Name: Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin, TMRM ve H2D CFDA floresan probları kullanarak canlı sıçan kortikal nöronlarda mitokondrial membran potansiyeli ve reaktif oksijen türlerini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, konfokal mikroskopi ile gerçek zamanlı görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (JCB K22NS050137) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü <ol><li> Kortikal nöronların izole ve önceden açıklanan teknikler ve poli-D-lizin ve laminin 1 ile kaplanmış bir cam alt (Mattek Corporation, Ashland, MA) ile kültür kaplarına kaplama kullanılarak yetiştirilir. </li></ol> 2. Floresan probları TMRM ve H 2 DCF-DA için stok çözümler hazırlanması <ol><li> TMRM, 5.0 mg 1 ml susuz dimethylsülfoksit eriterek TMRM 10 mM stok solüsyonu hazırlayın. Vortex 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir ay içinde kullanın. </li><li> Sonra, susuz DMSO 1 ml H 2 DCF-DA 4.87 mg eriterek H 2 DCF-DA 10 mM stok solüsyon hazırlanır. Benzer şekilde, vorteks 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir hafta içinde kullanabilirsiniz. </li></ol> 3. TMRM ve H 2 DCF-DA ile yükleme sıçan kortikal nöronların TMRM mitokondri son derece negatif yüklü iç birikir potansiyometrik, hücre-geçirgen floresan gösterge. Mitokondriyal TMRM otomatik söndürme önlemek için TMRM düşük konsantrasyonlarda (10-50 nM aralık) kullanmak önemlidir. Sonra TMRM, floresan sinyal iç mitokondrial membran genelinde ΔΨm doğrudan işbirliği ile ilgili olabilir. ΔΨm kaybı floresan yoğunluğu kaybı ile sonuçlanan mitokondri sızması TMRM neden olur. H 2 DCF-DA hücre geçirgen prob, hücre içi esterazlar tarafından DCF-DA dönüştürülür ve floresan DCF oksidasyon sonuçları . Yüksek yükleme konsantrasyonları DCF floresan doygunluk H 2 O 2 yokluğunda bile neden olabilir DCF-DA, 2-10 mcM ve arasında değişmektedir H 2 farklı beyin bölgelerinden elde edilen nöronların nihai konsantrasyonu ampirik olarak test edilmelidir . Herhangi bir endojen veya eksojen oksidan varlığı (örneğin, nitrik oksit, hidrojen peroksit) DFC floresan yoğunluğu artacaktır. Aşağıda, TMRM ve H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yükleme için bir protokol sağlar. <ol><li> TB:: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukoz, 1.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ve 10 TMRM ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, ilk, Tyrode Kullanıcı tampon (Paylaşımlı Metin kültürlü nöronlar 3 kere yıkayın mM HEPES;) NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın. Ardından, TB 1 / 1000 kere 10 mM TMRM stok seyreltilmesiyle TMRM 20 nM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına 1 ml seyreltilmiş TMRM ul ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta TMRM nöronlar inkübe edin. 45 dakika sonra, mikroskop sahnede kültür çanak montaj ve görüntüleme başlayın. </li><li> H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, TB kültür nöronlar 3 kez yıkayın. Sonra, TB 10 mM H 2 DCF-DA stok 1 / 10 kez seyreltilmesi ile H 2 DCF-DA 2 mcM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına seyreltilmiş 1 ml H 2 DCF-DA ul ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 45 dakika karanlıkta H 2 DCF-DA nöronlar kuluçkaya yatmaktadır. 45 dakika sonra, görüntüleri almadan önce aşırı floresan gösterge kaldırmak için TB nöronlar 4 kere yıkar. </li></ol> 4. ΔΨm belirlemek için TMRM ile inkübe nöron görüntüleme Canlı <ol><li> TMRM, konfokal lazer tarama mikroskobu (Metin Yerleşimi: EKK 510, Carl Zeiss A.Ş.) ile inkübe nöronların canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, canlı zaman serisi programı uygulaması ile kullanılır. Görüntüleri elde etmek ve photobleaching önlemek için gerekli zamanı en aza indirmek için; düşük çözünürlüklü ve zayıflatılmış lazer gücü (düşük çözünürlüklü lazer gücü:% 1: 256 x 256 Metin Dağılımı) uygulayın. </li><li> . Sonra, yansıyan ışık kullanılarak TMRM yüklü monte nöronların odağı ayarlayın. TMRM floresan aydınlatma ve 514 nm 570 nm dalga boyunda tespit inceleyin. Doygunluk seviyesinin altında sadece bir kamera tespit kazanç ayarlayın. </li><li> Görüntüleri elde etmek için çözünürlük, lazer gücü, bir kamera tespit kazanç ve zaman atlamalı aralığını içeren tüm parametreleri sonra; deneyler arasındaki bu ayarları değişmez. Ardından, alan değiştirmek. Görüntü toplamaya başlayın. </li><li> FCCP veya 2 mcg / oligomycin ml, 1 mcM gibi uyaranlara ΔΨm değişiklikleri sınamak için, önemli ölçüde sırasıyla, mitokondriyal membran potansiyeli depolarize veya hyperpolarize hangi uygulanan olabilir. Bu değişiklikler TMRM floresan FCCP durumunda bazal floresan veya oligomycin durumunda TMRM floresan yoğunluğunda bir artış ile karşılaştırıldığında bir düşüş yansıyacaktır. </li></ol> 5. ROS belirlemek için H 2 DCF-DA ile inkübe nöronlar Canlı görüntüleme <ol><li> Inkübe nöronlar H 2 DCF-DA, ilk canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, bir mikroskop aşamasında kültür çanak monte edin. Hücrelerinin odağı ayarlayıning yansıyan ışık. 488 nm eksitasyon ve 515 nm dalga boyunda emisyon DCF floresan inceleyin. </li><li> Sonra% 5-7, dedektör kazanç ve 256 x 256 çözünürlükte, lazer gücü ayarlayın. Deneyler arasındaki bu ayarları değiştirebilirsiniz etmeyin. Sonra, zaman serisi programını kullanarak canlı görüntüler elde etmek için frekansını ayarlayın. </li><li> Yeni bir alan seçin ve görüntüleri almak başlayabilirsiniz. ROS düzeylerinde değişiklikler tespit için, 100-200 mcM H 2 O 2 hücre tedavisi. Bu başlangıç ​​seviyesi ile karşılaştırıldığında DCF floresan yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır. </li></ol> 6. Veri analizi <ol><li> LSM program aracı: ilgi bölgesi (ROI Metin Dağılımı) alanlarını seçmek için kullanın. Sonra, TMRM veya ROS floresan yoğunlukları ölçmek. Mitokondriyal bölgelerde veya TMRM veya ROS floresan yoğunlukları sırasıyla ölçmek için görüntülü hücrelerinde tüm hücre gövdesi ROI'ler ROI'ler seçin. </li><li> TMRM veya her zaman noktası için ROS için tüm görüntülü hücreleri için bütün hücre gövdeleri her hücrenin bütün ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları hesaplayın. Eşiğe yoğunluğunu hesaplamak için hücrelerin yanında bölgeleri seçin. Çeşitli ölçümler ve ortalama arka planda yoğunluğunu hesaplamak. </li><li> Microsoft Excel kullanarak her zaman noktası için her hücrede ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları, ortalama bir arka plan floresan çıkarın. Arka plan yoğunluğu çıkarılarak sonra, bu formülü (: mesafe kadar taşınmış = FF o / F o x 100, F = bazal floresan için herhangi bir zaman noktasında = floresan yoğunluğu, Paylaşımlı Metin) kullanarak temel floresan TMRM veya DCF floresan yoğunluğu normale Sonra, zaman içinde floresan yoğunluğunda değişiklik gösteren arsa üretmek için Sigma Arsa programı kullanın. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1A TMRM ile inkübe fare kortikal nöronların bir floresan görüntüyü gösterir. FCCP eklenmesi, mitokondriyal uncoupler, mitokondriyal depolarizasyon ve TMRM floresan yoğunluğu (Şekil 1B) kaybına yol açar. Bazal TMRM floresan seviyesi FCCP ek önce (Şekil 1C ilk 350 sn) sabit kalır. Kantitatif analiz, zaman içinde TMRM floresan değişiklikler TMRM floresan FCCP (Şekil 1C) eklenmesinden sonra önemli bir azalma gösterir. Şekil 1D DCF yüklü fare kortikal nöronların floresan görüntüyü gösterir. H 2 O 2 sonuç eklenmesi (Şekil 1E) hücre gövdeleri DCF floresan yoğunluğu arttı. Bazal DCF floresan seviyesi H 2 O 2 uygulama öncesi (ilk 120 sn) değişmez. Time-lapse DCF floresans ölçümleri istikrarlı düzeyleri gösterisi, H 2 O 2 tedavisi (Şekil 1F) sonra artış. <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 mitokondriyal membran potansiyeli ve canlı sıçan kortikal nöronların ROS düzeylerinin değerlendirilmesi. (A) kortikal nöronların Temsilcisi floresan görüntü TMRM yüklendi. Temel TMRM floresan taradıktan sonra, nöronlar protonophore FCCP (1 mcM) ile tedavi edildi. Sağda, parlak sarı ve siyah temsil maksimum ve minimum yoğunluğu, sırasıyla TMRM floresan Pseudocolor yoğunluğu bar. Mitokondriyal bölgelerden TMRM floresan kaybı FCCP tedavi (panel B) üzerine ΔΨm çöküşünü gösterir. Farklı zaman noktalarında TMRM floresan yoğunluğu değişim kantitatif gösterimidir FCCP tedavi öncesi ve sonrasında H2DCF-DA yüklü sıçan kortikal nöronların Floresan görüntü paneli C. (D). Temel DCF floresan belirlendikten sonra, hücrelerin 200 mcM H 2 O 2 ile tedavi edildi ve DCF floresan değişimi değerlendirildi. DCF floresan bir artış H 2 O 2 tedavisi (E) üzerine ROS düzeylerinde artış yansıtır. DCF floresan değişimi nicel analizi, H 2 O 2 tedavi öncesi ve sonrası paneli F. Ölçek çubuğu = 10 mm gösterilir Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi FCCP Ayrıca 40X objektif kullanarak öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda TMRM hücre görüntüleme yaşayın. Pseudocolor yoğunluğu maksimum (FCCP toplamadan önce parlak sarı) ve (kırmızı renk, FCCP eklenmesinden sonra) FCCP eklenmesinden sonra TMRM floresan yoğunluğu azalmış <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Videoyu izlemek için buraya tıklayın</a> Video. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi 40X objektif kullanılarak, H 2 O 2 ek öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda DCF hücre görüntüleme yaşayın. DCF floresan bazal hücre gövdeleri, açık yeşil renkli ve H2O2 Ayrıca DC artırırF parlak yeşil renkli floresan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">videoyu görmek için buraya tıklayın</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

Biz ΔΨm ve ROS floresan göstergeler sırasıyla TMRM ve H 2 DCF-DA kullanarak fare kortikal nöronlarda nasıl belirleneceğini anlatan bir adım-adım prosedürü sundu. Diğer hücre türleri için, ampirik TMRM veya H 2 DCF-DA için nihai konsantrasyonu ve yüklenme zamanını belirlemek çok önemlidir. Genel olarak, 20-200 nM TMRM konsantrasyonlarının aralığı ve TMRM hücre inkübasyon süresi 20 ila 60 dakika arasında değişir. H 2 final konsantrasyon DCF-DA 2-10 mcM aralıkları ve Bu gösterge içeren bir yükleme çözüm hücreler inkübasyon 30-45 dakika arasında değişir. Herhangi bir uyaran yokluğunda hücreleri ve floresan yoğunluğu değişiklikleri (örneğin TMRM floresan titremeyi) hem fotoğraf toksisitesini önlemek için fotoğraf çekmek, lazer gücü ve yüksek tarama hızı optimize etmek için çok önemlidir. Optimize edilmiş optik ayarları uyaran yokluğunda (eşik) doymuş altında veya üstünde bir floresan sinyal sonuçlanması gerekiyor. 10-15 dakika canlı görüntüleme için herhangi bir uyarıcı olmaması halinde prob floresan yoğunluğu herhangi bir değişiklik olduğunda, belirli bir lazer güç ve tarama hızı Seçilen bir alandan görüntü toplamak için en uygun koşulları elde edilmektedir. Diğer ΔΨm belirlemek için floresans problar rodamin 123 ve tetra metil rodamin etil ester (TMRE) içerir. Ancak, izole mitokondri 2 solunum proseslerini inhibe etmek bulundu. Önemlisi, TMRM düşük konsantrasyonlarda 2 mitokondriyal solunum üzerine etkisi yoktur ve düşük fototoksisite ve diğer problar ile karşılaştırıldığında 3 photobleaching vardır. H 2 DCF-DA hücrelerde muhafaza edilir ROS için iyi bir göstergedir ve bu peroksitler gibi bazı oksidan türlerin, süper oksitler ve nitrik oksit 4 tanır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Cam alt kültür çanak </td><td> Mattek Corporation&#39;ın </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

mitokondrial membran potansiyeli ve reaktif oksijen türleri canlı rat kortikal nöronlar belirlenmesi

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitokondrial membran potansiyeli (ΔΨm) ATP üretmek için solunum zinciri fizyolojik fonksiyonu korumak için kritik öneme sahiptir. ΔΨm önemli bir kaybı ölüme enerji tükenmiş hücreleri vermektedir. Reaktif oksijen türleri (ROS), önemli sinyal molekülleri, ancak patolojik durumların kendi birikimi oksidatif strese yol açar. Hücrelerde ROS iki önemli kaynakları, çevresel toksinler ve oksidatif fosforilasyon sürecinde. Mitokondriyal disfonksiyon ve oksidatif stres birçok hastalığın patofizyolojisinde suçlanmıştır, bu nedenle ΔΨm ve ROS belirleme yeteneği hücre ve mitokondri fonksiyonu fizyolojik durumu hakkında önemli ipuçları sağlayabilir. Birkaç floresan probları (rodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) hücre tiplerinin çeşitli Δψm belirlemek için kullanılır ve çok sayıda floresan göstergeleri (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) ROS belirlemek için kullanılabilir . Neredeyse tüm ΔΨm veya ROS değerlendirmek için kullanılan floresan probları ΔΨm veya ROS düzeylerini artırır veya azaltır bir uyarıcı ile orantılı olarak floresan yoğunluğu artırmak veya azaltmak tek dalga boyu göstergeleri. Bu nedenle, temel düzeyde ve belirli bir uyaran uygulamasından sonra bu problar floresan yoğunluğu ölçmek için zorunludur. Bu bir değişim, temel seviye ve bir uyarıcı arasında floresan yoğunluğu oranını belirlemek için izin verir. Bu değişiklik, floresan ΔΨm veya ROS göreli seviyeleri değişimi yansıtır. Bu video, biz, başlangıç ​​düzeyi arasında ve FCCP, mitokondriyal uncoupler uyguladıktan sonra TMRM floresan yoğunluğu yüzde değişimi belirlemek için fare kortikal nöronların floresan gösterge, TMRM, nasıl uygulanacağını göstermektedir. TMRM floresan FCCP tedavi kaynaklanan düşük seviyelerde mitokondriyal membran potansiyelinin depolarizasyon yansıtmaktadır. Ayrıca floresan prob H 2 DCF-DA sonra H 2 O 2 uygulaması başlangıçta ilk kortikal nöronlarda ROS düzeyi, değerlendirmek ve nasıl uygulanacağını gösteriyor. Bu protokol aynı zamanda (küçük değişiklikler ile) farklı hücre tipleri ve diğer beyin bölgeleri izole nöronların ΔΨm ve ROS değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir.

Biz belirli bir uyaran uygulamasından önce ve sonra, TMRM floresan yoğunluğu göreceli değişiklikleri belirlemek için kortikal nöronlarda, floresan gösterge, TMRM uygulama göstermektedir. Ayrıca floresan prob H uygulanmasını göstermek<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA kortikal nöronların reaktif oksijen türlerinin göreli seviyesini değerlendirmek için.

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Mitokondriyal membran potansiyeli (&Delta;&Psi;m), ATP üretmek için solunum zincirinin fizyolojik fonksiyonunun sürdürülmesinde kritik öneme sahiptir. Bir ...

Bu prosedürün amacı, floresan probları TMRM ve H 2D CFD kullanarak primer kortikal nöronlarda sırasıyla mitokondriyal membran potansiyelini ve reaktif oksijen türleri seviyelerini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle TMRM ve H 2D CFDA'nın stok ve çalışma konsantrasyonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kortikal nöronların TMRM ve H 2D CFDA ile oda sıcaklığında, Thai roads tamponu içerisinde 45 dakika boyunca inkübe edilmesidir.Üçüncü adım, canlı kortikal nöronlardaki TMRM ve DCF floresans yoğunluğunun sırasıyla 515/517 nanometre ve 488/515 nanometre eksitasyon emisyonu kullanılarak görüntülenmesidir. TMRM floresansındaki değişiklikler mitokondriyal üzerindenleştirici FCCP varlığında, DCF floresansındaki değişiklikler ise hidrojen peroksit varlığında izlenecektir. Bu prosedürün son adımı verilerin toplanması, normalizasyonu ve analizidir.Nihayetinde, sırasıyla FCCP ve hidrojen peroksit uygulaması öncesi ve sonrası TMRM ve DCF floresans yoğunluğunun bağıl seviyelerini gösteren bir grafik çizilerek sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Joanna Koska. Loyola University Chicago'daki laboratuvarıma hoş geldiniz.Bugün size sırtan kortikal nöronlarda mitokondriyal membran potansiyelinin ve reaktif oksijen türlerinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. İşlem, dhi tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Merhaba, ben Denise Jossi.Bu prosedür kullanılarak, tekil mitokondriyal işaretlemede mitokondriyal membran potansiyeli ve tek hücreli işaretlemede reaktif oksijen türleri ölçülebilir. Öyleyse başlayalım. Beş miligram TMRM'yi bir mililitre susuz dimetil sülf oksitte çözerek 10 milimolar bir TMRM stok çözeltisi hazırlayın ve bir dakika boyunca vorteksleyin.Ardından alikotlar hazırlayın ve alikotları -20 °C'de saklayın. Işıktan koruyun ve bir ay içinde kullanın. Sonra, 4,87 mg H 2D CFDA'yı 1 mL susuz dimetil sülf oksitte çözerek 10 mM'lık bir H 2D CFDA stok çözeltisi hazırlayın.Benzer şekilde, bir dakika boyunca vorteksleyin, ardından alikotlar oluşturun ve -20 °C'de saklayın. Işıktan koruyun ve sıçan kortikal nöronlarını öncelikle TMRM ile yüklemek için bir hafta içinde kullanın. Kültürlenmiş nöronları tyro tamponu ile üç kez yıkayın.Ardından, 10 millimolar TMRM stokunu tb içinde 1000 kat seyrelterek 20 nano molar TMRM hazırlayın. Daha sonra, her bir milliliter tb için iki microliter seyreltilmiş TMRM ekleyin. Nöronları TMRM ile oda sıcaklığında, karanlıkta 45 dakika boyunca inkübe edin.45 dakika sonra, kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve rat kortikal nöronlarını H 2D CFDA ile yüklemek için görüntülemeye başlayın, kültürülen nöronları tb ile üç kez yıkayın. Ardından, 10 milimolar H 2D CFDA stokunu tb içerisinde 10 kat seyrelterek iki mikromolar H 2D CFDA hazırlayın. Daha sonra, her bir mililitre tb başına iki mikrolitre seyreltilmiş H 2D CFDA ekleyin.Ardından, nöronları 45 dakika sonra oda sıcaklığında, karanlıkta 45 dakika boyunca H 2D CFDA ile inkübe edin. Fazla floresan indikatörü uzaklaştırmak için nöronları TB ile dört kez yıkayın; ardından, canlı zaman serisi programı uygulaması kullanılarak TMRM ile inkübe edilen nöronların canlı görüntülemesini gerçekleştirmek üzere konfokal lazer tarama mikroskopisi ile görüntüler elde edin. Görüntü elde etmek için gereken süreyi en aza indirmek ve fotobleşingi önlemek için düşük çözünürlük ve azaltılmış lazer gücü uygulayın.Ardından, yansıtılmış ışık kullanarak TMRM ile yüklenmiş monte nöronların odağını ayarlayın. TMRM floresanını, 540 nanometre dalga boyunda aydınlatma ve 570 nanometrede dedeksiyon ile inceleyin. Çözünürlük, lazer gücü deteksiyonu, kamera kazancı ve görüntü elde etmek için kullanılan zaman ayarlı çekim aralığı dahil tüm parametreler ayarlandıktan sonra, kameranın deteksiyon kazancını doygunluk seviyesinin hemen altına getirin.Deneyler arasında bu ayarları değiştirmeyin. Ardından, alanı değiştirin. Delta PSY M stimulusundaki değişiklikleri test etmek için görüntü toplamaya başlayın; örneğin, mitokondriyal membran potansiyelini sırasıyla önemli ölçüde depolarize veya hiperpolarize edecek olan 1 µM FCCP veya 2 µg/mL oligomycin uygulanabilir.Bu değişiklikler, FCCP durumunda bazal floresans yoğunluğuna kıyasla TMRM floresans yoğunluğunda bir azalma veya TMRM floresans yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır. H 2D CFDA ile inkübe edilmiş nöronların canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için öncelikle kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve yansıyan ışığı kullanarak hücrelerin odağını ayarlayın. DCF floresansını 4 88 nanometre eksitasyon ve beş 15 nanometre emisyon ile inceleyin.Ardından, lazer gücünü %5 ile 7 arasına ayarlayın, kazancı tespit edin ve çözünürlüğü 256 x 256 olarak belirleyin. Deneyler arasında bu ayarları değiştirmeyin. Son olarak, canlı görüntüler elde etmek için frekansı ayarlayın.Zaman serisi programını kullanarak yeni bir alan seçin ve ROS seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için görüntüleme işlemine başlayın. Hücreleri 100 ila 200 micromolar hidrojen peroksit ilele işleme tabi tutun. Bu durum, bazal seviyeye kıyasla DCF floresans yoğunluğunda bir artışla kendini gösterecektir.Alanları seçmek için LSM programındaki ilgi alanı (ROI) aracını kullanın. Ardından, sırasıyla TMRM veya ROS floresan yoğunluklarını ölçmek için görüntü hücrelerindeki mitokondriyal bölgelerden ROI'leri veya tüm hücre gövdesinden ROI'leri seçin.Hücrelerin yanındaki bölgeleri seçin. Arkaplan floresan yoğunluğunu hesaplamak için birkaç ölçüm alın ve ortalama arkaplan yoğunluğunu hesaplamak için Microsoft Excel kullanarak her bir zaman noktası için her hücredeki ilgi bölgelerinin ortalama floresan yoğunluklarından ortalama arkaplan floresan yoğunluğunu çıkarın. Arkaplan yoğunluğunu çıkardıktan sonra, TMRM veya DCF floresan yoğunluğunu bazal floresan değerine göre normalize edin.Bu formülü kullanarak, floresan yoğunluğundaki zamanla meydana gelen değişimleri gösteren grafiği oluşturmak için Sigma plot programını kullanın. Burada, TMRM ile inkübe edilmiş sıçan kortikal nöronlarının floresan görüntüsüne bir örnek verilmiştir. F-C-C-P-A mitokondriyal açıcının eklenmesi, mitokondriyal depolarizasyona ve TMRM floresan yoğunluğunun kaybına yol açar.FCCP eklenmeden önce temel TMRM floresans seviyesi stabil kalır. TMRM floresans değişikliklerinin zaman içindeki kantitatif analizi, FCCP eklemesinden sonra TMRM floresansında anlamlı bir azalma olduğunu göstermektedir. Burada, DCF ile yüklenmiş sıçan kortikal nöronlarının bir floresans görüntüsü örneği yer almaktadır.Hidrojen peroksit uygulanmadan önceki ilk 120 saniye boyunca bazal DCF floresans seviyesi değişmeden kalır. Hidrojen peroksit eklenmesi, hücre gövdelerinde DCF floresans yoğunluğunun artmasıyla sonuçlanır. DCF floresansının zaman serili ölçümleri, hidrojen peroksit uygulamalarından sonra artmış olan sabit seviyelerini göstermektedir.Bu prosedürde, fotobeyazlama ve fototoksisiteden kaynaklanan artefaktları önlemek için düşük lazer gücü ve hızlı tarama hızı kullanmayı hatırlamak önemlidir. Deneyinizde başarılar dileriz.

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Katsalifis, A., et al. Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoks Durumunun Ratiometrik İndikatör Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, bir oransal floresan indikatörü kullanılarak birincil nöronlarda mitokondriyal redoks durumunun görüntülenmesini göstermektedir. Bir floresan mikroskobu altında iki uyarma dalga boyu uygulanarak, mitokondriyal oksidasyonu değerlendirmek için floresan yoğunluk oranı ölçülür. Protokol, kalsiyum akışını ve reaktif oksijen...

Primer nöronlarda mitokondriyal redoks durumunun bir oransal gösterge kullanılarak görüntülenmesi

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Bu makalede, MitoTimer biyosensör ile donatılmış astrosit kültürlerinin mitokondriyal zaman atlamalı görüntüleme yöntemi ve mitokondriyal dinamiklerin, hareketliliğin, morfolojinin, biyogenezin, redoks durumunun ve cironun çokparametrik analizi açıklanmaktadır.

Kültürlü Astrositlerde Mitokondriyal Sistemin Canlı Görüntülenmesi

Bu makalede, konfokal canlı mikroskopi kullanılarak primer hipokampal ve kortikal nöronlarda bazal redoks durumundaki farklılıkları ve akut pertürbasyonlara redoks yanıtlarını belirlemek için bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, diğer hücre tiplerine ve mikroskoplara minimum değişiklikle uygulanabilir.

Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Mitokondriyal ağ son derece karmaşıktır ve analiz edilmesini çok zorlaştırır. Yeni bir MATLAB aracı, hızlandırılmış görüntülerde canlı konfokal görüntülenen mitokondriyi analiz eder, ancak bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmine neden olur. Bu sorunu çözmek için, hızlı dosya analizine olanak tanıyan rutin bir optimizasyon geliştirildi.

İzoforma Özgü Retinoik Asit Reseptörleri ile Canlı Nöronal Mitokondri Homeostaz Modülasyonunun Optimize Edilmiş Otomatik Analizi

Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Bu çalışmada, adım adım bir protokol açıklıyoruz ve canlı hücrelerde mitokondrinin morfolojik özelliklerini belirlemek için numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere temel ayrıntıları vurguluyoruz. Bu yöntem, çeşitli koşulları incelemek için mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılır.

Canlı Hücrelerde Mitokondriyal Morfolojinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Belirlenmesi

Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak mitokondriyal sağlığı izlemek için invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir yöntem sunuyoruz. Mitokondriyal redoks durumlarını nicelendirmek için RRS kullandık ve mitokondriyal sağlık için bir metrik geliştirdik; Rezonans Raman azaltılmış mitokondriyal oranı (3RMR), bu ölçüm oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analitlerinden daha hızlı yanıt verdiğini gösteriyor.

Rezonans Raman Spektroskopisi Kullanarak Mitokondriyal Fonksiyonun Gerçek Zamanlı, İnvaziv Olmayan Değerlendirmesi

Öğrenin, TMRM ve H2D CFDA floresan probları kullanarak canlı sıçan kortikal nöronlarda mitokondrial membran potansiyeli ve reaktif oksijen türlerini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, konfokal mikroskopi ile gerçek zamanlı görüntüleme sağlar.

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet