Name: Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Öğrenin inositol pirofosfatların üretimi ve saflaştırılması için enzimatik reaksiyon ve jel elektroforezi yöntemlerini. Bu protokol IP7 izolasyonu ve biyolojik aktivite analizi için güvenilir bir yöntem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A. Riccio yararlı yorumlar için teşekkür ediyor ve el yazması okumak için. Bu çalışma Hücre Biyolojisi Birimi Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) finansman ve İnsan Frontier Bilim Programı Hibe (RGP0048/2009-C) tarafından desteklenmiştir.

1. Enzimatik Reaksiyon - 1. gün (öğleden sonra 1 saat) <ol><li> IP 6 K1 veya VIP1 pyrophosphorylated izoformları IP 6 dönüştürmek 10-20 bağımsız enzimatik reaksiyonları hazırlamak için ilk adım. </li><li> E. gelen arıtılmış Onun IP 6 K1 ve GST-Vip1 enzimler coli protokole göre, daha önce açıklanan 17,18. </li><li> 1X reaksiyon tamponu (pH 6,8 30 mM HEPES, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM phosphocreatine (PCr), 25 U / ml CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg içeren 50 mcL reaksiyonlar hazırlayın tuz), 0.3 mM IP6, 0.05-0.1 mg Onun IP 6 K1 veya GST-Vip1. MiliQ GKD 2 O. ile ses seviyesini ayarlayın </li><li> Kısaca 37 reaksiyon ve inkübe ° C gecede rotasyon ile dönerler. </li></ol> 2. Poliakrilamid jel döküm ve yükleme günlük 2 (öğleden sonra 4 saat) <ol><li> Poliakrilamid jel, 24 cm uzunluğunda, 18 cm genişliğinde cam plakalar ve 1.5 mm genişliğinde ayırıcılar kullanılarak hazırlanmıştır. Genellikle 16 şeritli veya preparatif tek şeritli tarak kullanılır. </li><li> % 35.5 (w / v) Akrilamid:: Bis-Akrilamid 19:01, 1X Tris / Borat / EDTA (TBE),% 0,05 (w / v) amonyum persülfat (APS aşağıdaki maddeleri içeren bir karışımı (50 ml / jel) hazırlayın ) 0.05% (w / v) Temed. Ön-döküm cam plakalar arasındaki karışımı dökün tarak yerleştirin ve 30-60 dakika oda sıcaklığında polimerize izin. </li><li> Jel polimerize sonra, soğuk oda cihazın transferi ve 200-300 Volt 30-60 dakika için 1X TBE önceden çalıştırın. </li><li> Her reaksiyon OrangeG boya 1X (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA,% 30 gliserol,% 0,1 OrangeG) ekleyin. Standart bir kontrol olarak yüklemek için IP 6 2 nmol içeren bir örnek hazırlayın. </li><li> Herhangi bir çökelti kaldırmak için bir şırınga ve bir 21G iğne kullanarak tampon çalışan her bir kuyunun iyice yıkayın, sonra jel yükleyin. Yan kuyu yükleme kaçının. </li><li> OrangeG boya grubu, son 10 cm içerisinde jel alttan kadar, 450-550 Volt (7 mAmp / jel) geceleme jel çalıştırın. </li></ol> 3. IP 7 İzolasyon - 3. gün (4 saat) ve günde 4 (6-7 saat SpeedVac kurutma işlemi) <ol><li> Jel aygıtı sökün ve bir cam levha diğeri jel bırakarak dikkatlice kaldırın. Şekil 1'de gösterildiği gibi alt IP 6 standart ve bir örnek şerit içeren jel OrangeG boya bant üzerinde sadece küçük bir kısmı, kesin. </li><li> Lekelere kesme Toluidine Blue (% 0,1 (w / v)% 20 (w / v) metanol, toluidin mavi,% 2 (w / v) gliserol) ile bir kaç dakika jel bölümü (1-3 dk) veya inositol pirofosfat grubu görünene kadar. Daha önce boyanmamış jel kurumasını önlemek için jel üstünde kaldırıldı cam plaka koyun. </li></ol> IP 7 bant IP 6 standart biraz daha yavaş çalışır görünür olmalıdır. ATP, IP 6 daha hızlı çalışır, aynı zamanda görünür olmalıdır (Şekil 1). Transfer jel lekeli kısmı birkaç dakika için de boyama solüsyonu (% 20 (w / v) metanol), Toluidine Blue herhangi bir aşırı yıkayacak ve lekesiz bir jel ile jel yeniden konumlandırmak. Yüksek pyrophosphorylated inositol izoformları (IP 8 ve IP 9) görselleştirme gerekiyorsa, oda sıcaklığında 20 dakika Toluidine Blue boyama solüsyonu ile jel leke. Daha sonra, yaklaşık 15 dakika için de boyama çözüm Toluidine Blue yıkayın. <ol start="3"><li> Bir jilet boyanan jel (Şekil 1) ile belirlenen IP 7 göçmen konumu referans olarak kullanarak jel lekesiz bir kısmı IP 7 bant kesilmiş . </li><li> IP 7 band 15 ml tüp jel kesilen koyun ve MilliQ GKD 2 O. 10 ml Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle dönüşümlü olarak tüpler koyun. TBE ve mikroskopik akrilamid parçacıkların aşırı kaldırmak için sıvı atın. </li><li> Daha sonra, iki dehidratasyon hidrasyon döngüleri gerçekleştirin. IP 7 içeren jel ile tüpe 5 ml% 50 (w / v) metanol ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında döndürmek. MilliQ GKD 2 O 5 ml içeren yeni bir 15 ml tüp jel dilim transferi ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında döndürmek. Tüplerinden metanol ve MilliQ H 2 O atmayın. Önceden kullanılan 15 ml tüpler yeniden transfer poliakrilamid jel dehidratasyon hidrasyon döngüsü bir kez daha tekrarlayın. Yıkar biri gece boyunca yapılabilir. </li><li> Yıkandı, IP 7 konsantre için 60 ısıtılmış bir SpeedVac ° C ile birlikte 10 ml (5 ml MilliQddH 2 O ve 5 ml% 50 (w / v) metanol), kuru </li><li> Örneklerin neredeyse kuru sonra kalan sıvı (300-600 ul), ± 1.5 ml santrifüj tüp ve 5000 rpm'de 2 dakika spin aktarın. </li><li> 1,5 mL taze bir santrifüj tüpü içine supernatant ve transfer toplayın; terkalt 20-30 mcL akrilamid parçacıklar içerebilir. </li><li> Gerekirse bir ısıtmasız SpeedVac kullanarak kurutma işlemi devam etmektedir. Örnekleri hacmi 100-300 mcL ulaştığınızda örnekleri tamamen kurumasını, IP 7 kurtarma önemli ölçüde azalır, bu nedenle kurutma işlemi sona erdirmek. </li></ol> 4. IP 7 konsantrasyonu ve saflık tayini. <ol><li> Bölüm 2.2-2.5 benzer, 2-5 PAGE jel üzerinde çalıştırmak için kurtarılan IP 7 örnek mcL kullanın. , Konsantrasyon standart ve 4 Poly-P marker nmol olarak 6 IP birkaç dilüsyonları (yani 0.5, 1, 2, 4 nmol) yükleyin . Jel çalıştırdıktan sonra, Bölüm 3.2 (Şekil 2A) açıklanan prosedürü izleyerek, boyama ve Toluidine Blue çözüm ile de boyama tüm jel inositol pirofosfat izoformları görselleştirmek. </li><li> Toluidine boyama sonra, konsantrasyonları Şekil 2B gösterildiği gibi, jel, tarama ve IP 6 ve 7 IP arasında yoğunluk farklılıkları karşılaştırarak, Resim-J gibi görüntüleme yazılımı kullanarak tespit edilebilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: IP 6 K1 ve VIP1 enzimler kullanarak IP 7 IP 6 hazırlık enzimatik dönüşüm PAGE analizi (Şekil 1) kullanarak kolayca çözülebilir. Inositol halka üzerinde bulunan fosfat grupları sayısına göre daha yavaş çalışabilir Toluidine Blue jel boyama ile birlikte bir boyut kontrolü gibi IP 6 yükleme, pyrophosphorylated türevleri belirlenmesini sağlar. Yukarıda açıklanan prosedür 7 IP kolay arıtma sağlar. PAGE ile saflaştırılmış inositol pirofosfat analizi bizim IP 7 (Şekil 2A) saflığını ortaya çıkardı. İlginçtir ki, VIP1 IP 7 ürün 1/3PP-IP 5 izomeri IP 6 K1 tarafından oluşturulan IP 7 5PP IP 5 izomeri biraz daha yavaş göç eder. Arındırılmış IP 7 (Şekil 2B) konsantrasyonu kolay bir kantifikasyon izin IP 6 standartlarının kullanın. Daha fazla deneyler için IP 7 kullanmadan önce, biyolojik aktivite tespit edilebilir (Şekil 3). 5PP IP 5 VIP1 ve IP 7 fosfataz DDP1 (diphosphoinositol polifosfat phosphohydrolase) ile inkübe edilir. Rutin, saflaştırılmış IP 7 DDP1 (Şekil 3) VIP1 tarafından 8 IP ve IP 6 dönüştürülür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: IP 7 bant ve izolasyon SAYFA Toluidine boyama standart (IP 6) içeren jel kısmı kesilmiş ve Toluidine Blue çözüm kullanılarak boyandı. Üç grup (yukarıdan aşağıya) IP 7, IP 6 ve ATP temsil eder. Jel lekeli kısmı daha sonra kalan jeli ile uyumlu hale getirilmiştir. Bu IP 7, (kesikli kutu) kesilmiş ve temizlenmiş olabilir içeren jel kısmı lokalizasyonu sağlar. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: IP 6 K1 ve VIP1 tepkime ürünleri SAYFA analizi. A) Toluidine Blue boyama ile IP 6 Analiz (4, 2, 1, 0.5 nmol) IP 6 K1 (5PP IP 5) ve VIP1 (1/3PP-IP hem arınmış IP 7 konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan 5) reaksiyonlar. B) Scatter plot analiz saflaştırılmış IP 7 konsantrasyonunu belirlemek için. Konsantrasyonları ImageJ yazılım kullanarak IP 6, önceden belirlenmiş miktarda göre hesaplanan bant yoğunluğu, göre belirlenmiştir. X-ekseni şiddetleri temsil eder; Y ekseni nmol ifade konsantrasyonları temsil eder. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: IP 7 biyolojik aktivite analizi saflaştırılmış IP 7 kalitesini belirlemek için DDP1 VIP1 veya IP 7 fosfataz 5PP IP 5 (IP 6 K1 IP 7) inkübe ve ardından SAYFA reaksiyon çözümlenir. DAPI ve Toluidine boyama VIP1 tarafından 8 IP beklenen üretim ve DDP1 IP 6 ila 7 IP dönüşüm ortaya çıkardı.

<ol><li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li>
<li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li>
<li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+structure%2C+enzymology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphosphoinositol+polyphosphates%3A+metabolic+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li>
<li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li>
<li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li>
<li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li>
<li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li>
<li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li>
<li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li>
<li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li>
<li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns%283%2C4%2C5%29P3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li>
<li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plc1p%2C+Arg82p%2C+and+Kcs1p%2C+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis%2C+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li>
<li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+%28IP6K1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li>
<li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biyokimya inositol pirofosfat ciddi bu tür bileşiklerin ticari kullanılamaması ve mevcut algılama yöntemleri kötü hassasiyeti ile sınırlıdır. Farklı fosfat grupları sayısı ve Toluidine Blue (Şekil 1), fosfat grupları bağlanır metakromatik boya, sahip moleküllerin ayrılmasını sağlayan SAYFA kombinasyonu araştırma 20 yeni yollar açılması inositol pyrophoshate izoformları kolay tespit edilmesini sağlar. Outby yapılan enzimatik reaksiyon inositol pirofosfat ürünler arındırmak için SAYFA teknoloji açıklanan kullanım IP 6 K1 veya VIP1 ya da basit, ekonomik ve güvenilir, yüksek kaliteli IP 7 büyük miktarlarda üretim için izin veren bir yöntemdir . Yukarıda açıklanan yöntem 7 IP basit arıtma sınırlı değil ama açıklanan protokol küçük değişiklikler inositol pyrophosphates farklı bir dizi arıtma izin verebilir. Sekizden fazla fosfat grupları içeren Yüksek fosforile inositol pirofosfat izoformları, IP IP 6, 7 veya farklı miktarlarda bir substrat 20,6 olarak tespit edilebilir. Bu inositol pyrophosphates boyama prosedürünü uzunluğunun artırılması ve daha sonra saflaştırılmış (bölüm 3.2) tespit edilebilir. Ayrıca, IP 5 enzimatik reaksiyon için substrat olarak kullanımı 5 PP-IP arıtma ve inositol halka bir hidroksil grubu içeren diğer inositol pyrophosphates izin verecek. Sonuç olarak, bu basit yöntem, böylece, bu heyecan verici araştırma alanı için yeni yollar açılması, yaygın kullanılan enstrümanlar ile inositol pyrophosphates miligram miktarda güvenilir arıtma sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Fitik asit (IP 6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (sodyum hexametaphosphate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + tuz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Phosphocreatine (PCr) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho Kinaz (CK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> His-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> His-Ddp1 </td><td> Laboratuarda </td><td> Laboratuarda </td></tr><tr><td> Akrilamid: Bis-Akrilamid 19:01 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Amonyum persulfate (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Tris / Borat / EDTA (TBE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Toluidine Blue </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Mesih </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Jel aparat </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Vakum manifoldu </td><td> Mesih </td><td> Alpha 2-4 </td></tr><tr><td> Vakum pompası </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

kalite İnositol pyrophosphates hazırlanması

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol, doğa ya da değiştirilmemiş veya daha karmaşık fosforile türevleri mevcuttur. Son ki, ökaryotik hücrelerde en bol iki inositol pentakisphosphate (IP 5) ve inositol hexakisphosphate (fitik asit ya da IP 6). IP 5, IP 6, bir ya da daha fazla pirofosfat bağlar 1 içeren inositol pirofosfat moleküllerin habercileri . IP 6 Fosforilasyon diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 veya 5 PP-IP) ve bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 veya (PP) 2-IP 4) üretir. İnositol pyrophosphates şimdiye kadar üzerinde çalışılan bütün ökaryotik organizmalardan izole edilmiştir. Buna ek olarak, iki ayrı sınıflar inositol pirofosfat sentezi için sorumlu enzimlerin yüksek 2-4 evrim boyunca korunmuş. IP 6 kinazlar (IP 6 Ks) sahip muazzam bir katalitik esneklik, 5 IP ve IP 6, PP-IP 4 ve sırasıyla IP 7 ve daha sonra, substrat olarak bu ürünleri kullanarak, daha karmaşık moleküller nesil 5,6 teşvik dönüştürme . Son zamanlarda, pirofosfat üreten enzimlerin ikinci sınıf bir IP 7 ve IP 8 7,8 6 IP dönüştürmek mümkün maya protein VIP 1 formu (PP-IP 5 K olarak anılacaktır), tespit edilmiştir. İnositol pyrophosphates insülin salgılanması 9, telomer uzunluğu 10,11, kemotaksi 12, veziküler kaçakçılığı 13, fosfat homeostazı 14 ve HIV-1 gag sürümü 15 gibi birçok farklı hücresel süreçleri düzenler. Moleküllerin bu sınıf için eylem iki mekanizma ileri sürülmüştür. Allosterically AKT 16 gibi spesifik proteinlerin etkileşim hücresel fonksiyonları etkileyebilir. Alternatif olarak, bir fosfat pirofosfat grubu ön fosforile proteinler 17 bağışta bulunabilirsiniz. Bu araştırma alanında büyük bir potansiyel inositol pyrophosphates, pek çok bilim adamı bu moleküller ve bu yeni post-translasyonel değişiklik eğitim engelleyen bir ticari kaynak yokluğunda tarafından engellenmektedir. Inositol pyrophosphates izole etmek için mevcut yöntemleri gelişmiş kromatografi 18,19 gerektirir. Bu prosedürler, inositol pirofosfat bozulması 20 ve böylece kötü kurtarma yol açabilir asidik koşullarda kullanın . Ayrıca, hantal bir post-kolon tuzsuzlaştırma prosedürleri uzman laboratuarlar kullanımını kısıtlamak. Bu çalışmada, IP, 6-kinaz ve PP-IP 5-kinazlar reaksiyonlar ürünleri üretimi, izolasyon ve saflaştırma için basit bir yöntem tarif . Bu yöntem, yüksek fosforile inositol polifosfatlar çözmek için 20 poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yeteneği sayesinde mümkün oldu . IP 6 K1 ve yüzey gibi IP 6 kullanarak IP PP-5 K enzimatik reaksiyonların ardından, SAYFA, daha sonra suda yıkandı, oluşturulan inositol pyrophosphates ayırmak için kullanılır oldu.

İnositol pyrophosphates kanser, diyabet ve obezitenin insan patolojilerin önemli bir rol oynar; ancak, etki mekanizması tam bir anlaşmazlık meselesidir. Piyasada bulunan inositol pyrophosphates eksikliği detaylı çalışmalar sorunlu vermektedir. Burada inositol pyrophosphates miligram üretmek ve izole etmek için basit bir protokol.

Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması

Myo-inositol doğada ya modifiye edilmemiş halde ya da daha karmaşık fosforile türevleri şeklinde bulunur. Bunlardan ökaryotik hücrelerde en bol bulunan iki tanesi...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kaliteli ve saf pirofosfat üretmek ve saflaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle IP seven üretmek için bir enzim olan IP altı kinaz için substrat olarak IP altı kullanılarak gerçekleştirilir. Ardından, enzimatik reaksiyonlar bir poliamid jele yüklenir ve IP sevene karşılık gelen bant kesilerek çıkarılır.Ardından, IP seven ardışıkle kurutma-nemlendirme döngüleri ile izole edilir. Prosedürün son adımı, ürünün saflığını onaylamak ve konsantrasyonunu belirlemektir. Sonuç olarak, IP seven'in inkübasyonu yoluyla biyolojik aktivitesini gösteren bulgular elde edilebilir.VIP bir kinaz ve IP yedi fosfataz DDP bir ile bu reaksiyonlar sırasıyla IP sekiz ve IP altı üretir. Bu yöntem IP yedi sinyalizasyonu hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, IP sekiz gibi fosfatların veya IP beş türevli PPIP dört gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Bu protokol, IP six kinase one veya VIP one'ın IP six'ı piro fosfo ile ilişkili izoformlara dönüştürdüğü enzimatik reaksiyonların hazırlanması ile başlar. Bu gösterim için, histidin etiketli IP six kinase one ve GST etiketli VIP one enzimleri, daha önce tanımlanmış bir prosedüre göre e coli'den saflaştırılmıştır. Başlamak için, yazılı protokolde açıklandığı şekilde IP six ile his IP six kinase one veya GST VIP one içeren 10 ila 20 bağımsız enzimatik reaksiyon hazırlayın.Hacmi milli Q çift distile su ile 50 µL'ye tamamlayın. Tüpleri kısa süreli santrifüj ettikten sonra, reaksiyonları rotasyon eşliğinde gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. 24 cm uzunluğunda, 18 cm genişliğinde cam plakalar, 1,5 mm genişliğinde boşluklar ve 16 kuyucuklu bir tarak kullanarak poliakrilamid jel düzeneğini hazırlayın.Ardından, önceden hazırlanmış jel solüsyonunu, jel başına 50 milliliters hacimde olacak şekilde önceden dökülmüş cam plakaların arasına dökün. Tarağı yerleştirin ve jelin oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca polimerize olmasını bekleyin. Jel polimerize olduktan sonra, düzeneği soğuk odaya taşıyın.Jeli, 200 ila 300 volt değerinde yaklaşık 30 ila 60 dakika boyunca 1x TBE ile ön çalıştırmaya tabi tutun; bu sırada 1x orange G boyası kullanın. Her bir reaksiyon için 2 μM IP6 içeren standart bir kontrol numunesi hazırlayın. Ön çalıştırmanın ardından, her bir kuyucuğu çalıştırma tamponu ile iyice yıkayın.Herhangi bir çökmüş maddeyi uzaklaştırmak için 21 gauge iğne takılı bir şırınga kullanın. Ardından, jelin ilk iki ve son iki kuyucuğuna yükleme yapmamaya dikkat ederek örnekleri jele yükleyin. Son olarak, turuncu G boya bandı jelin alt kısmının son 10 santimetresine gelene kadar jeli geceden sabaha jel başına yedi miliamperde çalıştırın.IP seven izolasyonuna başlamak için jel düzeneğini sökün ve jeli diğer plaka üzerinde bırakarak bir cam plakayı dikkatlice çıkarın. Turuncu GD bandının hemen üzerinden tabana kadar, IP six standardını ve bir örnek kuyucuğunu içerecek şekilde jelin küçük bir kısmını kesin. Kesilen jel kısmını, Anatol Pyrophosphate bandı görünene kadar birkaç dakika toluidine blue ile boyayın.Bu sırada, boyanmamış jelin kurumasını önlemek için önceden kaldırılan cam plakayı tekrar jelin üzerine yerleştirin. Toluidin mavisi fazlalığını yıkamak için jelin boyanan kısmını birkaç dakika boyunca bir DES boyama solüsyonuna aktarın, ardından jeli boyanmamış jel ile birlikte eski konumuna getirin. IP seven bandı, IP six standartından biraz daha yavaş hareket ettiği için görünür olmalıdır; IP six'dan daha hızlı hareket eden A TP de görünür olmalıdır.Ardından, jelin boyanmamış kısmındaki IP seven bandını kesmek için bir jilet kullanın. Boyalı jel ile belirlenen IP seven göç konumundan yararlanın. IP seven bandının konumunu tahmin etmek için, jelden kesilen IP seven bandını 15 mililitrelik bir tüpe koyun ve 10 mililitre milli Q çift distile su ekleyin.İnkübasyonun ardından tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca döndürün, fazla TBE ve mikroskobik akrilamid partiküllerini uzaklaştırmak için sıvıyı dekantasyonla dökün. Ardından, önce IP yedi jelini içeren tüpe beş mililitre %50 methanol ekleyerek iki dejidrasyon hidratasyon döngüsü gerçekleştirin. Numuneyi oda sıcaklığında iki saat boyunca döndürün.Ardından, jel dilimini beş mililitre milli Q çift distile su içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca döndürün. İnkübasyonun ardından, metanol içeren tüpü daha sonraki kullanımlar için saklayın. Elüye edilen IP seven'ı konsantre etmek içindehidratasyon-hidratasyon döngüsünü bir kez daha tekrarlayın.Daha önce eklenen beş mililitre su ve beş mililitre %50 Metanol'ü birleştirin. Birleştirilmiş çözeltiyi 60 °C'ye ısıtılmış bir speed vac kullanarak kurutun. Numuneler neredeyse kuruduğunda, kalan sıvıyı 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Tüpü dakikada 5.000 devirde iki dakika boyunca santrifüjleyin. Akrilamid partikülleri içerebileceği için alttaki 20 ila 30 µL kısmını bırakarak SUP süpernatantını toplayın. Örneği yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.Gerekirse, ısıtmasız bir speed vac kullanarak kurutma işlemine devam edin. Örnekler tamamen kurursa, IP seven'in geri kazanımı önemli ölçüde azalır. Bu nedenle, örnekler 100 ila 300 microliters hacme ulaştığında kurutma işlemini sonlandırmak zorunludur.İzole edilen IP seven geri kazanıldıktan sonra, konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için numuneden iki ila beş mikrolitre bir sayfa jele yükleyin. Konsantrasyon standartları olarak IP six'ın birkaç seyrelmesini ve dört mol polip markörünü yükleyin. Jel çalıştırıldıktan sonra, tüm jeli toluidin mavisi çözeltisi ile boyayıp boyayıp boyayıcıyı gidererek başlangıç pirofosfat izoformlarını görselleştirin.Toluidin boyamayı takip eden ve az önce açıklanan prosedürün ardından, jel taranarak ve IP altı ile IP yedi arasındaki yoğunluk farkları karşılaştırılarak konsantrasyonlar belirlenebilir. Image J gibi görüntüleme yazılımları kullanılarak, IP altının IP yediye preparatif enzimatik dönüşümü, IP altı kinaz 1 ve VIP 1 enzimleri kullanılarak PAGE analizi ile kolayca çözümlenebilir.Boyut kontrolü olarak IP six yüklemesi ve buna eşlik eden toluidin mavisi jel boyaması, piro fosforile türevlerin tanımlanmasına olanak tanır. Başlangıçtaki fosfat grubu sayısına bağlı olarak daha yavaş hareket ettikleri için, yukarıda açıklanan prosedür IP seven'in kolayca saflaştırılmasıyla sonuçlanmıştır. Ayrıca, saflaştırılmış anatol pirofosfatın page analizi, IP seven'in saflığını ortaya koymuştur.İlginç bir şekilde, VIP1'in IP7 ürününün bir üç pirofosfat IP5 izomeri, IP6 kinaz 1 tarafından üretilen VIP7'nin beş pirofosfat IP5 izomerinden biraz daha yavaş göç eder. IP6 standartlarının kullanımı, saflaştırılmış IP7'nin konsantrasyonunun, IP7 kullanılmadan önce kolayca miktarının belirlenmesine olanak tanır. Daha ileri deneyler için biyolojik aktivitesi değerlendirilebilir.Beş.Pirofosfat IP5, rutin olarak FIP1 ve IP7 fosfataz DDP1 ile inkübe edilir. Saflaştırılmış IP7, VIP1 tarafından IP8'e ve DDP1 tarafından IP6'ya dönüştürülür. Bu prosedürün ardından, IP8'in izolasyonu veya diğer fosforile in izoformlarının belirlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için uzun süreli toluidine blue boyaması gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

preparation-of-quality-inositol-pyrophosphates

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Cis diastereoselektif tek kap hazırlanması için bir protokol - N-Ts-iodoaziridines tarif edilmektedir. N-Ts aldiminler ve gem-diiyodür iodoaziridines aracılık eden amino gösterilmiştir siklizasyonu için diiodomethyllithium, ilave üretimi. Ayrıca, hızlı ve nicel şekilde kromatografi ile saflaştırma için en uygun bir durağan fazı değerlendirmek için bir protokol dahildir.

Sentez ve Kromatografi için optimal sabit faz kantitatif seçimi dahil edilmesi Iodoaziridines saflaştırılması

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Alarak yüksek saflıkta nonsymmetric dialkylphosphinic asit extractants sentezi için bir protokol sunulmuştur (2,3-dimethylbutyl) (2,4, 4'-trimethylpentyl) bir örnek olarak phosphinic asit.

Yüksek saflıkta Nonsymmetric Dialkylphosphinic asit Extractants sentezi

Bu kağıt filtre malzemeleri, demir içeren üzerine Fosfonat adsorpsiyon araştırmak için bir prosedür tanıttı biraz çaba ve yüksek güvenilirlik ile özellikle taneli demir hidroksit. Arabelleðe alýnmýþ bir çözümde phosphonate bir rotator kullanarak adsorbent temas getirdim ve bir minyatür fosfor tayini yöntemi ile analiz.

Fosfonat adsorpsiyon taneli ferrik minyatürize fosfor belirleme yöntemini kullanarak hidroksit üzerine belirlemek için en iyi duruma getirilmiş yordamı

İnorganik polifosfat, gram pozitif, gram-negatif ve Mikobakteriyel türler de dahil olmak üzere çeşitli bakterilerde hızlı miktar için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Burada bitkilerdeki inositol polifosfatları tespit etmek ve ölçmek için son derece hassas bir yöntem olan[3H]-myo-inositol etiketli fidelerin güçlü aniyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisini tanımlıyoruz.

SAX-HPLC kullanılarak Farklı Bitki Türlerinden Çözünür, Radiolabeled Inositol Polifosfatların Ekstraksiyonu ve Niceliği

Memeli hücre ekstraktlarından inositol pirofosfatların mutlak kantitasyonu için kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi için bir prosedür tanımlanmıştır.

İnositol Pirofosfatların Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ile Mutlak Kantitasyonu

Öğrenin inositol pirofosfatların üretimi ve saflaştırılması için enzimatik reaksiyon ve jel elektroforezi yöntemlerini. Bu protokol IP7 izolasyonu ve biyolojik aktivite analizi için güvenilir bir yöntem sunar.

Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması

Daha fazla video keşfet