Name: Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Öğrenin fare Peyer's patch'lerinde M hücreleri tarafından bakteriyel alımı değerlendirmek için bağırsak loop testi yöntemini. Bu teknik konfokal mikroskopi ile bakteri translokasyonunu görselleştirir ve mukozal bağışıklık yanıtlarını incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu tekniği geliştirmek için tüm AYB üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Öncelik Alanları Membran Trafik &quot;(HO), ve&quot; Bulaşıcı Olayları Matrix &quot;(KH), Genç Bilim Adamları (SF ve KH), Bilimsel Araştırma (HO Bilimsel Araştırma için Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklenmiştir. Yenilikçi Alanları Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Japonya &quot;Hücre içi Lojistik&quot; (HO),), Bilimsel Araştırma.

1. Bakteri hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Streak gliserol ve LB (GFP ifade S. Typhimurium) floresan bakteri süreyle 100 mcg / ml ampisilin içeren agar plaka. </li><li> Kültür geceleme yeni LB orta 2 ml LB agar tek bir koloni. </li><li> 1.0 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk ulaşana kadar yeni LB orta ve inkübe 4.5 ml 0.5 ml bakteri kültürü ekleyin. </li><li> Santrifüj yoluyla Hasat bakteri hücrelerinin (3.000 xg, 5 dk, 4 ° C). </li><li> Süpernatantı atın ve 5.0 ml steril fosfat tamponu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. </li><li> 5 ml PBS ile bakteriyel pelletini tekrar ve inokulum olarak yaklaşık 10 7 koloni oluşturan birim (CFU) içeren süspansiyon 50 ul kullanabilirsiniz. </li><li> Floresan etiketli bakterileri kullanarak durumda, bakteri hücrelerinin standart protokole göre floresan etiketleme reaktif etiketli. </li></ol> 2. Anesthesia <ol><li> % 5 (v / v) ile küçük bir plastik kutu (10 x 10 x 5 cm) doldurun buharlaşmış izofluran hava (akış hızı: 200 ml / dak) ile karıştırılır. </li><li> Anestezisi sekiz kutusunda, on altı zayıf yaşında erkek veya dişi fareler. </li><li> Fareler anestezi sonrası otopsi tabloya taşıyın. </li><li> Sürekli% 2 (v / v) tarafından fareler uyutmak buharlaşmış izofluran hava ile karışık (akış hızı: 200 ml / dak) (Şekil 1). Bu terminal bir işlemdir. </li></ol> 3. Bağlandı Peyer yama döngü tahlil <ol><li> İnsizyon 1cm karın cilt ve sonra anestezi bir fare karın periton kesilmiş ve ince bağırsakta Peyer yama içeren çıkarmak. </li><li> Kan damarlarının özen, dikiş ipliği ile bağırsak Arter. Not: bağırsak sadece bind bir tarafı, diğer tarafı gevşek bırakın. </li><li> Gevşek s bağlanan Peyer yama döngü içine bakteriyel süspansiyon veya PBS (kontrol) bir şırınga ile enjekte 50 ulide bağırsak (Şekil 2). </li><li> Gevşek yan bağlama ve bir klip ile farenin karın yakın. </li><li> 1 saat sonra bağlandı Peyer yama döngü kaldırmak ve servikal dislokasyon fare euthanize. </li><li> Vergi Peyer yama bağlanan Peyer yama döngü. </li><li> Aşırı mukoza sıvısı ve bakteri kaldırmak için bir iğne takılı şırınga ile 1 ml PBS tarafından Peyer yama apikal tarafında yanıp söner. Peyer yama ek bir iki kez yanıp söner. </li></ol> 4. Tüm montaj boyama ve Peyer yama konfokal mikroskobik inceleme <ol><li> 1 saat buz BD Cytofix / Cytoperm çözüm Peyer yama sabitleyin. </li><li> Sonra 1 ml üzerinde 30 dakika için 0.1% (w / v) saponin,% 0.2 (w / v) PBS içinde BSA içeren engelleme tampon bloğu BD Perm / 5 dakika boyunca tampon yıkayın 1ml Peyer Kullanıcı yama üç kez yıkayın, ve buz. </li><li> 200 kat seyreltilmiş numune GP2 monoklonal antikor (5 mg / ml) tespit etmek için anti-fareM hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca inkübe 4 ° C </li><li> 1 ml soğuk PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra, numune için DyLight549 (20 mg / ml) ile konjuge 200 kat sulandırılmış anti-fare IgG antikor ekleyin. </li><li> 2 saat buz örnek inkübe edin. </li><li> 1 ml soğuk PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra F-aktin tespit etmek için numune 50 kat sulandırılmış Alexa 633 konjuge Phalloidin ekleyin. </li><li> 2 saat buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 1 ml soğuk PBS ile hafifçe yıkayın. Sonra bir slayt 3-4 adet yuvarlak cam kapak yerleştirin ve slayt (Şekil 3) PBS içinde% 30 gliserol çözüm örneklerinin gömmek. </li><li> DM-IRE2 konfokal lazer tarama mikroskobu veya DeltaVision Restorasyon deconvolution mikroskop sahip örnekler dikkate alınmalıdır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bir fare örnek örnek GFP-typhimurium Peyer yama döngü tahlil bağlandımurium DeltaVision Restorasyon deconvolution mikroskobu (Şekil 4) gözlenmiştir. GFP-S. Typhimurium GP2 + M hücreleri tarafından transcytosed. Fare Peyer yama bağırsak döngü tahlil M hücreleri tarafından transcytosed ortakçı ya da patojenik bakterilerin türünü belirlemek. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig1.jpg"> Şekil 1 buharlaşmış izofluran koşul altında farelerin Anestezi. Buharlaştı izofluran adanmış bir anestezi cihazları (sol taraf) tarafından sağlanmıştır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig2.jpg"> Şekil 2 bağlanan Peyer yama bağırsak döngü testinin özeti. Floresan bakteriyel süspansiyon bağırsak gevşek tarafında bağlanan Peyer yama döngünün içine şırınga ile enjekte edildi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig3.jpg"> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig4.jpg"> Şekil 4 bir fare bağlandı GFP-S. Typhimurium ile Peyer yama döngü tahlil örneği. M hücre spesifik bir işaretleyici 5 olarak rapor GP2, anti-fare GP2 antikor (Kırmızı) ile boyandı. Numune DeltaVision Restorasyon deconvolution mikroskop ile gözlendi. GFP ifade S. Typhimurium M hücrenin apikal plazma membranı ve GP2 subapical sitoplazmik veziküller (ok başları) ile birlikte lokalize idi. Top, apikal görünümü. Alt ve yan, yanal manzarası. Ölçek çubuğu: 10 mikron.

<ol><li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+IgA+synthesis%3A+regulation+of+front-line+body+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).</li>
<li>Hapfelmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+microbial+colonization+of+germ-free+mice+reveals+the+dynamics+of+IgA+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses.</a> Science. 328, 1705-1709 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., Jones, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+specialization+within+human+Peyer%27s+patches%3A+an+ultrastructural+study+of+intestinal+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles.</a> Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).</li>
<li>Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues.</a> Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Hase, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH%28%2B%29+bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462, 226-230 (2009).</li>
<li>Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteropathogenicity+of+Escherichia+coli.+I.+Evaluation+of+mouse+intestinal+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops.</a> Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).</li>
<li>Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cell+transport+of+Vibrio+cholerae+from+the+intestinal+lumen+into+Peyer%27s+patches%3A+a+mechanism+for+antigen+sampling+and+for+microbial+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration.</a> J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).</li>
<li>Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cells--entryways+of+opportunity+for+enteropathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">M cells--entryways of opportunity for enteropathogens.</a> J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).</li>
<li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer%27s+patch+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).</li>
<li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium%2C+Listeria+monocytogenes%2C+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).</li>
<li>Nagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Peyer%27s+patches+in+the+induction+of+Helicobacter+pylori-induced+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Bakteriyel süspansiyon ile bağlanan Peyer yama inkübasyon süresi genellikle M hücrelerine bakteriyel birleştirmek gözlemlemek için 1 saat. 4 saat inkübasyon durumda, bakterilerin genellikle Peyer Kullanıcı yamalar T hücre bölgesi tespit edilir. Buharlaşmış izofluran uçucu anestezi fareler istikrarlı tutmak gibi, bakteriyel süspansiyon ile bağlanan Peyer yama inkübasyon süresi Peyer yama T-hücre bölgeye hareket eden bakteriler gözlemlemek için uzatılabilir. Bu deneyde önemli bir nokta, bağırsak ligating, kan damarı...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> LB Agar Ampisilin- 100 </td><td> SIGMA </td><td> L5667 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 mono-Reaktif Boya Paketi </td><td> GE Healthcare </td><td> PA23001 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 karboksilik asit, succinimidyl ester </td><td> Invitrogen </td><td> A10168 </td><td></td></tr><tr><td> Inhalasyon anestezisi cihaz </td><td> Shinano Seisakusho </td><td> SN-487 </td><td></td></tr><tr><td> Fiksasyon ve Permeabilization Çözüm </td><td> BD </td><td> 554722 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare Glikoprotein 2 antikor </td><td> MBL </td><td>D278-3 </td><td> 200 kat dilüsyon (5μg/ml) </td></tr><tr><td> Keçi Anti-Rat IgG, F (ab &#39;) 2 parça özel </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 112-505-006 </td><td> 200 kat dilüsyon (20μg/ml) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 633 Phalloidin </td><td> Moleküler Probları </td><td> A22284 </td><td> 50 kat seyreltme </td></tr><tr><td> Konfokal lazer mikroskop tarama </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMIRE2 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Restorasyon deconvolution mikroskop </td><td> Uygulamalı Hassas </td><td> DeltaVision Çekirdek </td><td></td></tr></tbody></table>

fare uygulama m hücreleri tarafından bakteriyel alımı değerlendirin peyer patch bağırsak loop testi bağlandı

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Bizim bağırsak iç commensal bakterilerin büyük sayı ile yaşadığı. Gastrointestinal sistemin mukozal yüzeyinde, sürekli olarak onlara ve bazen patojenlere maruz kalmaktadır. Bağırsak ile ilişkili lenfoid doku (GALT), bu mikropların 1, 2 mukozal bağışıklık yanıtının indüksiyonu için önemli bir rol oynamaktadır . Mukozal immün yanıtı başlatmak için, mukozal antijenleri Peyer Kullanıcı yamaları gibi organize lenfoid folikül içine epitel bariyer boyunca bağırsak lümeni taşınması gerekir. Bu antijen transcytosis, uzmanlaşmış epitel M hücreleri 3, 4 aracılık eder . M hücreleri, makromoleküllerin ve mikropların aktif fagosite atipik epitel hücreleri vardır. Dendritik hücreler (DC) ve makrofajlar, bozulması için lizozomlar hedef antijenleri aksine, M hücreleri esas olarak içselleştirilmiş antijenleri transcytose. M hücreleri ile bu dinamik makromoleküler transcytosis altta yatan organize lenfoid folikül bir antijen sunard antijen-spesifik mukozal bağışıklık yanıtlarını başlatmak için gerekli olduğuna inanılmaktadır. Ancak, M hücreleri tarafından bu antijeni alımını teşvik eden moleküler mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Daha önce özellikle enterositler arasında M hücrelerinin apikal plazma membran glikoprotein ifade 2 (GP2), Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium dahil olmak üzere, ortakçı ve enterobakteriler patojenik bir alt kümesi için bir transcytotic reseptörü olarak hizmet ettiği bildirdin ) FimH, bakteri dış zar 5 pili türü bir bileşeni tanıyarak. Burada, M hücreleri tarafından bakteriyel alımını değerlendirmek için bir fare Peyer yama bağırsak döngü testinin uygulanması için bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha önceden açıklanan 6, 7 farenin bağırsak döngü testinin geliştirilmiş bir versiyonu. Geliştirilmiş noktalar şunlardır: 1. İsofluranın bir anestezik ajan olarak kullanılmıştır. 2. Bağlandı bağırsak döngü dahil olmak üzere yaklaşık 1 cming Peyer yama kurulmuştur. 3. M hücreleri tarafından alınan bakteriler, floresan, floresan etiketleme reaktif veya yeşil floresan proteininin (GFP) gibi eksprese floresan protein tarafından işaretlenmiştir. 4. M Peyer yama kapsayan folikül ilişkili epitel hücreleri, anti GP2 antikor ile tüm montaj immunostainig tarafından tespit edildi. 5. M hücreleri tarafından Floresan bakteriyel transcytosis konfokal mikroskobik analizi ile gözlenmiştir. Fare Peyer yama bağırsak döngü testinin cevap kaynağı olabilir ne tür ortakçı veya M hücreleri tarafından transcytosed patojen bakteriler, ve M hücreleri yoluyla mukozal bağışıklık sistemini uyarmak için nasıl moleküler mekanizmayı anlamak için bize yol açabilir.

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme yöntemi<em&gt; In vivo</em&gt;. Bu yöntem, bağışıklık sistemini M-hücre fonksiyonu anlamak için bir yöntem sağlar.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Bağırsağımızın içi, çok sayıda kommensal bakteri ilelele doludur. Gastrointestinal sistemin mukozal yüzeyi sürekli olarak maruz kalmaktadır...

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak mukozal bağışıklık sistemi içinde yer alan M hücreleri tarafından bakteriyel alımı incelemektir. Bu prosedürün ilk adımı, anestezi altındaki bir farenin bağırsak Peyer plaklarını açığa çıkarmak ve bağlamaktır. Ardından, bağlanan bölgeye floresan işaretli bakteriler enjekte edilir.Bir saat sonra, pyres yamaları eksize edilir. Ardından dokudaki hücrelere M hücresi belirteci olan GP2 için permeabilizasyon ve boyama uygulanır. Son olarak, örnekler konfokal mikroskop kullanılarak gözlemlenir ve M hücreleri tarafından transkitoz edilen bakteriler görselleştirilebilir.M hücreleri aracılığıyla gerçekleşen bakteriyel transkitozun moleküler temeline dair içgörü sağlamanın yanı sıra, bu yöntem diğer sistemlere de uygulanabilir. Örneğin, bu protokol klor ve mikrop kullanılarak inflamatuar bağırsaktaki hücre geçirgenliğinin değerlendirilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. Steril bir cam yayma çubuğu kullanarak floresan işaretli bakterileri bir LB agar plağına ekle ve tekil koloniler görünene kadar plağı 37 °C'de inkübe et. Katı agar üzerinden tek bir koloni seç ve bunu iki mililitre taze LB besiyerine inoküle et.Ardından bakterileri 37 °C'de bir çalkalayıcıda gece boyunca kültüre edin. Başlangıç kültürü büyüdüğünde, 500 µL bakteriyi 4,5 mL LB besiyerine aktarın ve bu yeni kültürü, 600 nm'deki optik yoğunluğu bakteriyel büyümenin log fazda olduğunu gösteren 1 değerine ulaşana kadar veya üç ila dört saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bu noktada, bakterileri toplamak için kültürü 4 °C'de 3000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj sonrası süpernatantı atın ve peleti 5 mL steril PBS ile yıkayın. Yıkama adımını tekrarladıktan sonra bakterileri 5 mL PBS içerisinde yeniden süspanse edin.Fareyi sürekli izofluran anestezisi altına aldıktan sonra, steril aletler kullanarak farenin karnını aseptik şekilde açın. İnce bağırsağı açığa çıkararak başlayın ve payer plaklarını (PI's patches) bulun. Payer plakları bulunduğunda, steril dikiş ipi kullanarak bağırsağı plağın bir yanından yaklaşık beş milimetre uzaklıktan bağlayın.Prosedür sırasında kan damarlarının kesilmemesine dikkat edin. Bağırsak bağlandıktan sonra, bir şırınga kullanarak, bağlanan bağırsak döngüsünün serbest kalan tarafına 10⁷ CFU konsantrasyonunda 50 µL bakteriyel süspansiyon enjekte edin. Ardından, bağırsağın diğer tarafını ip kullanarak bağlayın.Fare firarenin karnını bir klipsle kapatın ve fareyi ötanazi yapmadan önce bir saat boyunca anestezi altında tutun. Peyer plaklarını toplamak için, Peyer plaklarını dikkatlice kesin. Ardından, PI plağının apikal tarafını yıkamak ve fazla mukozal sıvıyı ve bakterileri uzaklaştırmak için, toplanan bağırsak bölümünden birkaç kez kuvvetlice PBS geçirin.PI yaması yıkandıktan sonra, 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin ve cyto effects veya cyto perm solüsyonu ekleyin. Numuneyi bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. PI yaması fikse edildikten sonra, beş dakika boyunca bir mililitre perm yıkama tamponunda bekletin.Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Ardından örneği bir mililitre bloklama tamponuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bloklama adımının ardından, anti mouse GP two monoklonal antikoru beş mikrogram/mililitre nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin ve M hücrelerini boyamak için örneği dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.Ardından, örneği daha önce olduğu gibi yıkayın. Konjuge antikor için ikincil bir katman ekleyin ve örneği buz üzerinde, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. Örnek boyandıktan sonra, örneği PBS içinde nazikçe yıkayın.Ardından, bir lam üzerine üç veya dört adet dairesel kapatma camı yerleştirin ve pires yamasını PBS içinde %30'luk gliserol çözeltisinin 200 µL miktarıyla gömün. Numuneyi gözlemlemek için lam üzerinde bir DM IRE iki konfokal lazer mikroskobu veya bir Delta vision restorasyon dekonvolüsyon mikroskobu kullanın. Bu görüntüde, yeşil GFP ile işaretlenmiş salmonella typhimurium'un, apikal plazma membranında kırmızı renkte gösterilen GP iki ile çevrelendiği görülebilir.Bu döndürülmüş görüntüde, bakteriler subapikal sitoplazmik veziküller içerisinde görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, ligasyonlu pys intestinal Lu deneyi kullanılarak M hücreleri ile bakteriyel transitozun nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

application-mouse-ligated-peyers-patch-intestinal-loop-assay-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bir fare modelinde bağırsak geçirgenliğini incelemek için bir ileal döngü modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Bu yöntem, epitelyal bariyer fonksiyonunu ve buna bağlı immün yanıtı anlamak için canlı bir model sağlar.

Fare ileal döngü modeli: farede bağırsak geçirgenliğini incelemek için cerrahi bir model

Bu videoda, fare proksimal kolon halkası veya pcLoop segmenti oluşturmak için cerrahi bir prosedürü ve ardından bağırsak epitel geçirgenliğini incelemek için segmente intraluminal floresan belirteçleri enjeksiyonunu açıklıyoruz.

Fare Proksimal Kolon Döngü Modelinin Oluşturulması: İntraluminal Enjeksiyonu Takiben Serumda Floresan İşaretleyicilerin Saptanmasıyla Proksimal Kolon Halkası Oluşturmak ve Bağırsak Geçirgenliğini Ölçmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Bu protokol, eksize edilmiş bağırsak dokusu preparatlarının veya "bağırsak keselerinin" bağırsak bariyer fonksiyonunun ex vivo modeli olarak kullanımını tanımlar. Bu model, sindirim hastalığının hayvan modellerinde belirli bağırsak bölgelerinde hem epitel bariyerinin hem de mukoza jel tabakasının bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için

Burada, farklı fare dokuları içindeki IL-22 üreten hücreleri görselleştirmek için bir transgenik raportör fare modelini açıklıyoruz. Bu yöntem, faredeki diğer sitokinlerin veya salgı proteinlerinin yerini izlemek için kullanılabilir.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Burada, küçük bağırsak hasarının önemli uç noktalarını ve proliferatif belirteçleri ve kemoterapi kaynaklı Mukozit modeli kullanılarak telafi edilen hiperproliferasyonu oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Biz bir hücre döngüsü özel marker kullanarak proliferasyon hücrelerin tespiti ve küçük bağırsak ağırlığı kullanarak göstermek, Crypt derinliği, ve uç noktaları olarak villus yüksekliği.

Kemoterapiye bağlı Mukozinin fare modelini kullanarak küçük bağırsak yaralanmasını ve uyarlamasını değerlendirmek için önemli uç noktalar ve proliferatif Işaretçiler

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu çalışmada, intestinal manipülasyon ile oluşturulan postoperatif ileusun bir murin modeli tanımlanmıştır. Gastrointestinal geçiş fonksiyonu, patolojik değişiklikler ve immün hücre aktivasyonu ameliyattan 24 saat sonra değerlendirildi.

Ameliyat Sonrası İleus Murin Modeli

Bu çalışma, salgılanan mukusu ölçmek için tam montajlı bağırsak dokuları ve çoklu foton mikroskobu kullanan bir 3D görüntüleme yöntemi sunarak, karbamoilkolin klorür gibi uyaranlara yanıt olarak mukus dinamiklerinin hassas hacimsel analizini ve görselleştirilmesini sağlar.

Tam Montajlı Doku Görüntüleme Kullanılarak Bağırsak Mukusunun Üç Boyutlu Miktar Tayini

Öğrenin fare Peyer's patch'lerinde M hücreleri tarafından bakteriyel alımı değerlendirmek için bağırsak loop testi yöntemini. Bu teknik konfokal mikroskopi ile bakteri translokasyonunu görselleştirir ve mukozal bağışıklık yanıtlarını incelemeye olanak tanır.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Daha fazla video keşfet