Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak mukozal bağışıklık sistemi içinde yer alan M hücreleri tarafından bakteriyel alımı incelemektir. Bu prosedürün ilk adımı, anestezi altındaki bir farenin bağırsak Peyer plaklarını açığa çıkarmak ve bağlamaktır. Ardından, bağlanan bölgeye floresan işaretli bakteriler enjekte edilir.

Bir saat sonra, pyres yamaları eksize edilir. Ardından dokudaki hücrelere M hücresi belirteci olan GP2 için permeabilizasyon ve boyama uygulanır. Son olarak, örnekler konfokal mikroskop kullanılarak gözlemlenir ve M hücreleri tarafından transkitoz edilen bakteriler görselleştirilebilir.

M hücreleri aracılığıyla gerçekleşen bakteriyel transkitozun moleküler temeline dair içgörü sağlamanın yanı sıra, bu yöntem diğer sistemlere de uygulanabilir. Örneğin, bu protokol klor ve mikrop kullanılarak inflamatuar bağırsaktaki hücre geçirgenliğinin değerlendirilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. Steril bir cam yayma çubuğu kullanarak floresan işaretli bakterileri bir LB agar plağına ekle ve tekil koloniler görünene kadar plağı 37 °C'de inkübe et. Katı agar üzerinden tek bir koloni seç ve bunu iki mililitre taze LB besiyerine inoküle et.

Ardından bakterileri 37 °C'de bir çalkalayıcıda gece boyunca kültüre edin. Başlangıç kültürü büyüdüğünde, 500 µL bakteriyi 4,5 mL LB besiyerine aktarın ve bu yeni kültürü, 600 nm'deki optik yoğunluğu bakteriyel büyümenin log fazda olduğunu gösteren 1 değerine ulaşana kadar veya üç ila dört saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bu noktada, bakterileri toplamak için kültürü 4 °C'de 3000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj sonrası süpernatantı atın ve peleti 5 mL steril PBS ile yıkayın. Yıkama adımını tekrarladıktan sonra bakterileri 5 mL PBS içerisinde yeniden süspanse edin.

Fareyi sürekli izofluran anestezisi altına aldıktan sonra, steril aletler kullanarak farenin karnını aseptik şekilde açın. İnce bağırsağı açığa çıkararak başlayın ve payer plaklarını (PI's patches) bulun. Payer plakları bulunduğunda, steril dikiş ipi kullanarak bağırsağı plağın bir yanından yaklaşık beş milimetre uzaklıktan bağlayın.

Prosedür sırasında kan damarlarının kesilmemesine dikkat edin. Bağırsak bağlandıktan sonra, bir şırınga kullanarak, bağlanan bağırsak döngüsünün serbest kalan tarafına 10⁷ CFU konsantrasyonunda 50 µL bakteriyel süspansiyon enjekte edin. Ardından, bağırsağın diğer tarafını ip kullanarak bağlayın.

Fare firarenin karnını bir klipsle kapatın ve fareyi ötanazi yapmadan önce bir saat boyunca anestezi altında tutun. Peyer plaklarını toplamak için, Peyer plaklarını dikkatlice kesin. Ardından, PI plağının apikal tarafını yıkamak ve fazla mukozal sıvıyı ve bakterileri uzaklaştırmak için, toplanan bağırsak bölümünden birkaç kez kuvvetlice PBS geçirin.

PI yaması yıkandıktan sonra, 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin ve cyto effects veya cyto perm solüsyonu ekleyin. Numuneyi bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. PI yaması fikse edildikten sonra, beş dakika boyunca bir mililitre perm yıkama tamponunda bekletin.

Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Ardından örneği bir mililitre bloklama tamponuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bloklama adımının ardından, anti mouse GP two monoklonal antikoru beş mikrogram/mililitre nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin ve M hücrelerini boyamak için örneği dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.

Ardından, örneği daha önce olduğu gibi yıkayın. Konjuge antikor için ikincil bir katman ekleyin ve örneği buz üzerinde, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. Örnek boyandıktan sonra, örneği PBS içinde nazikçe yıkayın.

Ardından, bir lam üzerine üç veya dört adet dairesel kapatma camı yerleştirin ve pires yamasını PBS içinde %30'luk gliserol çözeltisinin 200 µL miktarıyla gömün. Numuneyi gözlemlemek için lam üzerinde bir DM IRE iki konfokal lazer mikroskobu veya bir Delta vision restorasyon dekonvolüsyon mikroskobu kullanın. Bu görüntüde, yeşil GFP ile işaretlenmiş salmonella typhimurium'un, apikal plazma membranında kırmızı renkte gösterilen GP iki ile çevrelendiği görülebilir.

Bu döndürülmüş görüntüde, bakteriler subapikal sitoplazmik veziküller içerisinde görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, ligasyonlu pys intestinal Lu deneyi kullanılarak M hücreleri ile bakteriyel transitozun nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.