Murin Dorsal Kök Gangliyonları ve Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Ko-kültür Modelinin Oluşturulması: Perinöral Kanser Hücre İstilasını İncelemek İçin Bir İn Vitro Model

Perinöral invazyon veya PNI, kanser hücrelerinin sinirler boyunca göçünü ve daha sonra kanser büyümesi ve metastazı için uygun bir mikro ortam olan perinöryuma istilasını ifade eder.

PNI'yi in vitro olarak taklit etmek için, bir yarım küre şeklini alacak şekilde bir kültür kabına bir damla hücre dışı matris veya ECM süspansiyonu ekleyerek başlayın. Şimdi, 3D iskelenin yapısal ve işlevsel özelliklerini güçlendirmek için kültür kabını inkübe edin.

Daha sonra, yarı katı ECM damlacığının merkezine önceden hasat edilmiş bir dorsal kök ganglionu veya bir duyusal nöron kümesi olan DRG'yi dikkatlice yerleştirin. DRG'yi ECM damlacığı içine gömmek için inkübe edin.

Daha sonra uygun bir büyüme ortamı ekleyin ve inkübe edin. Besin takviyesi ECM, DRG'nin, damlacığın çevresine doğru radyal olarak büyüyen nörit adı verilen küçük sinir çıkıntılarına filizlenmesini destekler.

ECM damlacığını sonraki tahlil için hazırlamak için harcanan ortamı çıkarın. Tohum, damlacık üzerine floresan olarak boyanmış yapışkan kanser hücreleri. Yarım küre şeklindeki şekli nedeniyle, kanser hücreleri yuvarlanır ve damlacık çevresi boyunca yerleşir.

Kanser hücresi-nörit etkileşimine izin vermek için kültür kabını inkübe edin. Floresan mikroskobu altında bakıldığında, kanser hücrelerinin nöritlerin yanında takip ettiği ve DRG'ye doğru göç ettiği görülebilir, bu da perinöral istilayı doğrular.

Yarı katı matris damlacıklarını hazırlamak için, bir cam kuyu tabanlı plakayı buzdan çalışma mikroskobu altında bir buz bloğuna aktarın. En fazla 10 mikrolitrelik bir pipetin ucunu 45 derecelik bir açıyla doğrudan camın üzerine yerleştirin ve 1,5 mikrolitrelik bir matris damlacığını camın üzerine dikkatlice dağıtın. Matris plakaya geçerken pipet ucunu yavaşça camdan uzaklaştırın.

Plakanın dört köşesinin her birine bir damla matris bırakın ve plakayı yaklaşık 1 dakika boyunca oda sıcaklığındaki bir yüzeye aktarın. Matris hafifçe sertleştiğinde, plakayı buz bloğuna geri koyun ve DRG'yi sol elinizle nazikçe almak için kapalı mikroskobik forseps kullanın.

Sağ elinizi kullanarak, sinir dokusunu dikkatlice 21G'lik bir iğnenin ucuna aktarın ve DRG'yi matris damlacığının ortasına nazikçe yerleştirmek için iğneyi kullanın. DRG, iğne ile merkezi konumlandırma için matrisin içine kolayca salınmalıdır.

Dört damlacığın her birine bir DRG parçası yerleştirdikten sonra, plakayı 3 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. DRG'nin tamamı gömüldüğünde, plakaları birer birer hafif bir açıyla tutun ve plakalara% 10 FBS ile desteklenmiş 4 mililitre DMEM'i yavaşça ekleyin, böylece ortam matris-DRG birimleriyle yalnızca kademeli olarak temas eder.

Plakaları 48 ila 72 saat daha inkübatöre geri koyun. Nöritler matrisin kenarına kadar olan yolun en az% 75'ine ulaştığında, matris-DRG birimlerini çıkarmadan ortamı kuyulardan aspire edin. Daha sonra, düzgün bir tetiğe sahip 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, her bir matris DRG testinin üzerine mililitre ortam başına 3 kez 10 ila beşinci hücreye iki damla yerleştirin ve plakaları inkübatöre geri koyun. Bir saat sonra, cam tabanlı plakanın yan duvarı boyunca% 10 FBS ile 4 mililitre DMEM ekleyin ve plakaları bir sonraki mikroskobik değerlendirmeye kadar inkübatöre geri koyun.