PDMS Cihaz İmalat ve Yüzey Modifikasyonu

Benim adım Ken Kotz. Burada, Massachusetts General Hospital'a bağlı Bio MAs Resource Center'da doktora sonrası araştırmacıyım. Ana araştırma projem, mikroakışkan yapılara sahip bir immünofinite yakalama cihazı kullanarak nötrofillerin izole edilmesini içerir.

Bu cihazı, aşağı akış genomik analizi için RNA'yı izole etmek için ülke çapında beş farklı hastanede kullanıyoruz. Temel olarak sahip olduğunuz şey, silikonun üzerinde bir SU sekiz fotoğraf direnci ustasıdır. Bu master'ın üzerine iki parçalı bir elastomer A-P-D-M-S dökeceğiz ve bu PDMS bir kalıp oluşturacak.

Ana kalıbı kutusundan çıkarıp bir Petri kabına yerleştiriyoruz. Master, bir Petri kabının altındaki bantla sabitlenir. Terazide PDMS, sertleştirici ve baz reçine karışımını tartıyoruz.

Oran, bir kısım sertleştiriciye 10 kısım reçinedir. Tipik olarak, kesilmiş cihazlarımız için sırasıyla 20 ila 30 gram reçine ve iki ila üç gram sertleştirici tartıyoruz. Hem sertleştiriciyi hem de reçineyi küçük peynir altı suyu teknesine döktükten sonra, ikisini karıştırmak için standart bir plastik çatal kullanıyoruz.

Sertleştiricinin reçine içinde eşit olarak dağıldığından emin olmak için kuvvetlice karıştırdığınızdan ve karışımı üst üste katladığınızdan emin olmak istersiniz. Tipik olarak, ikisinin ne kadar iyi karıştırıldığını izleriz. Hava kabarcıklarının sayısına bakarak, elastomer boyunca küçük hava kabarcıklarının eşit bir dağılımını elde etmeye çalışıyoruz.

Daha sonra PDMS'yi Petri kabındaki SU sekiz master'ın üzerine döküyoruz. Master'ı PDMS ile birlikte üzerine vakumlu bir çan kavanozuna yerleştiriyoruz ve içine karıştırdığımız havanın gazını almak için hazneyi boşaltıyoruz. Tipik olarak, gaz giderme işlemi 30 dakika ila bir saat sürer.

Gaz giderme işleminden sonra, cihazları vakum odasından çıkarır ve 65 ila 80 derece C'de bir fırına yerleştiririz. Bu sıcaklıklarda minimum kürlenme süresi üç ila altı saattir. Laboratuvarımızda, cihazları genellikle gece boyunca fırında bırakırız.

Tipik olarak, 11 numara cerrahi çelik bıçak kullanırız. Silikon master'ın kenarından yaklaşık yarım santimetre aşağı doğru düz kesimler yapıyoruz ve master'ın kenarını keserek büyük bir disk yapıyoruz. PDMS kalıbını master'dan soyuyoruz ve özellik tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir Petri kabına yerleştiriyoruz.

Serbest kalan kalıbı Petri kabından alıyoruz ve bir bıçak veya doğrusal bir ray üzerine monte edilmiş bir bıçak kullanarak bir kesme yüzeyine yerleştiriyoruz. Kalıp üzerinde bulunan cihazları bölümlere ayırıyoruz. Her bölüm cihazı daha sonra daha fazla işlem için Petri kabına geri yerleştirilir.

Tipik olarak, cihazlarımızı sıvılarla arayüzlemek için PDMS cihazına delikler açacağız. Delik açmak için kullandığımız cihaz standart üç değirmenli bir şırıngadır. Üç değirmen şırıngasının ucunda künt uçlu paslanmaz çelik bir iğne bulunur.

Paslanmaz çelik iğnenin içinde, iğnenin iç çapına uyan bir tel bulunur. Bu tel şırınganın pistonuna bağlıdır Pistonu geri çekerek ve bu iğneyi geri çekerek, PDMS'ye bir delik açabilir veya bir tapa delebilirsiniz. PDMS cihazını çevirin ve pistonu iterek çıkarın.

Delme cihazlarının sırrı, pistonu mümkün olduğunca dikey tutmak ve delme cihazını hiç döndürmemektir. PDMS'yi deldiğinizde, tüm cihazı, tüm PDMS cihazını bir cımbızla kaldırır, ters çevirir ve pistona bastırarak fişi çıkarırsınız. Fişi bir cımbızla tutup atıyorsunuz.

Ardından pistonu tekrar geri çekin, cihazı tekrar aşağı çevirin ve kesme cihazını dışarı çekin. Tüm deliklerinizi açana kadar bunu tekrarlarsınız. Bu yüzden yapıştırma işlemi için PDMS cihazlarımızı cam slaytlara yapıştırıyoruz.

Cihazlarımız için, PDMS'yi cam slaytlara geri dönüşümsüz olarak bağlayacağız veya kovalent olarak bağlayacağız. Bunun başarılma şekli, onları bir plazma Asher'e yerleştirmek, bir plazma Asher'e yerleştirmek ve reaktif bir oksijen plazmasına maruz bırakmaktır. Bu nedenle, bunu yapmanın adımları, PDMS cihazını almak ve plazma Asher'ın tepsisine yerleştirmektir.

Cihaz özellikleri yukarı bakacak şekilde, herhangi bir standart cam mikroskop lamını kullanabilirsiniz. Cihazımıza uyması için biraz büyütülmüş bir buçuk inçlik bir mikroskop lamı kullanıyoruz. Bunları paketten çıkar çıkmaz kullanabilirsiniz.

Onları bir pirana çözeltisinde tedavi etmeyi tercih ediyoruz. Bu, cam sürgünün yüzeyinde olabilecek organik kirleticileri temizler. Cihazı ve cam sürgüyü plazma Asher tepsisinin üzerine yerleştirdikten sonra, tepsiyi plazma Asher'in içine kaydırın ve reaktif oksijen plazmasına maruz bırakın.

Plazma Asher programının tamamlanmasının ardından hazneyi açıyoruz ve cihazlarımızla birlikte plakayı tezgah üstüne çıkarıyoruz. Cımbız kullanarak, yapıştırma yüzeylerine parmaklarımızla dokunmamaya dikkat ederek PDMS cihazını dikkatlice kaldırıyoruz. Yapıştırma tarafını camın üzerine, cam kızağın üzerine çeviriyoruz ve ardından PDMS ile cam sürgü arasında hava kabarcığı olmadığından emin oluyoruz.

Daha iyi bir kimyasal bağ elde etmek için şimdi cama yapıştırılmış PDMS cihazını 65 ila 75 derece C'de 10 dakika boyunca sıcak bir plaka üzerine yerleştiriyoruz. Bu kısımda, bu bölümde, temiz odada yapıştırmayı takiben camdaki PDMS'nin yüzeylerini kimyasal olarak değiştireceğiz, yüzeyde reaktif OL grupları bulunan bir yüzey A PMS yüzeyi ile baş başa kalıyoruz. İhtiyacımız olan bu reaktif yüzey hidrofiliktir ve sonunda PMS'nin büyük bir kısmına yayılacaktır.

Bu yüzden yüzey kimyası en iyi plazma işleminden hemen sonra gerçekleştirilir, bir me capto'nun %5'lik bir çözeltisini kullanacağız. Üç me capto, propil, trimeth oksi. Hacimce %5'lik bir çözeltidir ve temel olarak yaptığımız şey, onu girişe enjekte etmek ve cihazı herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen doldurduğunuzdan emin olmaktır.

Herhangi bir hava kabarcığı varsa, bunları cımbızla dışarı itersiniz. Bu, slan'ı enjekte ettikten sonra, 15 ila 30 dakika oturmasına izin verirsiniz. Oda sıcaklığında, tipik olarak, reaksiyona 10 dakika içinde ikinci bir hacim slan enjekte ederiz.

Yani silin yaklaşık yarım saat reaksiyona girdikten sonra, tüm cihazları üç ila dört cihaz hacmi saf etanol ile yıkayacağız. Çıkardığımız fazlalık sadece bir kimyasal mendil ile silinecektir Cihazların durulanmasının ardından, cihazları alıyoruz ve yüz derece C'ye ayarlanmış sıcak bir plakaya yerleştiriyoruz ve temel olarak orada bulunan etanolün buharlaşmasına izin vereceğiz. Bu, silling yüzeyinin diz çökmesine yardımcı olur.

Cihaz kuruduktan sonra aylarca kurutulmuş halde saklanabilir veya cihazı alıp hemen bir sonraki adıma geçebilirsiniz. Cihazlar sertleştikten sonra, hem cam hem de PDMS yüzeyinde artık bir sinüs kaplama ile kürlenirler. Sinüs, GMBS olan hetero iki işlevli çapraz bağlayıcımız ile reaksiyona girecek olan tiyol grubu ile bir kapto sinüsdür.

Saf etanol içinde seyreltilir. Suya tepkilidir, bu nedenle sulu koşullara maruz bırakmamaya dikkat etmeniz gerekir. Bunu cihazlara enjekte ediyoruz ve tüm yüzeylerin bu molekülle birleştiğinden emin olmak için burada yaptığım gibi cımbızla hava kabarcıklarını çıkarıyoruz.

Üzerini örtüyoruz ve yarım saat tepki vermesine izin veriyoruz. GMBS yarım saat boyunca reaksiyona girdikten sonra, cihazdaki etanol kalıntılarını gidermek için cihazları deiyonize su ile yıkayacağız. Ve sonra biyotin bağlayıcı protein olan neu travain'den geçeceğiz.

Neu travain daha sonra mil başına 10 mikrogramlık bir konsantrasyona önceden seyreltilir. Cihaza yanlışlıkla herhangi bir hava enjekte edilirse, tüm hava etanol ıslaklarını etkili bir şekilde gidermek için cihazın etanol ile yeniden yıkanması gerekecektir, cihaz daha iyi yüzeye çıkar ve yanlışlıkla cihaza giren hava kabarcıklarını çıkarmanıza olanak tanır. Cihazlar iyonize su ile yıkandıktan sonra, cihazı tipik olarak seyreltilmiş nötr kanıt T travain çözeltisinin iki ila dört cihaz hacmi ile dolduracağız.

Nutt travaini, Nutt travaini üzerindeki herhangi bir birincil yolla yüzeye hareketsiz hale getirilen GMBS ile reaksiyona girecektir. Bu işlem oda sıcaklığında bir saat boyunca gerçekleşebilir. Tipik olarak, cihazları gece boyunca dört derece C'de soğuk odaya yerleştiririm.

Bununla birlikte, antikoru eklemeden önce, çözelti içinde bağlanmamış olan herhangi bir Aden'i temizlemek istiyoruz. Ve bunu, PBS'de seyreltilmiş %1'lik çözelti BSA'dan geçirerek yapıyoruz. Bu çipler aşağı akış genomik analizi için kullanılacağı için, kullandığımız tüm çözeltiler RNA içermez.

Tipik olarak yaptığımız şey, cihazı dört ila beş hacimde %1 BSA solüsyonu ile yıkamaktır. Ve bunu takiben, antikorumuzu ekliyoruz. Bu deney için antikor, CD 66 B ve tam kandaki granülositlere özgü antikorlardır.

Mil başına 10 ila 25 mikrogram arasında bir konsantrasyon kullanıyoruz ve antikoru enjekte edeceğiz. Her cihaza 200 mikrolitre antikor enjekte edeceğiz. Cihazın her bir portuna bir tane olmak üzere yüz mikrolitrelik iki enjeksiyon yapacağız.

Tipik olarak, bir porta yüz mikrolitre enjekte edeceğiz ve 30 dakika bekleyip karşı porta yüz mikrolitre daha enjekte edeceğiz.