Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Bu prosedürün amacı, sırasıyla floresan problar, TMRM ve H 2D CFD kullanarak primer kortikal nöronlardaki mitokondriyal membran potansiyelini ve reaktif oksijen türlerinin seviyelerini belirlemektir. Bu, önce TMRM ve H 2D CFDA'nın stok ve çalışma konsantrasyonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kortikal nöronları TMRM ve H 2D CFDA ile oda sıcaklığında Tayland yolları tamponunda 45 dakika boyunca inkübe etmektir.

Üçüncü adım, sırasıyla 5, 15, 5, 17 nanometre ve 4 88, 5, 15 nanometre uyarma emisyonu kullanarak canlı kortikal nöronlarda TMRM ve DCF'nin floresan yoğunluğunu görüntülemektir. Floresandaki TMR'deki değişiklikler mitokondriyal unco FCCP varlığında izlenirken, DCF floresansındaki değişiklikler hidrojen peroksit varlığında izlenecektir. Bu prosedürün son adımı, verilerin toplanması, normalleştirilmesi ve analizidir.

Sonuç olarak, sonuçlar, sırasıyla FCCP ve hidrojen peroksit işleminden önce ve sonra TMRM ve DCF floresan yoğunluğunun nispi seviyelerini gösteren bir grafik çizilerek elde edilir. Merhaba, ben Joanna Koska. Chicago Loyola Üniversitesi'ndeki laboratuvarıma hoş geldiniz.

Bugün size sıçan kortikal nöronlarında mitokondriyal membran potansiyelini ve reaktif oksijen türlerini nasıl ölçeceğinizi göstereceğiz. Prosedür dhi ile gösterilecektir. Merhaba, ben de Denise Jossi.

Bu prosedür kullanılarak, mitokondriyal membran potansiyeli tek mitokondriyal etikette ve reaktif oksijen türleri tek hücre etiketinde ölçülebilir. Öyleyse başlayalım. Beş miligram TMRM'yi bir mililitre susuz dimetil sülf oksit girdabında bir dakika boyunca çözerek 10 milimolar bir TMRM stoğu hazırlayın.

Daha sonra alikotları eksi 20 santigrat derecede saklayın. Işıktan koruyun ve bir ay içinde kullanın. Daha sonra, 4.87 miligram H 2D CFDA'yı bir mililitre susuz dimetil sülf oksit içinde çözerek 10 milimolar bir H 2D CFDA stoğu hazırlayın.

Benzer şekilde, bir dakika girdap yapın, ardından alikotlar yapın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Işıktan koruyun ve önce sıçan kortikal nöronlarını TMRM ile yüklemek için bir hafta içinde kullanın. Kültürlenmiş nöronları tyro'nun tamponu ile üç kez yıkayın.

Daha sonra 10 milimolar TMRM stoğunu tb'de 1000 kez seyrelterek 20 nano molar TMRM hazırlayın. Daha sonra bir mililitre tb başına iki mikrolitre seyreltilmiş TMRM ekleyin. Nöronları TMRM ile karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

45 dakika sonra, kültür kabını mikroskobun sahnesine monte edin ve sıçan kortikal nöronlarını H 2D CFDA ile yüklemek için görüntülemeye başlayın, kültürlenmiş nöronları tb ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 10 milimolar H 2D CFDA stoğunu tb cinsinden 10 kez seyrelterek iki mikromolar H 2D CFDA hazırlayın. Ve sonra bir mililitre tb başına iki mikrolitre seyreltilmiş H 2D CFDA ekleyin.

Daha sonra nöronları H 2D CFDA ile 45 dakika sonra karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Tüberküloz ile nöronları dört kez yıkamak için fazla floresan indikatörü çıkarmak için görüntü elde etmeden önce TMRM ile inkübe edilen nöronların canlı görüntülemesi ile konfokal lazer tarama mikroskobu uygulaması ile canlı zaman serisi programı kullanılmaktadır. Görüntü elde etmek için gereken süreyi en aza indirmek ve fotoğraf ağartmasını önlemek için düşük çözünürlüklü ve zayıflatılmış lazer gücü uygulayın.

Ardından, yansıyan ışığı kullanarak TMRM ile yüklenen monte edilmiş nöronların odağını ayarlayın. TMRM floresansını beş 14 nanometrede aydınlatma ve beş 70 nanometrede algılama ile inceleyin. Çözünürlük, lazer gücü algılama, kamera kazancı ve görüntü elde etmek için hızlandırılmış aralık gibi tüm parametreler ayarlandıktan sonra kameranın algılama kazancını doygunluk seviyesinin hemen altına ayarlayın.

Deneyler arasında bu ayarları değiştirmeyin. Ardından, alanı değiştirin. Delta PSY M uyaranındaki değişiklikleri test etmek için görüntüleri toplamaya başlayın, örneğin bir mikromolar FCCP veya mililitre başına iki mikrogram oligo misin uygulanabilir, bu da mitokondriyal membran potansiyelini önemli ölçüde depolarize eder veya hiperpolarize eder.

Bu değişiklikler, FCCP durumunda temel floresan yoğunluğuna kıyasla TMRM floresan yoğunluğunda bir azalma veya TMRM floresan yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır. H 2D CFDA ile inkübe edilen nöronların canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için bir LIGA myin günahı durumunda, önce kültür çanağını bir mikroskop sahnesine monte edin, yansıyan ışığı kullanarak hücrelerin odağını ayarlayın. DCF floresansını 4 88 nanometrede uyarma ve beş 15 nanometrede emisyon ile inceleyin.

Ardından, lazer gücünü %5 ila %7'ye ayarlayın, 2 56 x 2 56'lık bir kazanç ve çözünürlük tespit edin. Deneyler arasında bu ayarları değiştirmeyin. Ardından canlı görüntü elde etmek için frekansı ayarlayın.

Zaman serisi programını kullanarak yeni bir alan seçin ve R os düzeylerindeki değişiklikleri algılamak için görüntüleri almaya başlayın. Hücreleri 100 ila 200 mikromolar hidrojen peroksit ile tedavi edin. Bu, başlangıç seviyesine kıyasla DCF floresan yoğunluğundaki bir artışla yansıtılacaktır.

Alanları seçmek için LSM programındaki ilgi bölgesi aracını kullanın. Ardından, görüntü hücrelerindeki mitokondriyal bölgelerden ROI'leri veya tüm hücre gövdesinden ROI'leri seçin. Sırasıyla TMRM veya ROS'un floresan yoğunluklarını ölçmek için.

Hücrelerin yanındaki bölgeleri seçin. Arka plan floresan yoğunluğunu hesaplamak için birkaç ölçüm yapın ve ortalama arka plan yoğunluğunu hesaplamak için, Microsoft Excel kullanarak her bir zaman noktası için her hücredeki ilgilenilen bölgelerin ortalama floresan yoğunluklarından ortalama arka plan floresan yoğunluğunu çıkarın. Arka plan yoğunluğunu çıkardıktan sonra, TMRM veya DCF floresan yoğunluğunu temel floresansa normalleştirin.

Bu formülü kullanarak, zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklikleri gösteren grafiği oluşturmak için Sigma çizim programını kullanın. İşte TMRM ile inkübe edilen sıçan kortikal nöronlarının floresan görüntüsüne bir örnek. F-C-C-P-A mitokondriyal unco ilavesi, mitokondriyal depolarizasyona ve TMRM floresan yoğunluğu kaybına yol açar.

Temel TMRM floresan seviyesi, FCCP eklenmeden önce sabit kalır. Zaman içindeki TMRM floresan değişikliklerinin kantitatif analizi, FCCP eklendikten sonra TMRM floresansında önemli bir azalma olduğunu göstermektedir. İşte DCF ile yüklü sıçan kortikal nöronlarının floresan görüntüsüne bir örnek.

Başlangıç DCF floresan seviyesi, hidrojen peroksit uygulamasından önceki ilk 120 saniye içinde değişmeden kalır. Hidrojen peroksit ilavesi, hücre gövdelerinde DCF floresan yoğunluğunda bir artışa neden olur. DCF floresansının hızlandırılmış ölçümleri, hidrojen peroksit işlemlerinden sonra artan sabit seviyelerini göstermektedir.

Bu prosedürde, fotoğraf ağartma ve fototoksisiteden kaynaklanan artefaktları önlemek için düşük lazer gücü ve hızlı tarama hızı kullanmayı unutmamak önemlidir. Denemenizde iyi şanslar.