelerin eşdeğer inkübasyon süresi elde etmesini sağlamak için bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin.

96 kuyulu plakayı bir kapakla örtün ve numuneleri, enzim çözeltilerini, kontrolleri ve kalibrasyon eğrisini deiyonize suda 37 santigrat derecede tam bir saat inkübe edin. Dört stok çözeltisinin her birinden 50 mililitre hazırlayın. A, çok kanallı bir pipet kullanılarak günlük olarak hızlı bir şekilde hazırlanmalıdır.

96'daki tüm kuyucuklara 25 mikrolitre SDS, 100 mikrolitre çözelti, 20 mikrolitre B çözeltisi ve 50 mikrolitre C çözeltisi ekleyin. Kuyu plakası, plakayı örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Son olarak, bir elektronik tablo uygulaması kullanarak herhangi bir T ayarlanabilir mikroplaka okuyucusunda 850 nanometrede absorbansı ölçün.

İlk olarak, x ekseninde sıfır ila 20 nanomol fosfor ve Y ekseninde çift absorbans ölçümlerinin ortalaması ile inorganik fosfor kalibrasyon eğrisini çizin, doğrusal bir regresyon gerçekleştirin ve en uygun çizginin denklemini bulun. Ardından, bir ila üç arasındaki sütunlardaki değerlerin ortalamasını alarak ve ardından kalibrasyon eğrisini veri kümesine uygulayarak arka plan inorganik fosforunu hesaplayın. Hidrolize fosfor mono esterlerinden türetilen fosforu belirlemek için, dört ila altıncı sütunlardan üçlü numune değerlerinin ortalamasını alın ve kontrol enzimi çözeltisini ve arka plan inorganik fosforunu çıkarın.

Daha sonra, hidrolize fosfordan fosfor içeriğini hesaplamak için, DER'ler yedinci sütundan dokuza kadar üçlü numune değerlerinin ortalamasını alır ve kontrol enzimi çözeltisi artı arka plan inorganik fosforu artı hidrolize mono ester fosforunu dört ila altıncı sütunlardan çıkarır. Tipik bir 96 kuyulu plaka, sekiz numune ve bir kalibrasyon eğrisi için sonuçları gösterir. Kontroller 10. sütundadır.

Bir ila üç ve dört ila altı arasındaki renk yoğunluğu artışı, hidrolize mono esterden kaynaklanır Dört ila altı ve yedi ila dokuz sütun arasındaki fosfor bileşikleri, hidrolize dia eter fosfor bileşiklerinden kaynaklanır. Burada, bir Vermont toprak örneğinin 0.25 molar sodyum hidroksit, 0.05 molar EDTA ekstraktlarındaki fosfor sınıflarının dağılımını başarılı bir şekilde analiz etmek için yüksek verimli enzimatik hidroliz yöntemi kullanıldı. Bu videoyu izledikten sonra, enzimatik hidroliz kullanılarak toprak veya gübre ekstraktlarındaki doğal ortofosfat, mono ester ve diaster bezelye bileşiklerinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik, çevre kimyası ve besin yönetimi alanlarındaki araştırmacıların toprak veya gübre sistemlerindeki organik P davranışını keşfetmelerinin önünü açmaya yardımcı olabilir.