Name: İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin, hücre kültürleri ve fare dokusundan solunum yapan mitokondri izolasyonunu ve TMRE boyası ile membran potansiyeli ölçümünü. Bu yöntem, hücresel sağlık ve mitokondriyal fonksiyon bozukluklarını değerlendirmede araştırmacılara güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma kısmen NSF hibesi CHE-1229562 (VDGM), Elon Üniversitesi Lisans Araştırma Ofisi, Elon Kimya Bölümü ve Elon Lumen Ödülü (TL ve TAD), Elon College Fellows Programı (JAC) ve Elon College Honors Programı (TAD) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi. Soruşturma için 1. Modelleri <ol><li> Hücre kültürü <ol><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-T293),% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içinde hücreler, muhafaza edin. </li><li> T75 matara hücreleri büyümek ve onları% 90 izdiham ulaşmak için bekleyin. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 3-5 dakika boyunca, tripsinizasyon (% 0.25 Tripsin-EDTA) vasıtasıyla hücre bölme yapın </sub&gt; 700 x g de 4 ° C &#39;de, 5 dakika için bir hücre aynı hücre ortamı hacmi, ve santrifüj ile tripsin inaktivasyonu. </li><li> Medya aspire ve kültür ortamında hücre pelletini. </li><li> 7 x 10 4 hücreleri T75 içinde uygun bir şişe ya da levha tohum hücreleri tedavi sitokin önce 48 saat şişe. Bu tedavi sırasında% 70 ~ yoğunluğu vermelidir. </li><li> Serum açlıktan ölüyor hücreleri, 24 saat sonra ortam aspire edilmesiyle ve serumsuz ortam, aynı hacimde (DMEM, steril) ile değiştirerek. </li><li> 5 ug / ul, 10 ng / ul çalışma konsantrasyonlarda ultra saf su ile liyofilize edilmiş toz, TNF-α, IL1-β ve IFN-γ, hazırlama, ve 10 ng / ml, sırasıyla ve çukurlara eklemek / matara. </li><li> Tedavi, serum, doğrudan uygun şişe hücre kültür ortamına çözünür sitokinlerin ilave edilerek hücreler aç. Tedaviler, tek tek sitokinlerin her bir 3 kokteyl oluşuyordu (şekilde &quot;* 3&quot; olarak anılacaktır) ya da sterBir kontrol olarak Ile su (&quot;0&quot; olarak anılacaktır). </li><li> Değerlendirme ve hasattan önce 24, 48 ya da 72 saat tedavi hücreleri inkübe. </li></ol></li><li> Hücre canlılığı değerlendirmesi <ol><li> 1x PBS içinde 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) &#39;in bir 5 mg / ml solüsyon -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) konur. </li><li> 12 oyuklu plakalar için, her bir göze MTT çözeltisi 100 ul ve hafifçe eşit dağılımını sağlamak için girdap. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de 15 dakika ila 1 saat boyunca inkübe edin ve mor renk değişikliği için bir mikroskop altında bakın. Mor bir mevcut ise, yeniden girdap ve mor gözlenene kadar, hücreler 5 dakika aralıklarla inkübasyona izin verin. Gerekli olan zaman miktan, her bir araştırmacı tarafından belirlenmelidir. </li><li> Tüm mor renk hücreleri bıraktığı kadar tekrar pipet kullanarak, her bir MTT çözücü (izopropanol içinde 4 mM HCl ve% 0.1 NP-40), 700 ul ve 5-10 dakika boyunca, oda sıcaklığında bir plaka (lar) kaya ya da . Mor iserenk, hücre çıkan çözücü ilave 200 ul ve girdap devam etmez. </li><li> Kaynaklar tutarlı ayarlar alındığı gibi, ancak 595 nm sürece, aynı zamanda kabul edilebilir olduğu, analiz için, her bir gözden 100 ul alır ve bir 96-çukurlu plaka içine koyun ve 570 nm kullanılarak bir plaka okuyucusu ile 630 nm&#39;lik bir referans dalga boyu ile oku. </li></ol></li><li> ALS Hayvan Modeli <ol><li> Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi. </li><li> Mutant SOD1 25 karşı standart primerler ile genotiplendirmesi gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> Mitokondri 2. izolasyonu NOT: Bu hızlı çalışır ve işlem boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak için önemlidir. <ol><li> Mitokondriyal yalıtım tamponu (MIB), omurilik yalıtım tamponu (SC MIB) ve deney tampon hazırlanması (EB) <ol><li> Öncesinde MIB ve EB için zaman aşağıdaki stok çözümleri hazırlayın. </li><li> H2O, 70 ml Tris baz, 12.1 g çözülmesiyle 1 M Tris / MOPS yapmak 7.4 pH almak için kuru MOPS ekleyin. 100 ml finale ses seviyesini ayarlayın. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li><li> 80.2 K 2 HPO 4 ml ve KH 2 PO 4 19.8 ml karıştırarak 1 M Kphos olun. Oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> H2O ile 10 ml EGTA, 3.8 g eklenmesi ile 0.2 M EGTA / Tris yapmak Çözülmüş, ~ 30-40 ml kadar 1 M Tris / MOPS ekleyin. 50 ml oda sıcaklığında steril filtre ve saklamak için ayarlayın. PH ~ 6.7 olacağını unutmayın. </li><li> 10 ml yaparak, 1 M Glutamat yapmakGlutamik asit 1 M çözelti. Filtre sterilize ve mağaza 4 ° C. </li><li> Malik asit, 1 M solüsyon, 10 ml yaparak, 1 M MAlate&#39;I sağlayın. 50 mM Tris / MOPS ekleyin. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li><li> 200 mM sükroz, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 1 mM EGTA / Tris bir konsantrasyonda MIB sağlayın. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li><li> 250 mM sükroz, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT ve proteaz inhibitörü kokteyli bir konsantrasyonda SC MIB olun. </li><li> 125 mM KCl bir konsantrasyonda EB yapmak, 10 mM Tris / MOPS, pH 7.4, 5 mM glutamat, 2.5 mM malat, 1 mM K fosfat, pH 7.4 ve 10 mM EGTA / Tris yer alır. 4 ° C&#39;de sterilize Filtresi ve mağaza. </li></ol></li><li> Hücrelerin hasat öncesinde Ekipmanları hazırlık. <ol><li> Küçük bir cam kap ve homojenleştirme havaneli steril su ile üç kez durulanır ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Böyle bir standart matkap, hücre scra gerekli öğeleri toplayınpers, 1.5 mi, 15 ml ve 50 ml tüpler ve çözeltiler. </li></ol></li><li> Mitokondri İzolasyon <ol><li> Kültür Hücreler <ol><li> Her bir numune tipi için, hücreler iki T175 şişelerde. </li><li> Hücrelerdir ~% 90 konfluent sağlanması ve kontrol deneyi, ya da levha olarak kullanmak ve adım 1.2, yukarıda tarif edildiği gibi tedavi etmek. </li><li> Ve tezgah üstüne, aspirat ortam üzerinde 1x PBS ve her seferinde 15 ml iki kez yapışkan hücreleri yıkayın. </li><li> Tampon aspire ve şişenin tabanından yapışmayan hücreler giderilmiş şişeler kazıyın. </li><li> Her bir şişeye, girdap 1x PBS 15 ml ilave edilir, ve buz üzerinde tek tek 15 ml konik tüp ve yer aktarın. </li><li> Kazıma bir sallanan kepçeli rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüj kullanılarak 700 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj tüpleri yapıldıktan sonra. </li><li> Aspire süpernatantlar ve MIB 1 ml her pelletini. </li><li> Her iki süspansiyonlar birleştirin ve homojenizasyon için, küçük bir cam kabına transfer edilir. </li><li> MIB Eklegeminin tampon ilk satırı ulaşana kadar. Üç kez geçirilerek orta hızda bir uçlu havan tokmağı ile homojenize hücreleri. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml&#39;lik bir konik tüp homojenleştirilir çözeltisini. </li><li> 18 gauge 1 ½ inç iğne kullanılarak bir 3 ml&#39;lik enjektöre çözüm çizin ve bir 27 ölçü ½ inç iğne ile buz üzerinde tekrar konik tüp içine sınırdışı. Hücre zarı bozulması için o gücü kullanmak için tüpün iç duvarına karşı çözüm sınırdışı etmeye özen gösterin. </li><li> Beş kez toplam şırınga adımları tekrarlayın. </li><li> Sallanan kovalı rotor kullanılarak bir masa üstü santrifüjü içinde 600 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüje çözeltisini. </li><li> Dikkatle süpernatant kaldırmak ve üç 1.5 ml tüpler arasında dağıtmak. NOT: Mitochohücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise ndria, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri. </li><li> Aspire süpernatanları 100 ul MIB pelet birleştirmek ve hemen buz üzerine yerleştirin ve. Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır. </li></ol></li><li> Fare dokularından Mitokondri izolasyon <ol><li> IACUC protokole göre fare anestezisi. Anestezi ikna etmek için% 5,0 bir buharlaştırıcı ayarlayın. Göz yaklaştı veya bir pamuklu çubukla vurdu zaman hayvan ayak tutam veya kırpma refleksinin için refleksi eksikliği ile anestezi olduğunu doğruladı. % 1.5 ile% 2.0 arasında Buharlaştırıcı&#39;yı tutarak tüm cerrahi prosedür için anestezi altında fare tutun. </li><li> Hariçimkb PBS 1x buz soğuk ayrı ayrı hayvan ve yerden karaciğer ve spinal kord - / - herhangi bir kan uzakta durulayın. </li><li> Karaciğer için, buz üzerinde bir ağırlık çanak doku transferi ve 1 dakika boyunca taze jilet kullanarak ince parçalar halinde doğrayın. </li><li> Tampon ilk satırı ulaşıncaya kadar kaba doku ve (omurilik için karaciğer ya da SC MIB için MIB) uygun tampon ekleyin. Beş geçer elle havan ile doku homojenize. Damar sıvının üzerinde tokmağı kaldırmak ve sürekli paslar ile bir sabit hız kullanmak için değil, bu adımı sırasında buz üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Homojenatlar 15 ml tüpler temizlemek için aktarın. </li><li> 750 x g&#39;de, 10 dakika süre ile 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri. </li><li> Temiz tüpler içine Süpernatantlar kaydedin ve buz üzerine koyun. Not: hücre zarları ve kesintisiz hücreleri topaklanır ise mitokondri, bu birinci, düşük hızlı bir dönüş sonra süpernatan içinde bulunmaktadır. </li><li> Omurilik pelet yeniden askıya in SC MIB 500 ul. </li><li> Sadece SC MIB ile damar yarım bu kez dolum, her üç kez yeniden homojenize. </li><li> Taze tüp yeni Homojenat aktarın. </li><li> Santrifüj 750 x g&#39;de, 10 dakika süre ile 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor. </li><li> Her örnekten ilk süpernatant ile, daha fazla mitokondri içeren bu yeni süpernatanlan, birleştirin. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor Santrifüj tüpleri. </li><li> Aspire süpernatanları 500 MIB ul ve 50 ul SC MIB omurilik peletler karaciğer pelet tekrar süspansiyon ve hemen buz üzerine yerleştirin. Not: Mitokondri bu yüksek hızlı bir dönüş sonra pelet içindedir. Mitokondri tipik olarak izole edildikten sonra 2-3 iyon buz ~ onların membran potansiyeline sahiptirler ve MIB içinde konsantre edilmiş bir stok çözeltisi olarak en kararlı olacaktır. </li><li> Çözelti içinde mitokondri konsantrasyonunu tahmin etmek için bir protein konsantrasyonu analizi gerçekleştirir. Talimatı uygulayınticari bir Protein Deney Kiti veya benzer bir yöntemle 26 ile s. Mitokondri tipik konsantrasyonlar şunlardır: 2 T175 şişesi verim ~ 2 mg / ml, 1 fare karaciğer ~ 3-5 mg / ml ve 1 fare omurilik ~ 1-3 mg / ml olmuştur. </li></ol></li></ol></li><li> (Üretici tarafından sağlanan protokol uyarlanmış) Quantikine ELISA Kit c bir Ar-Ge Sıçan / Fare Sitokrom kullanarak sitokrom-c tahlil. <ol><li> Hemen tepkileri kurmadan önce, EB ile 0.5 mg / ml çalışma konsantrasyonu mitokondri sulandırarak reaksiyonları (tüp başına mitokondri tipik haliyle 30-50 ul) 1.5 ml tüpler içinde seyreltilmiştir mitokondri dağıtın. </li><li> Seyreltilmiş mitokondri, toplam hacminin% 1, EB veya DMSO ya ekleyin ve 7-10 dakika tezgah üstünde tepkileri kuluçkaya yatmaktadır. Daha uzun bir zaman diliminde gerekli olup olmadığını Bu reaksiyonlar, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca stabildir. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika ve dikkatli bir 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondrily süpernatant ayrı ve ayrı bir 1.5 ml tüpler her koyun. Not: tüpler her iki sonraki analiz için -20 ° C&#39;de donduruldu ya da hemen kullanılabilir. </li><li> Bir pelet ve süpernatan 27 sitokrom c konsantrasyonunun karşılaştırarak sitokrom c salınmasını belirler. <ol><li> 1x PBS içinde% 0.5 TX-100 ile reaksiyonun orijinal hacminin pelet çözündürülmesi ile örnekleri hazırlanır. </li><li> Her numune için, ELISA plakasına 2 kuyu, hemen çözündürülmüş pelet için bir sitokrom C bitişik 100 ul ilave edilerek tepkime üstte yüzen madde için bir hazırlama (şişeden doğrudan kullanımı) artı% 0.5 Tx 100 ul 1x PBS içinde 100 ve daha sonra, tüm topak ya da süpernatan numunesi arasında. </li><li> Yavaşça, Kapağı karıştırın ve 1 saat, 37 ° C inkübe 20 saniye plaka düşük ayar (seviye 2-4) girdap. </li><li> Daha sonra, üretici göre plaka seyreltilmiş yıkama tamponu ile dört kez yıkayıner talimatları. Kağıt havlu üzerine kuyu dokunarak herhangi bir aşırı çözüm çıkarın. </li><li> Her bir çukura 1 A + B geliştirme çözeltisi ve karanlıkta, oda sıcaklığında 20-30 dakika süre ile plaka inkübe: Daha sonra, 1 150 ul ilave edin. </li><li> Son olarak, her bir durdurma çözeltisi 50 ul ve bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 540 nm de absorbans okumaları alır. Her reaksiyon için yüzer genel peletindeki sitokrom c değeri ile karşılaştırılması suretiyle sitokrom C salınımı miktarını hesaplayın. </li></ol></li></ol></li></ol> Mitokondriyal (Dys) fonksiyonu 3. Değerlendirme <ol><li> Reaksiyonları ayarlanır hemen önce, 0.5 mg mitokondri seyreltik / ml EB konsantrasyonu çalışma ve (mitokondri tipik haliyle 30-50 ul tüp başına kullanılır) reaksiyonlar için 1.5 ml&#39;lik tüplere yerleştirildi. </li><li> Mitokondriyal tedaviler <ol><li> 50 nM Valinomycin ile karıştırılır FCCP uygun tedavinin ekleyin (EB kontrol, 1 uM, 10 uM rotenon, 5 uM oligomycin, 2 mM KCN ya da 200 uM ATP, nihai konsantrasyon) ile seyreltildi mitokondri toplam hacmine inci 10/01 reaksiyonu da ayırmak için. 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe. NOT: zararlı olabilir deri yoluyla kazara yutulması veya emilim gibi bu maddeleri kullanırken dikkatli alınmalıdır. </li><li> 100 uM&#39;lik bir çalışma konsantrasyonunda steril su içinde yeniden teşekkül ettirilmiş ve 2 uM, -20 ° C&#39;de saklandı, TMRE seyreltin ve mitokondriyal reaksiyon hacmine eşit bir hacim ilave edin. </li><li> 7 dakika tezgah üstünde reaksiyonları inkübe. </li><li> 10.000 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C &#39;de sabit açılı rotor içinde santrifüjlemek suretiyle pelet mitokondri. </li><li> Yük, bir 396-kuyulu bir levha üzerine, her numune süpernatanı hacminin yarısı floresan okuyun. NOT: TMRE uyarma ve emisyon dalga boyları için kullanılacak hacim ve plaka kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak optimize edilmelidirdeneyi. Uyarım / emisyon dalga boyları kullanılarak 1 uM TMRE 25 ul standart 384 oyuklu siyah plaka (nihai reaksiyon konsantrasyon) ve en yüksek sinyal elde edildi kullanılarak &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Kontrol (EB) ve kontrol örneğinden RFU deneysel örnek için plaka okuyucu elde edilen göreceli floresan değerini (RFU) bölünmesi ile her tedavi arasında floresan kat-farkını hesaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Madeira, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of mitochondrial bioenergetics.</a> Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).</li>
<li>Sakamuru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+homogenous+membrane+potential+assay+to+assess+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function.</a> Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).</li>
<li>Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial genome.</a> Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).</li>
<li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+import+system+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The protein import system of mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).</li>
<li>Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import%3A+reversible+binding+of+the+presequence+at+the+trans+side+of+the+outer+membrane+drives+partial+translocation+and+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding.</a> Cell. 80, 127-137 (1995).</li>
<li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+mitochondrial+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of mitochondrial cell death.</a> Science. 305, 626-629 (2004).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+In+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714(2013).</li>
<li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404(2009).</li>
<li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).</li>
<li>Wu, C. C., Bratton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+intrinsic+apoptosis+pathway+by+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).</li>
<li>Kuwana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Joshi, D. C., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+in+live+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons.</a> Journal Of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+I%2C+background+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods.</a> Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+II%2C+results+and+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion.</a> Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).</li>
<li>Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+intact+mitochondria+from+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain.</a> Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).</li>
<li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy%3A+targeting+the+mitochondrial+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway.</a> Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+requires+BCL2+to+sequester+prodeath+BIM%2C+explaining+sensitivity+to+BCL2+antagonist+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+dependence+and+ABT-737+sensitivity+in+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 111, 2300-2309 (2008).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I+inhibitor+rotenone+induces+apoptosis+through+enhancing+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).</li>
<li>Hynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+drug-induced+mitochondrial+toxicity+using+fluorescence-based+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences+%3A+An+Official+Journal+Of+The+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes.</a> Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).</li>
<li>Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+optical+oxygen+sensing%3A+protocols+and+critical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+An+International+Journal+On+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li>
<li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death & Disease. 4, e493(2013).</li>
<li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity%3A+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li>
<li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture%3A+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li>
<li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li>
<li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li>
<li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Rekombinant sitokinler ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi 48 saat (Şekil 1) üzerine hücre ölümü orta miktarda neden olur. TNF-alfa, muamele ile uyarılan hücre ölümünün miktarı önceki çalışmalara 30 benzer ve hücre canlılığı, tek başına de literatürde 31,32 ile uyumlu olan herhangi bir sitokin olan belirleyici miktarda daha büyük olan çok sayıda sitokin birlikte uygulanmasından sonra azalır. miktarları ve sitokin tedavileri türleri yanı sıra bireysel sitokinler kokteyller karşılaştı...

Yaşayan hücreler yağ ve karbonhidrat şeklinde metabolik enerjiyi banka ve biyosentezi, membran taşıma ve hareket için bu enerjiyi kullanır. Bazı enerji glikoliz sırasında doğrudan ATP içine beslenme şekerlerin dönüşüm yoluyla sitosol içinde elde edilmektedir. Bununla birlikte, bir hücre ATP üretiminin başlıca kaynağı mitokondriyal solunum zincirinde 1 ile mitokondri içinde yararlanır. mitokondri yapısı, etkili ve verimli bir ATP üretimi için gerekli olan uzaysal yönlendirilmesini sağlar. Mitokondri bileşenleri bir zarlar arası boşluk ve birlikte matris içteki mitokondriyal bölme, ev ile ayrılmış bir çift zar sahip ve ATP üretimi dahil kimyasal reaksiyonları koordinat. iç zarı solunum zinciri gibi ATP sintaz, ATP oluşumu için bir araya ADP ve Pi getiren protein kompleksi ihtiva zara bağlı protein komplekslerinin bir dizi içerir. haner membran kristalı içine katlanmış ve elektronlar sitokrom-c, zarlar arası alanı içinde kompleksleri arasında hareket eden bir çözünür elektron taşıyıcı aracılığıyla solunum zinciri kompleksleri boyunca iletilir. Elektronlar hareket ettikçe, indirgeyici eşdeğerleri oksidasyon oluşur ve hidrojen iyonları zarlar arası boşluğa matristen pompalanır. Zarlar arası alanı içinde yüksek iyon konsantrasyonunun bir sonucu olarak, bir elektrokimyasal gradyan iç mitokondriyal zarın (Δψ) 2 üzerinde bir zar potansiyeli elde oluşturur. Oksijen elektron taşıma zincirinin son elektron alıcısı ve hidrojen iyonları matriks geri arası boşluğa ATP sentezler akan ve bunu doğrudan yaparken ATP oluşumuna neden olur. Bütünüyle tarif edildiği gibi bu işlem, oksidatif fosforilasyon gibi bilinmektedir. krista kıvrımlar maksimal elektron taşıma ve ATP üretimi içinde sağlayan, iç zarı yüzey alanını arttırmakHer mitokondri. proteinler, enzimler ve oksidatif fosforilasyon ile ilgili diğer moleküller, nükleer ve mitokondriyal genlerin elde edilir. Mitokondri 13 protein olarak tRNA&#39;ların ve ATP üretimi için gerekli olan 3 mRNA için kendi dairesel DNA kodlama içerir. Bununla birlikte, çok daha fazla protein gereklidir ve böylece kodlanan nükleer bulunmaktadır. Bu, nükleer-şifrelenmiş proteinlerin çoğunluğu ön-madde proteininin N-terminalinde presequences kullanımı ile mitokondrial matris hedeflenir ve bunların alma Δψ 4,5 kısmen tahrik edilir. Bir hücrenin Biyoenerjetiğin katkıda ötesinde, mitokondri, aynı zamanda, TCA ve beta-oksidasyon düzenleyen kalsiyum yoluyla hücresel sinyal, aynı zamanda apoptoz 6 önemli bir rol olarak önemli metabolik süreçleri de etkilemektedir. Özellikle, hücresel stres zamanlarında, üzerinde ikamet veya BCL-2 ailesi proteinleri mitokondriyal neden olabilir mitokondriyal dış membran etkileşimdış membran geçirgenliği (MOMP) 7,8. MOMP sırasında, sitokrom C ve diğer proteinlerin çeşitli sitosolik proteinler ile birlikte karmaşık bir apopitozom 9,10 adı oluşturan sitozolüne yayımlanan ve edilmektedir. apopitozom apoptoz yürütme aşamasında hücresel proteinler ve DNA parçalamak için gitmek kaspazlan harekete geçirir. MOMP meydana bitmez, ΔΨ çöktü ve ATP üretimi durdurdu. Bu nedenle, apoptoz gibi başlatılır mitokondriyal fonksiyonu ele geçirilmiş ve ΔΨ değişiklikler mitokondriyal ve hücre sağlık 12 ile korele edilebilir. Apoptoz da hastalık oluşmasından ve / veya ilerlemesi hakkında değerli bilgiler elde edebilirsiniz birçok hastalık modelleri, ΔΨ için mitokondriyal fonksiyon ve değişiklikler bir son nokta iken. Örneğin, mitokondriyal yapısal ve fonksiyonel değişiklikler nörodejeneratif hastalıkların 13,14 sırasında belgelenmiştir. Protokol, iso ilk bölümündeonların ΔΨ muhafaza sağlam mitokondri lation tarif edilmektedir. HEK-293T hücreleri apoptozisini sağlamak için farklı konsantrasyonlarda ve yeniden birleştirici TNF-α, IL1-β ve IFN-γ kombinasyonlarına maruz bırakıldı. Sık sık kendi reseptörüne bağlanmasının 6, TNF-α etkileşimi tarafından tetiklenebilir primer insan septik örnekleri 15 ve apoptoz harici yolunun yüksek olduğu rapor edilmiştir, çünkü bu sitokinler seçilmiştir. Kültürlenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, primer dokulardan işlevsel mitokondria izole etmek için gerekli ince varyasyonlar olduğundan çok fazla araştırma hayvanları kullandığı için, ve protokol, aynı zamanda, karaciğer ve lateral skleroz (ALS) fare modeli ön omurilik ile ilgili mitokondri izole açıklamaktadır. protokolü ikinci bölümü bir flüoresan plaka okuyucusu ile potansiyel duyarlı fluoresan boya kullanılarak mitokondriyal membran potansiyeli düzensizlikler izlemek için geliştirilmiştir. FarkHücresel durumu (sağlıksız vs yani, sağlıklı) arasındaki ın mitokondrial membran potansiyelinin dağılımı neden bütün bunlar ayrılması ajanlar, solunum zinciri inhibitörleri, karmaşık inhibitörleri ve iyonoforlar ile birlikte izole mitokondri ΔΨ gücünü nicelleştirilmesiyle ayırt edilir. Bu nedenle mitokondri tepki mitokondriyal (dis) fonksiyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir mitokondriyal inhibitörleri ile tedavi üzerine ΔΨ değişimi geniş, mitokondri sağlıklı. Yerine fonksiyonunun yerinde değerlendirilmesi daha izole mitokondri kullanımı patoloji veya tedavi doğrudan organele 16-18 değişiklikleri modüle kesin kanıt sunmaktadır. Kültürlü hücrelerden mitokondri izole etmek literatürde yöntemler varken, bunlar belirsizdir 17 ve / veya özel ekipman 16 kullanmaktadır. Bu protokol detaylı izolasyon yöntem açıklanır ve birbirincil doku ve kültürler 13,14,19,20 dahil olmak üzere diğer hücre çizgileri, kolayca uyarlanabilir. Birçok izole mitokondri çalışmaları bu protokolde ama Clark elektrodu ile kullanılan aynı mitokondriyal eşleşmeyenler ve inhibitörleri tekrar ekipman çok özel ve özel parça, (21 literatürde birçok kağıtları temsili bir örnektir) kullanmaktadır. Ayrıca, bu, geleneksel bir yöntem, düşük verim ve yüksek bir karmaşıklık 22,23 gibi sınırlılıklara sahiptir ve mitokondri önemli miktarda (~ 500 ug / reaksiyon) gerektirir. Bu protokol, floresan zara algılama potansiyel sistemi TMRE standart makine birçok laboratuvarda bir floresan plaka okuyucu ile birlikte kullanılır. Bu hızlı bir şekilde hücreler ve izole mitokondri girer ve düşük konsantrasyonlarda 24 kullanılabilir çünkü TMRE yaygın olarak kabul edilmektedir. Çoklu reaksiyonlar hızla tandem kurulabilir ve toplu bu protokolü kullanılarak analiz. Ayrıca, reaksiyonin izole edilmiş bir mitokondri (~ / reaksiyon, 10 ug) &#39;in bir çok küçük bir miktar gerekmektedir. Daha az malzeme gerektiren, daha küçük doku ya da hücre kültürü numuneleri mitokondri izolasyonu için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir, daha çok kez tekrarlandı ve reaksiyon kurmak ve ATP üretimi, oksijen tüketimi, ithal gibi izole edilmiş bir mitokondri deneyleri için potansiyel olarak yeterince malzeme olabilir tahliller yapılabilir.

<table><tbody><tr><td>L-glutamik asit</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td>yerine potasyum tuzu kullanabilir.</td></tr><tr><td>malik asit</td><td>Sigma</td><td>M8304</td><td>yerine potasyum tuzu kullanabilir.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Trisma tabanı</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>100 yemek kaşığına kadar seyreltin; &#956; Etanolde çalışan bir stok olarak M ve -20&nbsp'de saklayın; &#176;C.</td></tr><tr><td>Valinomisin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>DMSO'da yapın ve 5 dakika olarak kullanın; &#956; M çalışma stoğu. -20&nbsp'de saklayın; &#176;C.</td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Mallinckrodt</td><td>6379</td><td>Etanolde konsantre bir stok yapın ve ardından suyla seyreltin&nbsp;</td></tr><tr><td>rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>Son derece toksik. Etanolden yapılmıştır.</td></tr><tr><td>oligomisin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Son derece toksik. Etanolden yapılmıştır.</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>8717-25mg</td><td>Seyreltik 100&nbsp; &#956; Kullanmadan hemen önce EB ile M stoğu.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>1x normal (yüksek glikoz).</td></tr><tr><td>Kalem / Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Fisher</td><td>SH3002101</td><td>Alikotları -20&nbsp'de saklayın; &#176; C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td>ABD menşeli, üstün kalite. Isıyı inaktive edin ve alikotları -20 ° C'de saklayın; &#176;C.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIgma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Protien Test Boyası (5x)</td> <td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Herhangi bir protein tahlili ikame edebilir.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Protein tahlili için suda 2 mg / ml stok yapın.</td></tr><tr><td>MTT tozu</td><td>Sigma</td><td>M2128</td><td>Filtre, PBS'de yapılan 5 mg / ml stoğu sterilize eder. Alikotları -20&nbsp'de saklayın; &#176; C; 4&nbsp'de saklayın; &#176; 1 haftaya kadar C.</td></tr><tr><td>Tergitol çözeltisi (NP-40)</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-1B</td><td>Gibco</td><td>PCH08014</td><td>Bir kez -20&nbsp'de mağaza alikotları açıldı; &#176; C</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TNF-alfa</td><td>Gibco</td><td>PHC3015L</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IFN-gama</td><td>Gibco</td><td>PHC4031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (-/-)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>Mg2+ ve Ca2+ iyonları içermediğinden emin olun.</td></tr><tr><td>Sitokrom c ELISA kiti</td><td>Ar-Ge </td><td>HEK-293T hücreleri için</td> D sistemleri <td>DTC0</td> İnsan.</tr></tbody></table>

İzolasyon ve kültür hücrelerinin ve fare doku gelen mitokondri fonksiyonel analizi

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Sağlıklı ve hastalık gibi iki veya daha fazla farklı grup arasında karşılaştırma, hücresel durumu belirlemek için gereklidir. Mitokondri, hem hücre metabolizması hem de enerji üretimindeki rolleri ve apoptozun kontrolü nedeniyle hücre sağlığının bağlantı noktasındadır. Bu nedenle, izole mitokondri ve mitokondriyal pertürbasyonun doğrudan değerlendirilmesi, organele özgü (dis) fonksiyonun meydana gelip gelmediğini belirleme yeteneği sunar. Bu protokolde açıklanan yöntemler, HEK kültürlenmiş hücrelerden ve fare karaciğeri ve omuriliğinden sağlam, fonksiyonel mitokondrinin izolasyonunu içerir, ancak diğer kültürlenmiş hücreler veya hayvan dokuları ile kullanım için kolayca uyarlanabilir. TMRE tarafından değerlendirilen mitokondriyal fonksiyon ve bir floresan plaka okuyucu ile birlikte ortak mitokondriyal ayrıştırıcıların ve inhibitörlerin kullanılması, bu protokolün yalnızca çok yönlü ve çoğu araştırma laboratuvarı için erişilebilir olmasını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda yüksek verim sunar.

200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi (x 3), 24-48 saat boyunca hücre ölümü aşamalı miktarlarda (Şekil 1A yol açar ). Hücre canlılığı MTT denemesi kullanarak değerlendirilmiştir ve sürekli olarak ~ 24 saat, tedaviden hücre canlılığını% 10 azalma ve 48 saat tedavi ile ~% 20'lik bir düşüş olduğunu göstermektedir edildi. Bireysel sitokinler ile benzer konsantrasyonlarda (100 ug / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ), 48 saat sonra benzer bir...

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Bu prosedürün genel amacı, solunan mitokondriyi kültürlenmiş hücrelerden veya fare dokusundan izole etmek ve daha sonra hücresel durumun bir ölçüsü olarak zar potansiyellerinin gücünü değerlendirmektir. Kültürlenmiş hücreler için bu, önce kaplamanın ve ardından hücrelerin işlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, hücreler homojenize edilir ve homojenat, mitokondriyi hücrelerden daha fazla serbest bırakmak için bir iğneden geçirilir.Fare dokusu için, karaciğer fareden eksize edilir ve daha sonra her iki tür başlangıç materyali ile buz üzerinde homojenize edilir. Diferansiyel santrifüjleme daha sonra mitokondriyi hücresel içeriğin geri kalanından izole etmek için kullanılır. Mitokondri, membran potansiyeline duyarlı floresan boyanın eklenmesi de dahil olmak üzere bazı işlemlere tabi tutulduktan sonra, membran potansiyelinin gücünü hesaplamak için TMRE floresan ölçümleri yapılır.Sonuç olarak, mitokondriyal fonksiyon ve mitokondriyal membran potansiyelindeki bozulmalar, bir floresan plaka okuyucu ile birlikte membran potansiyeline duyarlı bir floresan boya kullanılarak değerlendirilebilir. Kuplörler ve inhibitörler üzerinde ortak mitokondriyal ile tedavi edildiğinde, bu yöntem sitokin kaynaklı apoptoz ve mitokondri disfonksiyonu hakkında fikir verebilse de, bir LS.It iki veya daha fazla farklı numune arasında karşılaştırma yapılan başka herhangi bir sisteme de uygulanabilir. sağlıklı hastalıklara karşı veya farklı metabolik hızlara sahip iki farklı hayvan türü. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Mitokondri izolasyon adımlarını öğrenmek zor olduğu için.Bunun nedeni, tekniği uygularken geleneksel yöntem bölümlerinde gözden kaçabilecek birçok nüansın olmasıdır. Bu prosedüre, sitokin tedavi plakasından 48 saat önce metin protokolünde tarif edildiği gibi büyüyen insan embriyonik böbrek hücreleri ile başlayın, 160.000 hücreyi bir T 1 75 şişesine yerleştirin ve tedavi sırasında yaklaşık% 70 yoğunluk elde edin. Daha sonra serum, 24 saat sonra ortamı aspire ederek ve aynı hacimde serum içermeyen ortamla değiştirerek hücreleri aç bırakın.Son olarak, mitokondrinin izolasyonunu gerçekleştirmek için serum aç hücrelerini, çözünmüş sitokinlerin doğrudan hücre kültürü ortamına eklenmesiyle tedavi edin. Önce ortamı aspire edin ve yapışma hücrelerini 15 mililitre bir x fosfat tamponlu salin veya PBS ile iki kez yıkayın. Yıkamadan sonra her seferinde tamponu aspire edin ve yapışan hücreleri alttan çıkarmak için şişeyi kazıyın.Daha sonra her şişeye 15 mililitre bir XPBS ekleyin, döndürün ve buz üzerinde ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Kazıma yapıldıktan sonra, santrifüjleme, aspirasyon süpernatanları ve resüsü takiben sallanan bir kova rotorlu bir masa üstü santrifüj kullanarak, tüpleri 700 kez G dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Her peleti bir mililitre mitokondriyal izolasyon tamponunda askıya alın.Daha sonra, her iki süspansiyonu birleştirin ve mitokondride homojenizasyon için küçük bir cam kaba aktarın yeniden askıya alındı ve mitokondriyal izolasyon tamponu, çözelti ilk hatta ulaşana kadar cam kaba aktarın Havaneli bir matkaba bağlıyken, hücreleri buz üzerinde orta hızda üç geçiş boyunca homojenize etmeye devam edin. Havaneli solüsyona yerleştirirken hava kabarcıklarının giderilmesine, havaneli sıvının üzerine çıkarılmamasına ve sürekli geçişlerle sabit bir hız kullanılmasına özen gösterilmelidir. Homojenize çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Daha sonra çözeltiyi 18 gauge kullanarak üç mililitrelik bir şırıngaya çekin, bir yarım inçlik iğne ve 27 gauge bir yarım inçlik iğne ile buz üzerindeki konik tüpe geri atın. Hücre zarının bozulması için bu kuvveti kullanmak için çözeltiyi tüpün iç duvarına doğru dışarı atmaya dikkat edin. Şırınga adımlarını toplam beş kez tekrarlayın, ardından çözeltiyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sallanan bir kova rotoru kullanarak bir masa üstü santrifüjde 600 kez G dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.Mitokondri, bu ilk düşük hızlı dönüşten sonra süpernatantın içindedir, bazı zarlar ve kırılmamış hücreler peletlenirken, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve üç adet 1.5 mililitrelik tüp arasında dağıtın. Daha sonra üç tüpü sabit açılı bir rotorda 10.000 kez G'de beş dakika boyunca dört santigrat derece santrifüjleyin. Kültürlenmiş hücrelerden gelen mitokondri beyazımsı renkte görünür.Karaciğeri her hayvandan çıkarın ve kanı durulamak için buz gibi, kalsiyum veya magnezyum içermeyen bir XPBS yerleştirin. Karaciğer dokusunu buz üzerinde uzaktaki bir tabağa aktarın ve bir dakika boyunca taze bir tıraş bıçağı kullanarak ince parçalar halinde doğrayın. Daha sonra, tampon ilk satıra ulaşana kadar damara doku ve uygun tamponu ekleyin.Beş geçiş boyunca havaneli ile buz üzerindeki dokuyu elle homojenize etmeye devam edin. Havaneli solüsyona yerleştirirken hava kabarcıklarının giderilmesine, havaneli sıvının üzerine çıkarılmamasına ve sürekli geçişlerle sabit bir hız kullanılmasına özen gösterilmelidir. Metin protokolünde istendiği gibi numuneleri santrifüjleme ve homojenizasyon ile işlemeye devam edin.Yeni süpernatanları her numuneden ilk süpernatant ile birleştirdikten sonra, tüpleri beş dakika boyunca 10.000 kez G dört santigrat derecede sabit açılı bir rotorda santrifüjleyin. Bir pipet ucu kullanarak ve / veya tüpün kenarlarına doğru iterek üstteki beyaz kabarık tabakayı dikkatlice aspire edin. Sonra süpernatantın geri kalanını yavaşça dökün ve resüsleyin.Karaciğer mitokondri peletlerini 500 mikrolitre mitokondriyal izolasyonda askıya alın. Karaciğerden gelen tampon mitokondri kahverengidir. Reaksiyonlar başlamadan hemen önce numuneleri hızlı bir şekilde buzun üzerine yerleştirin.Mitokondriyi mililitre başına 0,5 miligrama seyreltin. Deneysel tampon ile çalışma konsantrasyonu. Tüpleri, seyreltilmiş mitokondrinin toplam hacmi olan 10'da bir oranında ayırmak için metin protokolünde listelendiği gibi uygun tedavileri ekleyin.Daha sonra, seyreltilmiş mitokondriyi her bir reaksiyon tüpüne yerleştirin ve uygun karışımı sağlamak için her tüpü hafifçe çalkalayın. Reaksiyonları tezgah üzerinde yedi dakika inkübe edin. Daha sonra mitokondriyal reaksiyon hacmine eşit miktarda iki mikromolar tetraetil, çubuk domin, etil ester, kısaltılmış TMRE ekleyin.Yine, uygun karışımı sağlamak için her bir tüpü hafifçe çalkalayın. Reaksiyonları tezgah üzerinde yedi dakika daha inkübe ettikten sonra, mitokondriyi beş dakika boyunca 10.000 kez G dört santigrat derecede sabit açılı bir rotorda santrifüjleme yoluyla peletleyin. Daha sonra her bir numunenin süpernatan hacminin yarısını 3 84 üzerine yükleyin.Kuyu plakası, numunelerin floresansını okumaya devam edin ve daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi kontrol ile her tedavi arasındaki floresan katlama farkını hesaplayın: HEK 2 93 T hücrelerinin TNF, alfa, IL, bir beta ve IFN gama ile 24 ila 48 saat boyunca tedavisi, ilerleyici miktarlarda hücre ölümüne yol açar. Hücre canlılığı, 24 saatlik tedavi ile hücre canlılığında yaklaşık% 10'luk bir azalma ve yaklaşık% 20'lik bir azalma olduğunu tutarlı bir şekilde gösteren MTT testleri kullanılarak değerlendirildi. 48 saatlik tedavi ile benzer konsantrasyonlarda muamele edilen hücreler, 48 saatte benzer hücre ölümü sonuçları verir.Ve bireysel sitokinlerle tedavi, canlılıktaki azalmanın kombinatoryal etkilerden kaynaklandığını ortaya koymaktadır. Canlılık verileri, üç ayrı deneyin ortalama standart sapmasını temsil eder. Her çalıştırma üç nüsha halinde ve hata çubuklarının sıkılığı, verilerin tekrarlanabilirliğini gösterir.Sitokin ile tedavi edilen hücrelerden izole edilen mitokondrideki zar potansiyelindeki yüzde azalma, mitokondriyal sağlığın sitokin tedavilerinden etkilendiğini gösterir ve bu prosedürü takiben canlılık verilerini doğrular. Farklı numuneler arasında hangi enerji ve solunum farklılıklarının olduğu gibi ek soruları değerlendirmek için bir TP üretiminin, toplam bir TP'nin veya oksijen tüketiminin değerlendirilmesi gibi diğer yöntemler oluşturulabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sağlam fonksiyonel mitokondriyi nasıl izole edeceğinizi iyi anlamalı ve hücresel durumun bir yansıması olarak zar potansiyellerinin gücünü değerlendirmelisiniz.

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano...

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla &lt;30 dk.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Mitokondri ile ilgili biyoenerjetik ve metabolomik çalışmalar, mitokondrilerin birçok hastalıkta çok yönlü rolünü ortaya koymuştur, ancak bu organeller için izolasyon yöntemleri farklılık göstermektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, yüksek kaliteli mitokondriyi birden fazla doku kaynağından saflaştırma yeteneğine sahiptir. Kalite, solunum kontrol oranları ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilen diğer metriklerle belirlenir.

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon 

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH'lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Biz maya mitokondri arıtma için hızlı ve etkili bir yöntem...

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Bu videoya kaydedilmiş protokol stereomicroscope altında erişkin fareden dentat girus kaldırılması için diseksiyon tekniği gösterildi.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

Öğrenin, hücre kültürleri ve fare dokusundan solunum yapan mitokondri izolasyonunu ve TMRE boyası ile membran potansiyeli ölçümünü. Bu yöntem, hücresel sağlık ve mitokondriyal fonksiyon bozukluklarını değerlendirmede araştırmacılara güvenilir bir protokol sunar.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Daha fazla video keşfet