Çevre Örneklerinde Organik P Yüksek Verim Ölçme ve Sınıflandırma

Bu prosedürün genel amacı, toprak veya gübre örneği ekstraktlarındaki enzimle hidrolize olmuş organik fosforu sınıflandırmaktır. Bu işlem, önce örneklerin sodyum hidroksit EDTA çözeltisi ile ekstrakte edilmesi ve ekstraktların pH değerlerinin ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, pH'ı ayarlanmış bu ekstraktlar iki farklı enzim çözeltisi ile inkübe edilir.

96 kuyucuklu bir plaka üzerinde son adım, enzim tarafından salınan ortofosfatın molibden mavisi kolorimetrisi kullanılarak ölçülmesidir. Nihayetinde, toprak veya gübre örneklerindeki çoğu doğal ortofosfat mono ester fosfor ve diaster fosfor formları, enzim hidroliz yöntemiyle ortofosfatın farklı oranlarda salınmasına göre sınıflandırılabilir. Bu yöntem, herhangi bir standart laboratuvarda düşük maliyetle gerçekleştirilebilir.

Fosfor 31 nükleer manyetik rezonans spektroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre sahip olduğu temel avantaj, yerli toprak enzimlerinin gelecekte organik bezelye bileşiklerinden ortofosfat salma potansiyelini ölçebilmesidir. Bu nedenle, bu yöntemle elde edilen veriler, toprak verimliliğinin veya toprağın algler tarafından kullanılabilir miktarlarda zararlı ortofosfat salma potansiyelinin öngörülmesine yardımcı olabilir. 50 mililitrelik konik bir tüp içindeki iki gram yaş veya kurutulmuş numuneye 30 mililitre 0,25 molar sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 16 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin. Numuneleri 3000 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından 100 µL'yi içerisinde önceden asetat tamponu bulunan 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ayarlanmış numunenin toplam hacmi 1 mL ve pH değeri 5.0'dır.

10 mL taze hazırlanmış 0.1 molar sodyum asetat pH 5 içerisinde, mililitre başına 0.5 ünite asit fosfataz içeren iki stok çözelti hazırlayın. Şimdi, Penicillium Citron'dan elde edilen rekonstitüe liyofilize nükleaz NP1'i, asit fosfataz stoklarının bulunduğu 10 mL'lik tüplerden birine mililitre başına 2.5 ünite NP1 nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde ekleyin ve birkaç kez ters çevirerek nazikçe karıştırın; iki enzim çözeltisini 3000 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1 mL 1 millimolar potasyum fosfat stok çözeltisi ekleyerek başlayın ve yedi adet 0.5 mL'lik seri dilüsyon gerçekleştirin; nihai dilüsyon aralığının 20 µM ile 0.625 nM fosfor arasında olması için ilk tüpü atın.

Şimdi ORTOFOSFAT standartlarını plakadaki son iki sütuna aktarın; A satırındaki 0 nM ortofosfat ile başlayıp H satırındaki 20 nM ortofosfat ile bitirerek 10. sütunun ilk üç kuyucuğuna yerleştirin. 10. sütunun sonraki üç kuyucuğuna 40 µL PP artı GP enzim çözeltisi ekleyin. Ardından 40 µL PP artı GP artı NP tek enzim çözeltisi ekleyin.

Son olarak, altı kuyucuğun tamamına 40 µL 100 mM asetat tamponu ekleyin. Artık 10. sütundaki ilk altı kuyucuğun her biri 80 µL çözelti içermelidir; sonraki iki kuyucuğa 10 M glukoz ve altı fosfat içeren 40 µL sodyum asetat çözeltisi ile 40 µL PP artı GP enzim çözeltisi ekleyin.

Test edilen her numune için, tüm numunelerin dağıtımı tamamlandıktan sonra, pH'ı ayarlanmış 40 µL numune ekstraktını sekiz satıra kadar olan birinci ile dokuzuncu kuyucuklara dağıtın. Birçok kanallı pipet kullanarak birinci ile üçüncü sütunlara PP artı GP enzim solüsyonunu, dördüncü ile altıncı sütunlara PP artı GP artı NP1'i ve yedinci ile dokuzuncu sütunlara 0,1 molar sodyum asetat tamponunu dağıtın. Tüm numunelerin eşdeğer inkübasyon süresi almasını sağlamak için bu adımı hızlıca gerçekleştirin.

96 kuyucuklu plakayı bir kapakla kapatın ve örnekleri, enzim çözeltilerini, kontrolleri ve kalibrasyon eğrisini deiyonize su içerisinde 37 °C'de tam bir saat boyunca inkübe edin. Dört stok çözeltinin her birinden 50 mL hazırlayın. A çözeltisi, çok kanallı bir pipet kullanılarak günlük olarak hızlıca hazırlanmalıdır.

96 kuyucuklu plakanın tüm kuyucuklarına 25 µL SDS, 100 µL çözelti A, 20 µL çözelti B ve 50 µL çözelti C ekleyin. Plakanın kapağını kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Son olarak, herhangi bir ayarlanabilir mikroplaka okuyucuda bir hesap tablosu uygulaması kullanarak 850 nm'de absorbansı ölçün.

İlk olarak, x ekseninde 0 ile 20 nanomol fosfor ve y ekseninde çift tekrarlı absorbans ölçümlerinin ortalaması olacak şekilde inorganik fosfor kalibrasyon eğrisini çizin, doğrusal regresyon gerçekleştirin ve en iyi uyum doğrusunun denklemini bulun. Ardından, birinci ile üçüncü sütunlardaki değerlerin ortalamasını alarak ve ardından kalibrasyon eğrisini veri setine uygulayarak arka plan inorganik fosforu hesaplayın. Hidrolize fosfor mono esterlerinden türetilen fosforu belirlemek için, dördüncü ile altıncı sütunlardaki üç tekrarlı örnek değerlerinin ortalamasını alın ve kontrol enzim çözeltisi ile arka plan inorganik fosforu toplamını bu değerden çıkarın.

Ardından, hidrolize fosfordan fosfor içeriğini hesaplamak için DER'ler, yedinci ila dokuzuncu sütunlardaki üç tekrarlı örnek değerlerinin ortalamasını alır ve dördüncü ila altıncı sütunlardaki kontrol enzim çözeltisi ile arka plan inorganik fosfor ve hidrolize mono ester fosforu çıkarır. Tipik bir 96 kuyucuklu plaka, sekiz örnek için sonuçları ve bir kalibrasyon eğrisini gösterir. Kontroller 10. sütundadır.

Bir ile üç ve dört ile altı arasındaki sütunlarda renk yoğunluğunun artması, hidrolize olmuş mono ester fosfor bileşiklerinden kaynaklanmaktadır; dört ile altı ve yedi ile dokuz arasındaki sütunlarda ise hidrolize olmuş di ester fosfor bileşiklerinden kaynaklanmaktadır. Burada, bir Vermont toprak örneğinin 0,25 molar sodyum hidroksit ve 0,05 molar EDTA ekstratlarındaki fosfor sınıflarının dağılımını başarıyla analiz etmek için yüksek verimli enzimatik hidroliz yöntemi kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, enzimatik hidroliz kullanarak toprak veya gübre ekstratlarındaki doğal ortofosfat, mono ester ve di ester fosfor bileşiklerinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu teknik, çevre kimyası ve besin yönetimi alanındaki araştırmacıların, toprak veya gübre sistemlerindeki organik P davranışını incelemelerinin önünü açmaya yardımcı olabilir.