Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

60 milyondan fazla kişi, AIDS'e neden olan virüs olan HIV ile enfekte olmuştur. HIV AIDS küresel bir sağlık krizidir ve yoğun araştırma çabaları onlara enfekte bireylerin hayatlarını önemli ölçüde ödünç vermiş olsa da, gerçek bir aşı hala belirsizliğini koruyor. HIV aşısı araştırmalarının ana odak noktası, HIV'in hedef hücrelere girmek için kullandığı zarf glikoproteinidir.

Bu videoda, kriyo-elektron tomografisi adı verilen bir görüntüleme tekniği kullanarak bu önemli proteinin yapılarını nasıl elde ettiğimizi gösteriyoruz. Saflaştırılmış HIV ile başlayarak, donmuş örneklerin hazırlanmasındaki adımları, bu donmuş örneklerden elektron mikroskobik görüntülerin kaydedilmesindeki aşamaları ve bu görüntülerin HIV AIDS aşı tasarımı için yararlı olabilecek yapısal modellere dönüştürülmesindeki adımları gösteriyoruz. Bu videoda sunduğumuzun benzersiz bir yönü, çalışmanın ortaokul ve lise öğrencilerinden üniversite ve yüksek lisans düzeyindeki öğrencilere, doktora sonrası bursiyerlere ve kıdemli bilim insanlarına kadar geniş bir yaş yelpazesini kapsayan laboratuvarının üyeleri tarafından gösterilecek olmasıdır.

Kriyo-elektron tomografisine uygun vitrifiye virüs örneklerinin hazırlanması, bakır bir ızgara tarafından desteklenen bir karbon filmdeki küçük deliklere sulu bir virüs süspansiyonunun yayılması ve ardından virüslerin hızla dondurulmasıyla gerçekleştirilir. Bu adımın amacı, neredeyse doğal bir durumda yakalanan bozulmamış virüslerin donmuş bir örneğini hazırlamaktır. Başlamak için, ızgaralar bir kızdırma deşarj ünitesinin içine yerleştirilir.

Bu cihaz, ızgaraları iyonize gaza maruz bırakarak temizler. Artık ızgaralar kullanıma hazır olduğuna göre, küçük altın parçacıkları ile karıştırılmış bir virüs süspansiyonu hazırlanır. Bu parçacıklar veri toplama ve işleme için gereklidir.

Daha sonra, yeni plazma ile temizlenmiş ızgaraya bir damla virüs süspansiyonu yerleştirilir. Izgara daha sonra bir robota yüklenir, bu da onu filtre kağıdı ile lekeleyerek damlayı ince bir sıvı tabakasına indirger. Numune daha sonra virüsleri saniyede 100.000 kelvin'i aşan bir oranda hızla donduran sıvı etan içine daldırılır.

Daldırmalı donmuş ızgara daha sonra mikroskoba taşınmak üzere bir saklama kutusuna aktarılır. Bu, istenen sayıda ızgara donana kadar tekrarlanır. Artık virüs örnek ızgaraları hazır olduğuna göre, bir sonraki adım onları mikroskoba yüklemektir.

Görüntüleme için bu manuel olarak veya robotik yardım ile yapılabilir. Numune ızgaraları manuel olarak yüklendiğinde, kullanıcı, numunelerin sıvı nitrojen altında manipüle edilebildiği özel bir istasyonda oturur, numuneler, sızdırmaz hale getirilen, boşaltılan ve daha sonra mikroskoba bağlanan portatif bir nitrojen soğutmalı odaya yerleştirilir. Daha yeni mikroskoplar daha otomatik numune yükleme yeteneğine sahiptir.

Burada bir Titan Cryos mikroskobunda, donmuş numuneler kullanıcı tarafından mikroskoba iletilir ve daha sonra mikroskoba yüklenen numune ızgaraları ile robotik olarak yüklenir. Görüntüleme başlamadan önce her ızgara kullanıcı tarafından incelenebilir. Mikroskop parametreleri, numune ızgarası üzerinde ilgilenilen özelliklere sahip her alan için ayarlanır.

Bu durumda, özellikler HIV virüsleridir. Her yeni alan tanımlandıkça, mikroskop bilgisayarı alana özgü görüntüleme parametrelerini saklar. Kullanıcı ilgilendiği tüm pozisyonları tanımladığında, bilgisayar her pozisyonu otomatik olarak yeniden ziyaret eder ve bir veri seti toplar.

Her veri seti, örnek ızgaranın elektron demetine göre eğilmesiyle toplanırken, ışının ızgara üzerinde aynı noktada odaklanmış kalmasını sağlar. Elektron mikroskobunda veri toplama, geleneksel olarak kullanıcıların mikroskopta oturmasını ve ekipmanla fiziksel olarak etkileşime girmesini gerektirmiştir. Bu tarz bir mikroskop etkileşimi, Başkan Obama'nın bir istihbarat fabrikasına yaptığı ziyaret sırasında burada gösterilmektedir.

Mikroskop bilgisayar arayüzlerindeki son gelişmeler artık kullanıcıların laboratuvardaki veya başka bir yerdeki uzak bir bilgisayardan veri toplamayı gerçek zamanlı olarak izlemesine ve ayarlamasına olanak tanır. Zarfın şekillerini görselleştirmek için, glikoprotein sivri uçları, sinyali artırmak için yüzlerce ayrı görüntüden gelen bilgilerin ortalamasının alınması gerekir. Bu, burada Bio Wolf adı verilen bir bilgisayar kümesi kullanılarak gerçekleştirilen hesaplama açısından yoğun bir işlemdir.

NIH'de bulunan, yüksek gürültü seviyelerinde çalışabilen algoritmalar kullanarak bireysel hacimleri çıkarmak ve bilgilerin ortalamasını almak için güçlü yöntemler geliştirilmiştir. Bu tür verilere özgü olarak, hem yerli virüslerden hem de biyolojik olarak önemli moleküllere karmaşık virüslerden elde edilen yoğunluk haritaları, HIV'in yapısal biyolojisi hakkında zengin bir bilgi veritabanı sağlar. Yoğunluk haritaları, veriler, zarf glikoprotein spike'ını oluşturan tek tek alt birimlerin x-ışını kristalografisinden elde edilen bilgilerle birleştirildiğinde moleküler ayrıntılarda canlanır.

Bu tomoslardan çıkan veriler çok yoğun ve zorlu olabilir, eğlence endüstrisi için yazılım interpret. 3D, renkler, dokular ve aydınlatma ekleyerek 3D modelleri görselleştirmek için kullanılabilir ve bu da analiz edilmesini kolaylaştırır. Yaygın olarak kullanılan görselleştirme yazılımı bir Mirror, 3D, Studio, Max ve Maya içerir.

Zarfın yapısı için moleküler modellerin nasıl elde edilebileceğine dair adım adım prosedürleri gösterdik. Saflaştırılmış HIV'den başlayarak glikoprotein. Bu yöntemi kullanarak, virüsü bağlayabilen ve kullanabilen çeşitli moleküllerle kompleks halinde zarf glikoproteini için yapılar da belirledik.

Burada, B12 adı verilen bir antikor ile kompleks halinde zarf glikoproteininin yapısı için bir örnek gösteriyoruz. Bazı moleküllerin virüsü bağlayıp kullanabildiğini, bazılarının ise kullanamadığını anlamak, akılcı aşı tasarımı için çok önemlidir. HIV'den veya influenza ve Ebola gibi diğer virüslerden zarf glikoproteinlerinin moleküler yapılarının belirlenmesi, viral girişi ve kullanımını anlamanın anahtarıdır.

Gördüğünüz gibi, kriyo-elektron tomografisi şimdi bu hedefe ulaşmak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkıyor.