İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Bu prosedürün genel amacı, solunan mitokondriyi kültürlenmiş hücrelerden veya fare dokusundan izole etmek ve daha sonra hücresel durumun bir ölçüsü olarak zar potansiyellerinin gücünü değerlendirmektir. Kültürlenmiş hücreler için bu, önce kaplamanın ve ardından hücrelerin işlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, hücreler homojenize edilir ve homojenat, mitokondriyi hücrelerden daha fazla serbest bırakmak için bir iğneden geçirilir.

Fare dokusu için, karaciğer fareden eksize edilir ve daha sonra her iki tür başlangıç materyali ile buz üzerinde homojenize edilir. Diferansiyel santrifüjleme daha sonra mitokondriyi hücresel içeriğin geri kalanından izole etmek için kullanılır. Mitokondri, membran potansiyeline duyarlı floresan boyanın eklenmesi de dahil olmak üzere bazı işlemlere tabi tutulduktan sonra, membran potansiyelinin gücünü hesaplamak için TMRE floresan ölçümleri yapılır.

Sonuç olarak, mitokondriyal fonksiyon ve mitokondriyal membran potansiyelindeki bozulmalar, bir floresan plaka okuyucu ile birlikte membran potansiyeline duyarlı bir floresan boya kullanılarak değerlendirilebilir. Kuplörler ve inhibitörler üzerinde ortak mitokondriyal ile tedavi edildiğinde, bu yöntem sitokin kaynaklı apoptoz ve mitokondri disfonksiyonu hakkında fikir verebilse de, bir LS.It iki veya daha fazla farklı numune arasında karşılaştırma yapılan başka herhangi bir sisteme de uygulanabilir. sağlıklı hastalıklara karşı veya farklı metabolik hızlara sahip iki farklı hayvan türü. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Mitokondri izolasyon adımlarını öğrenmek zor olduğu için.

Bunun nedeni, tekniği uygularken geleneksel yöntem bölümlerinde gözden kaçabilecek birçok nüansın olmasıdır. Bu prosedüre, sitokin tedavi plakasından 48 saat önce metin protokolünde tarif edildiği gibi büyüyen insan embriyonik böbrek hücreleri ile başlayın, 160.000 hücreyi bir T 1 75 şişesine yerleştirin ve tedavi sırasında yaklaşık% 70 yoğunluk elde edin. Daha sonra serum, 24 saat sonra ortamı aspire ederek ve aynı hacimde serum içermeyen ortamla değiştirerek hücreleri aç bırakın.

Son olarak, mitokondrinin izolasyonunu gerçekleştirmek için serum aç hücrelerini, çözünmüş sitokinlerin doğrudan hücre kültürü ortamına eklenmesiyle tedavi edin. Önce ortamı aspire edin ve yapışma hücrelerini 15 mililitre bir x fosfat tamponlu salin veya PBS ile iki kez yıkayın. Yıkamadan sonra her seferinde tamponu aspire edin ve yapışan hücreleri alttan çıkarmak için şişeyi kazıyın.

Daha sonra her şişeye 15 mililitre bir XPBS ekleyin, döndürün ve buz üzerinde ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Kazıma yapıldıktan sonra, santrifüjleme, aspirasyon süpernatanları ve resüsü takiben sallanan bir kova rotorlu bir masa üstü santrifüj kullanarak, tüpleri 700 kez G dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Her peleti bir mililitre mitokondriyal izolasyon tamponunda askıya alın.

Daha sonra, her iki süspansiyonu birleştirin ve mitokondride homojenizasyon için küçük bir cam kaba aktarın yeniden askıya alındı ve mitokondriyal izolasyon tamponu, çözelti ilk hatta ulaşana kadar cam kaba aktarın Havaneli bir matkaba bağlıyken, hücreleri buz üzerinde orta hızda üç geçiş boyunca homojenize etmeye devam edin. Havaneli solüsyona yerleştirirken hava kabarcıklarının giderilmesine, havaneli sıvının üzerine çıkarılmamasına ve sürekli geçişlerle sabit bir hız kullanılmasına özen gösterilmelidir. Homojenize çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra çözeltiyi 18 gauge kullanarak üç mililitrelik bir şırıngaya çekin, bir yarım inçlik iğne ve 27 gauge bir yarım inçlik iğne ile buz üzerindeki konik tüpe geri atın. Hücre zarının bozulması için bu kuvveti kullanmak için çözeltiyi tüpün iç duvarına doğru dışarı atmaya dikkat edin. Şırınga adımlarını toplam beş kez tekrarlayın, ardından çözeltiyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sallanan bir kova rotoru kullanarak bir masa üstü santrifüjde 600 kez G dört santigrat derecede beş dakika

Mitokondri, bu ilk düşük hızlı dönüşten sonra süpernatantın içindedir, bazı zarlar ve kırılmamış hücreler peletlenirken, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve üç adet 1.5 mililitrelik tüp arasında dağıtın. Daha sonra üç tüpü sabit açılı bir rotorda 10.000 kez G'de beş dakika boyunca dört santigrat derece santrifüjleyin. Kültürlenmiş hücrelerden gelen mitokondri beyazımsı renkte görünür.

Karaciğeri her hayvandan çıkarın ve kanı durulamak için buz gibi, kalsiyum veya magnezyum içermeyen bir XPBS yerleştirin. Karaciğer dokusunu buz üzerinde uzaktaki bir tabağa aktarın ve bir dakika boyunca taze bir tıraş bıçağı kullanarak ince parçalar halinde doğrayın. Daha sonra, tampon ilk satıra ulaşana kadar damara doku ve uygun tamponu ekleyin.

Beş geçiş boyunca havaneli ile buz üzerindeki dokuyu elle homojenize etmeye devam edin. Havaneli solüsyona yerleştirirken hava kabarcıklarının giderilmesine, havaneli sıvının üzerine çıkarılmamasına ve sürekli geçişlerle sabit bir hız kullanılmasına özen gösterilmelidir. Metin protokolünde istendiği gibi numuneleri santrifüjleme ve homojenizasyon ile işlemeye devam edin.

Yeni süpernatanları her numuneden ilk süpernatant ile birleştirdikten sonra, tüpleri beş dakika boyunca 10.000 kez G dört santigrat derecede sabit açılı bir rotorda santrifüjleyin. Bir pipet ucu kullanarak ve / veya tüpün kenarlarına doğru iterek üstteki beyaz kabarık tabakayı dikkatlice aspire edin. Sonra süpernatantın geri kalanını yavaşça dökün ve resüsleyin.

Karaciğer mitokondri peletlerini 500 mikrolitre mitokondriyal izolasyonda askıya alın. Karaciğerden gelen tampon mitokondri kahverengidir. Reaksiyonlar başlamadan hemen önce numuneleri hızlı bir şekilde buzun üzerine yerleştirin.

Mitokondriyi mililitre başına 0,5 miligrama seyreltin. Deneysel tampon ile çalışma konsantrasyonu. Tüpleri, seyreltilmiş mitokondrinin toplam hacmi olan 10'da bir oranında ayırmak için metin protokolünde listelendiği gibi uygun tedavileri ekleyin.

Daha sonra, seyreltilmiş mitokondriyi her bir reaksiyon tüpüne yerleştirin ve uygun karışımı sağlamak için her tüpü hafifçe çalkalayın. Reaksiyonları tezgah üzerinde yedi dakika inkübe edin. Daha sonra mitokondriyal reaksiyon hacmine eşit miktarda iki mikromolar tetraetil, çubuk domin, etil ester, kısaltılmış TMRE ekleyin.

Yine, uygun karışımı sağlamak için her bir tüpü hafifçe çalkalayın. Reaksiyonları tezgah üzerinde yedi dakika daha inkübe ettikten sonra, mitokondriyi beş dakika boyunca 10.000 kez G dört santigrat derecede sabit açılı bir rotorda santrifüjleme yoluyla peletleyin. Daha sonra her bir numunenin süpernatan hacminin yarısını 3 84 üzerine yükleyin.

Kuyu plakası, numunelerin floresansını okumaya devam edin ve daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi kontrol ile her tedavi arasındaki floresan katlama farkını hesaplayın: HEK 2 93 T hücrelerinin TNF, alfa, IL, bir beta ve IFN gama ile 24 ila 48 saat boyunca tedavisi, ilerleyici miktarlarda hücre ölümüne yol açar. Hücre canlılığı, 24 saatlik tedavi ile hücre canlılığında yaklaşık% 10'luk bir azalma ve yaklaşık% 20'lik bir azalma olduğunu tutarlı bir şekilde gösteren MTT testleri kullanılarak değerlendirildi. 48 saatlik tedavi ile benzer konsantrasyonlarda muamele edilen hücreler, 48 saatte benzer hücre ölümü sonuçları verir.

Ve bireysel sitokinlerle tedavi, canlılıktaki azalmanın kombinatoryal etkilerden kaynaklandığını ortaya koymaktadır. Canlılık verileri, üç ayrı deneyin ortalama standart sapmasını temsil eder. Her çalıştırma üç nüsha halinde ve hata çubuklarının sıkılığı, verilerin tekrarlanabilirliğini gösterir.

Sitokin ile tedavi edilen hücrelerden izole edilen mitokondrideki zar potansiyelindeki yüzde azalma, mitokondriyal sağlığın sitokin tedavilerinden etkilendiğini gösterir ve bu prosedürü takiben canlılık verilerini doğrular. Farklı numuneler arasında hangi enerji ve solunum farklılıklarının olduğu gibi ek soruları değerlendirmek için bir TP üretiminin, toplam bir TP'nin veya oksijen tüketiminin değerlendirilmesi gibi diğer yöntemler oluşturulabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sağlam fonksiyonel mitokondriyi nasıl izole edeceğinizi iyi anlamalı ve hücresel durumun bir yansıması olarak zar potansiyellerinin gücünü değerlendirmelisiniz.