Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması
June 30th, 2023
Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.
Araştırma programımız, özellikle yaşlanmaya bağlı işlev bozukluğu ile ilgili olarak mitokondrinin yapısal ve işlevsel yönlerine odaklanmaktadır. Bu amaçla, mitokondriyal yaşlanmanın temel mekanizmalarını keşfetmek ve mitokondriyal sağlığı korumak ve eski haline getirmek için terapötik müdahaleler geliştirmek için çok çeşitli biyofiziksel, biyokimyasal ve yapısal teknikler kullanıyoruz. Mitokondriyal fonksiyon ve yapı ayrılmaz bir şekilde ilişkilidir.
Standart ışık mikroskobu teknikleri, temel morfoloji ve ağ yapıları gibi büyük ölçekli mitokondriyal özellikleri ölçmek için uygundur. Geleneksel optik mikroskopi tarafından sağlanandan daha yüksek çözünürlük gerektiren mitokondriyal ultra yapı veya özelliklerin analizi, tipik olarak sabit numuneler üzerinde elektron mikroskobu veya tomografi kullanılarak yapılır. Süper çözünürlüklü mikroskopi, kırınım sınırının ötesindeki özellikleri ölçen floresan tabanlı bir görüntüleme tekniğidir.
Mitokondri için bu, nano ölçekli protein dağılımı ve cristae mimarisinin ölçümlerini içerir. Burada açıklanan sabit görüntüleme protokolü, araştırmacıların canlı hücrelerdeki iç zarın ayrıntılı yapısını ölçmelerine olanak tanır. Canlı hücre görüntüleme, numune fiksasyonuna gerek kalmadan fizyolojik olarak ilgili koşullar altında cristae'nin karmaşık özelliklerini gözlemlememize ve kantitatif olarak analiz etmemize olanak tanır.
Bu, araştırmacılara ultra yapısal özelliklerde meydana gelen dinamik değişiklikler ve bunların stresörlere ve farmakolojik bileşiklere zamansal tepkileri hakkında yeni bilgiler verecektir.
Genel Bakış
Bu çalışma, SH-SY5Y hücreleri ve primer sıçan hipokampal nöronlarının çoğaltılması, farklılaşması ve boyanması için bir protokol sunmaktadır. Amaç, uyarılan emisyon tükenmesi (STED) mikroskobisini kullanarak mitokondriyal ultrayapıyı görselleştirmek ve analiz etmek ve canlı hücrelerde mitokondri yapısal dinamiklerine dair bilgiler sağlamaktır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Mitokondri Araştırmaları
Arka Plan
- Mitokondrinin yapısı ve işlevi hücre sağlığı için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel mikroskopi, ultrayapısal analiz için çözünürlükte sınırlıdır.
- Süper çözünürlüklü mikroskopi, mitokondri özelliklerinin daha ayrıntılı görüntülemesine olanak tanır.
- Mitokondri değişikliklerini anlamak, yaşlanma ve işlev bozukluğu hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücrelerde mitokondriyal ultrayapıyı incelemek için güvenilir bir yöntem kurmak.
- Araştırmacıların mitokondriyal morfolojideki dinamik değişiklikleri analiz etmelerini sağlamak.
- Çeşitli tedavilere karşı mitokondriyal tepkileri araştırmak için bir temel sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin kültürü ve farklılaşması.
- Primer sıçan hipokampal nöronlarının hazırlanması.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için STED mikroskobisinin kullanılması.
- Ana adımlar arasında hücrenin çözülmesi, kapak sürgülerinin kaplanması ve PKMO ile boyama bulunmaktadır.
- Özel yazılım ve eklentileri kullanarak görüntü elde edilmesi ve analizi.
Ana Sonuçlar
- Nano ölçekte çözünürlükte mitokondriyal yapıların başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Mitokondri içindeki krista mimarisine ve protein dağılımına ilişkin bilgiler.
- Fizyolojik koşullar altında mitokondriyal özelliklerdeki değişikliklerin nicel analizi.
- Farmakolojik bileşiklere karşı mitokondri tepkisi ile ilgili potansiyel olarak önemli bulgular.
Sonuçlar
- Çalışma, canlı hücrelerde mitokondriyal dinamiğini araştırmak için değerli bir teknik göstermiştir.
- Hücresel yaşlanma ve sağlıktaki mitokondri rolünü anlamaya katkıda bulunur.
- Mitokondri fonksiyonunu geri kazanmaya yönelik terapötik müdahaleler için çıkarımlar.
