Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak mukozal bağışıklık sistemi içinde yer alan M hücreleri tarafından bakteri alımını incelemektir. Bu prosedürün ilk adımı, anestezi uygulanmış bir farenin bağırsak ateşi yamalarını açığa çıkarmak ve serbest bırakmaktır. Floresan bakteriler daha sonra bağlanan bölgeye enjekte edilir.

Bir saat sonra, odun yığınları eksize edilir. Dokudaki hücrelere daha sonra nüfuz edilir ve M hücre markörü, GP iki için boyanır. Son olarak, numuneler konfokal bir mikroskop kullanılarak gözlenir ve M hücreleri tarafından transsitoz edilen bakteriler görüntülenebilir.

M hücreleri tarafından bakteriyel transsitozun moleküler temeli hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, işten çıkarma diğer sistemlere de uygulanabilir. Örneğin, bu protokol hücre geçirgenliğine yardımcı olmak için ve klor ve mikrop kullanılarak çerçeveli bağırsakta kullanılabilir Steril bir cam yayıcı kullanarak, floresan bakterileri bir LB burgu plakası üzerinde çizin ve plakayı tek koloniler görünene kadar 37 santigrat derecede inkübe edin. Katı burgudan tek bir koloni seçin ve iki mililitre taze LB ortamına aşılayın.

Daha sonra bakterileri gece boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde kültürleyin. Başlangıç kültürü büyüdükten sonra, 500 mikrolitre bakteriyi 4.5 mililitre LB ortamına aktarın ve bu yeni kültürü 37 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca veya 600 nanometredeki optik yoğunluğu bire ulaşana kadar inkübe edin, bu da bakteri büyümesinin log fazında olduğunu gösterir. Bu noktada, santrifüjlemeyi takiben bakterileri hasat etmek için kültürü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyin, snat'ı atın ve peleti beş mililitre steril PBS ile yıkayın Yıkama adımını tekrarladıktan sonra Resus, bakterileri beş mililitre PBS'de askıya alır.

Fareyi sürekli flor anestezisi altına yerleştirdikten sonra, farenin karnını aseptik olarak açmak için steril aletler kullanın. İnce bağırsağı açığa çıkararak başlayın ve PI'nin yamalarını bulun. Bir PI'nin yamaları bulunduktan sonra, bağırsağı yamanın bir tarafına yaklaşık beş milimetre bağlamak için steril dikiş ipliği kullanın.

İşlem sırasında kan damarlarının kesilmemesine dikkat edin. Bağırsak bağlandıktan sonra, bağırsağın gevşek tarafındaki bağlanmış ateşler yama halkasına yedi CFU'ya yaklaşık 10 mikrolitre bakteri süspansiyonu enjekte etmek için bir şırınga kullanın. Daha sonra bağırsağın diğer tarafını bağlamak için iplik kullanın.

Farenin karnını bir klipsle kapatın ve ötenazi yapmadan önce fareyi bir saat anestezi altında tutun. Odun yamasını hasat etmek için, odun yığınını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, PI yamasının apikal tarafını yıkamak ve fazla mukozal sıvıyı ve bakterileri uzaklaştırmak için PBS'yi bağırsağın hasat edilen bölümünden birkaç kez kuvvetlice yıkayın.

PI'nin yaması yıkandıktan sonra, 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin ve cyto efektleri veya cyto perma solüsyonu ekleyin. Numuneyi bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. P'S yaması sabitlendikten sonra, beş dakika boyunca bir mililitre perma yıkama tamponunda bekletin.

Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Daha sonra numuneyi bir mililitre bloke edici tampona yerleştirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Engelleme adımını takiben, mililitre başına beş mikrogramlık bir nihai konsantrasyona anti fare GP iki monoklonal antikor ekleyin ve M hücrelerini boyamak için numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, numuneyi daha önce olduğu gibi yıkayın. Konjuge antikor için ikincil bir zemin ekleyin ve numuneyi karanlıkta buz üzerinde iki saat inkübe edin. Numune lekelendikten sonra, numuneyi PBS'de nazikçe yıkayın.

Daha sonra bir slayt üzerine üç veya dört parça dairesel kapak camı yerleştirin ve pires yamasını PBS'de 200 mikrolitre% 30'luk bir gliserol çözeltisine gömün. Slaytta, numuneyi gözlemlemek için bir DM IRE iki konfokal lazer mikroskobu veya bir Delta vision restorasyon evrişim mikroskobu kullanın. Bu görüntüde, yeşil GFP etiketli salmonella typhimurium'un apikal plazma zarı üzerinde kırmızı ile gösterilen GP iki ile çevrili olduğu görülebilir.

Bu döndürülmüş görüntüde, bakteriler subapikal sitoplazmik veziküller içinde görülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bağlanmış pys bağırsak Lu asay kullanarak M hücreleri tarafından bakteriyel transsitozun nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.