Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Emery L. Ng; Ashley L. Reed; Christopher B. O&#8217;Connell; Nathan N. Alder

doi:10.3791/65561

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Full Text

4,768 Views

08:48 min

June 30, 2023

DOI: 10.3791/65561-v

Emery L. Ng¹, Ashley L. Reed², Christopher B. O’Connell¹, Nathan N. Alder²

¹Center for Open Research Resources and Equipment,University of Connecticut, ²Department of Molecular and Cell Biology,University of Connecticut

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for the propagation, differentiation, and staining of SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons. The aim is to visualize and analyze mitochondrial ultrastructure using stimulated emission depletion (STED) microscopy, providing insights into the structural dynamics of mitochondria in living cells.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Mitochondrial Research

Background

Mitochondria's structure and function are crucial for cellular health.
Traditional microscopy is limited in resolution for ultrastructural analysis.
Super resolution microscopy allows for more detailed imaging of mitochondrial features.
Understanding mitochondrial changes can provide insights into aging and dysfunction.

Purpose of Study

To establish a reliable method for studying mitochondrial ultrastructure in live cells.
To enable researchers to analyze dynamic changes in mitochondrial morphology.
To provide a foundation for investigating mitochondrial responses to various treatments.

Methods Used

Cell culture and differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells.
Preparation of primary rat hippocampal neurons.
Utilization of STED microscopy for high-resolution imaging.
Key steps include cell thawing, coating cover slips, and staining with PKMO.
Image acquisition and analysis through specific software and plugins.

Main Results

Successful visualization of mitochondrial structures at nanoscale resolution.
Insights into cristae architecture and protein distribution within mitochondria.
Quantitative analysis of changes in mitochondrial features under physiological conditions.
Potentially significant findings regarding the response of mitochondria to pharmacological compounds.

Conclusions

The study demonstrates a valuable technique for investigating mitochondrial dynamics in living cells.
Contributes to understanding the role of mitochondria in cellular aging and health.
Implications for therapeutic interventions aimed at restoring mitochondrial function.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using SH-SY5Y cells in this study?

SH-SY5Y cells are a well-established model for neuronal studies, providing a suitable environment for differentiating and examining mitochondrial dynamics.

How are the primary rat hippocampal neurons prepared for imaging?

They are cultured and treated with specific media conditions to promote healthy differentiation and later imaged using the STED microscopy technique.

What types of data can STED microscopy provide?

STED microscopy allows for the visualization of mitochondrial ultrastructure and detailed analysis of protein localization within the inner mitochondrial membrane.

Can the methodology be adapted for other cell types?

Yes, the protocol can be adapted to other neuronal or non-neuronal cell types interested in studying mitochondrial morphology.

What limitations are associated with this imaging technique?

STED microscopy requires specific preparation and can be technically challenging, necessitating precise calibration of equipment for optimal results.

Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.

Araştırma programımız, özellikle yaşlanmaya bağlı işlev bozukluğu ile ilgili olarak mitokondrinin yapısal ve işlevsel yönlerine odaklanmaktadır. Bu amaçla, mitokondriyal yaşlanmanın temel mekanizmalarını keşfetmek ve mitokondriyal sağlığı korumak ve eski haline getirmek için terapötik müdahaleler geliştirmek için çok çeşitli biyofiziksel, biyokimyasal ve yapısal teknikler kullanıyoruz. Mitokondriyal fonksiyon ve yapı ayrılmaz bir şekilde ilişkilidir.

Standart ışık mikroskobu teknikleri, temel morfoloji ve ağ yapıları gibi büyük ölçekli mitokondriyal özellikleri ölçmek için uygundur. Geleneksel optik mikroskopi tarafından sağlanandan daha yüksek çözünürlük gerektiren mitokondriyal ultra yapı veya özelliklerin analizi, tipik olarak sabit numuneler üzerinde elektron mikroskobu veya tomografi kullanılarak yapılır. Süper çözünürlüklü mikroskopi, kırınım sınırının ötesindeki özellikleri ölçen floresan tabanlı bir görüntüleme tekniğidir.

Mitokondri için bu, nano ölçekli protein dağılımı ve cristae mimarisinin ölçümlerini içerir. Burada açıklanan sabit görüntüleme protokolü, araştırmacıların canlı hücrelerdeki iç zarın ayrıntılı yapısını ölçmelerine olanak tanır. Canlı hücre görüntüleme, numune fiksasyonuna gerek kalmadan fizyolojik olarak ilgili koşullar altında cristae'nin karmaşık özelliklerini gözlemlememize ve kantitatif olarak analiz etmemize olanak tanır.

Bu, araştırmacılara ultra yapısal özelliklerde meydana gelen dinamik değişiklikler ve bunların stresörlere ve farmakolojik bileşiklere zamansal tepkileri hakkında yeni bilgiler verecektir.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos