Name: Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer Morfolojisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin Aspergillus niger'in mikropartikül kullanarak morfolojisini özelleştirme ve üretkenlikle ilişkilendirme yöntemini. Bu biyoteknoloji protokolü filamentli mikroorganizmaların morfojenez anlayışını geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle Technische Universität Braunschweig, Almanya&#39;da &quot;Gen itibaren Ürün için&quot; ortak araştırma merkezi SFB 578 ile Alman Araştırma Topluluğu (DFG) tarafından sağlanan mali destek için minnettarım.

1. Yetiştiği Reaktör Kurulum ve Başlangıç Toplam 4 biyoreaktör kültivasyonları gerçekleştirilmektedir. <ol><li> A. ekimi için 2.2 L bir çalışma hacmi ile 3 L karıştırılan tank biyoreaktör kullanın Nijer SKAn1015. </li><li> Reaktöre 72,6 g glukoz monohidrat dökün ve 1,9 L deiyonize su ile doldurunuz. </li><li> 3 gibi tamponlar olarak reaktör ekipmanları, iki altı kanatlı diski türbin çarkı, pH elektrodu, hava filtresi ile bir gaz girişi, bir soğutma parmak, hava filtresi ile bir egzoz hava soğutucu, hava filtresi ile steril örnekleme için daldırma tüp yükleyin orta, inokulum, asit ve baz ve giriş hortumlarının. </li><li> 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de reaktör otoklava. </li><li> Asit-baz rezervuar (2 M HCl, 2 M NaOH) ve ilgili pompaları ile reaktör bağlayın ve pH kontrol ünitesi ile 5.0 bir pH değeri ± 0.05 kurmak. </li><li> Soğutma suyu sistemi ile birlikte reaktöre bağlamak ve ısıtma ceketi koymakreaktör damar etrafında. </li><li> İlgili kontrol ünitesi ile sıcaklık sensörü takın ve 37 lik bir sıcaklık kurmak ± 0.1 ° C sıcaklık kontrol ünitesinde. </li><li> Reaktörün tepesine ajitasyon motoru Fit ve 200 dk -1 bir ajitasyon hızı ile hizmet getirmek. </li><li> Steril minimal büyüme ortamında 11 oluk steril bir giriş hortumlarının (250 mL) içinde bir ekleme. Orta hazırlanması için, tüm bileşenler 20 dakika süreyle 121 ° C&#39;de otoklavda ve karıştırılmıştır. Üç kültivasyonları için bileşenleri talk 1 g / L arasında konsantrasyonlarda tozu (3MgO • • 4SiO 2 H 2 O) (reaktör 2), 3 g / L (reaktöre 3) ve 10 g / L (reaktör 4) içerir. Kullanmadan önce, 50 mM sodyum asetat tampon (pH 6.5) içinde mikro parçacıklar yeniden askıya ve steril besiyeri ekleyin. Kontrol kültürlerinde (parçacıklar olmadan) 50 mM sodyum asetat tampon (pH 6.5) ile mikro partikül süspansiyon yerini alır. </li><li> Spor süspansiyon (inokulum) bir ekles Wucherpfennig et hazırlanmıştır. diğerleri (2011) 11 bu nedenle çukur steril bir giriş hortumlarının (50 mL) içinde bir 6 olduğu 1x10 mL -1 sporların miktarda konsantrasyonu. Inokülasyon ekiminin başlangıcı (h = 0 h) işaretler. </li><li> 1.0 L dk -1 oranı ile havalandırma başlayın. </li></ol> 2. Steril 24 sonra Örnekleme, 48 ve Yetiştirme 72 saat <ol><li> Bir flacon tüp içine steril kültür bulyonu 50 mL al. </li><li> Biyokütle kuru ağırlık, β-fructofuranosidase aktivite ve mikroskopik analiz belirlenmesi için numune kullanın. </li></ol> 3. 24 sonrası Biyokütle Kuru Ağırlık Tayini, 48 ve Yetiştirme 72 saat <ol><li> Biyokütle numuneleri en az iki kez alınmalıdır. </li><li> Ağırlık desikatörde kuruma ve bağlı su jeti vakum pompası ile Büchner huni filtre yerleştirdikten sonra bir mikro ölçeklerde bir selüloz filtre. </li><li> Tanımlanmış bir numune hacmi (örneğin 10 mL) bir filtrend biyokütleden orta bileşikler kaldırmak için 10 ml deiyonize su ile filtre durulayın. </li><li> Kırışıklık filtresi kez ortasında, bir cam petri koyun ve ağırlık sabitliği (en az 24 saat) kadar kurutma bölmesine koydu. </li><li> Bir desikatörde filtre soğutulur ve ağırlık ölçer. </li><li> Ve kullanılan örnek hacmi bölünmesiyle kurutulmuş biyokütle olmadan filtre ağırlığı arasındaki fark olarak biyokütle kuru ağırlık hesaplayabilir. </li></ol> 4. 24 sonrası TANRI / POD-kompozisyon ile β-fructofuranosidase ve Ekstrasellüler Enzimatik aktivitenin belirlenmesi, 48 ve Yetiştirme 72 saat Onlarla çalışırken sürekli buz örnekleri saklayın. <ol><li> Filtre 1.5 mL kültür süspansiyonu bir reaksiyon teknesi tüp içine filtre aracılığıyla bir şırınga ile kültür süspansiyon basarak bir selüloz asetat filtre. Kullanıma kadar -20 ° C&#39;de reaksiyon tüpü saklayın. </li><li> Reaksiyon karışımı 20 kullanmak içinuL numune ve glikoz sukroz gelen tepkimesini başlatabildiği için 0.05 M fosfat tampon maddesi (pH 5.4) içinde çözülmüş, 1,65 M sakaroz ve 200 uL ekleyebilir. En azından reaksiyonunu Cary çoğaltın. </li><li> Bir ısıtma blok içinde 20 dakika süreyle 40 ° C&#39;de inkübe Reaksiyon karışımı. Bir ısıtma blok içinde 10 dakika süreyle 95 ° C&#39;de kuluçkaya reaksiyonu durdurmak. Buz üzerinde saklayarak Reaksiyon karışımı soğutulur ve 10 dakika 4 ° C&#39;de 13,000 g&#39;de için santrifüj ile kondanse su aşağı doğru dönmeye </li><li> PH ve glikoz sakkaroz sıcaklığa bağlı bölünme dikkate almak için, 20 uL deiyonize su yerine 20 uL örnek kullanarak boş bir değer yürütmek. </li><li> Kültür suyu kalıntı glukoz dikkate almak için, her bir örnek için negatif bir kontrol yürütmek. Bu amaçla kullanılması 20 numune uL ve sukroz ve ilave olarak adım 4,3 tarif inkübe önce 10 dakika süreyle 95 ° C&#39;de ısıtılarak β-fructofuranosidase inaktive etmek için. </li><li> Öyle ki örnekleri aşağıdaki ölçüm seyreltilirçıkılması önlenmektedir adsorpsiyon kalibre edilmiş bir değer aralığı içindedir. </li><li> Üç kopya olarak tüm enzimatik testler yapın. Iyi bir mikro titrede plaka 2 uL seyreltilmiş numune uygulayın. Yerine 2 uL örnek on farklı Know konsantrasyonlarda (1 mM ile 15 mM) ile on glukoz çözümleri 2 uL kullanarak her tarafından mikro titre plaka üzerinde kalibrasyon için bir standart uygular. Sıfır noktası kalibrasyon 2 uL deiyonize su yerine 2 uL örnek kullanmak için. </li><li> Bir çok pipet kullanılarak her oyuğa reaktifi çözeltinin 200 uL ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> 6 mikro titre plakası Mağaza ° ölçümü (en az birkaç saat) kadar C. </li><li> Bir 96-Gün Doğumu mikro plaka okuyucu ve Magellan veri alma yazılımı kullanılarak 450 nm dalga boyunda absorpsiyon ölçün. 5 sn karıştırma zamanı ayarlayın. ve en fazla 1 sn dinlenme süresi. </li><li> Elektronik tablo ile sonuç grafiği açın ve standart aralığı kullanarak bir kalibrasyon hat inşa: glucose konsantrasyonu = Bir X emme + b </li><li> Aktivite hesaplayın: aktivite = (soğurma X sulandırma faktörü-boş değer) X a + b </li><li> Örnek etkinlikleri ve uygun negatif kontrol arasındaki fark hesaplanarak β-fructofuranosidase aktivite bulmaya çalışın. </li><li> Hesap biyokütle kuru ağırlığı ve β-fructofuranosidase aktivite 11 dikkate alarak aşağıdaki kullanım için özel verimlilik hesaplayın. </li></ol> 5.. Yetiştiği 72 saat sonra Mikroskopi ve Otomatik Görüntü Analizi <ol><li> Yer yaklaşık 3 ml kültürü bir plastik Petri kabındaki süspansiyon vemorfolojik özellikleri ayrılır kadar fizyolojik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilmiş. </li><li> Entegre veya bağlı kamera, mikroskop altında Petri, kalorifer. Örnek başına morfolojik yapıları yaklaşık 100 görüntü (Şekil 2) edinin ve kaydedin. Her bir fotoğraf, en az bir nesne tamamen resmedilmiştir dikkat ediniz. </li><li> Görüntü işleme programı ImageJ 12 ile aynı örnek tüm görüntüleri açın. Süreci aracını kullanarak siyah ve beyaz (Şekil 2) &quot;İkili olun&quot; görüntüleri dönüştürün. Görüntülerin dizi için komut uygulamak için aşağıdaki gibi bir makro kodunu kullanabilirsiniz. çalıştırın (, İkili Yap &quot;) </li><li> Tekrar ImageJ ile işlenmiş ikili görüntüleri açın. Şekil faktörleri Feret çapı, projeksiyon alanı, çevre, dairesellik, boy oranı, analiz aracı &quot;Ölçüm&quot; ile her görüntü için yuvarlaklık und sağlamlığına hesaplayın. Bir seri için komutu uygulamak içinGörüntülerin es aşağıdaki gibi bir makro kodunu kullanabilirsiniz. (&quot;8 bit&quot;) çalıştırın; (&quot;İkili Yap&quot;) çalıştırabilirsiniz; (&quot;Set Ölçeği ...&quot;, &quot;mesafe = X bilinen = 1000 piksel = 1 birim = mikron küresel&quot;) çalıştırabilirsiniz; (&quot;Set Ölçümleri ...&quot;, &quot;alan çevre şekli Feret sınırlarını ekran = Yok ondalık = 3 yönlendirme&quot;) çalıştırın; (&quot;Parçacıklar Analiz ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity dairesellik = 0,00-1,00 gösterisi = ekran Outlines&quot;) çalıştırın; Bir ölçek çubuğu üzerinde düz bir çizgi oluşturarak 1000 mikron ilişkilendirir piksel sayısını X olarak belirleyin. Mikron ölçeğinde in çubuk uzunluğu ile düz çizgi arasında piksel sayısını ilişkilidir. </li><li> Elektronik tablo ile her resim için şekil faktörü değerleri içeren sonuç grafiği açın. Her bir görüntü için aşağıdaki bir Morfoloji sayısını hesaplayın. <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Değer ve dikkate bir örnek tüm fotoğraf çekmek Morfoloji numarası için standart sapma hesaplanır. </li&gt; <li> Özel verimlilik ile Morfoloji sayıda grafik korelasyon için bir grafik ve veri analizi programı kullanın ve matematiksel regresyon ile matematiksel ilişkiyi belirler. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Talk mikro parçacıklar A. eklenmesiyle Nijer Skan 1015 morfoloji gerçek bir pelet morfolojiden dağınık bir hatta misel morfolojisi değişti. Pelet morfolojisi standart koşullar sergilenmektedir Oysa bir misel morfolojisi talk mikro parçacıklar 10 g / L (Şekil 4). Orta takviyesi tarafından oluşturulur. Aynı zamanda β-fructofuranosidase aktivitesini 3 kat 3-5 etrafında arttırır. 1 ya da 3 g / L talk pudra bir takviye bir katına fructofuranosidase aktivitesi (Şekil 4). Ile, bir dağılmış morfolojisi yol açar. Mikro partikül bağımlı morfolojisi kapsamlı Mor tarafından tarif edilebilirOtomatik görüntü analizi ile belirlendi parametreleri kullanılarak hesaplanabilir yapıdaki sayısı. Mükemmel yuvarlak ve yumuşak granül mikroskobik görüntüleri mükemmel daireler olarak görünür. Bu tür partiküller için morfoloji numarası 1 bir değere sahiptir. Misel morfoloji en küçük parçası 0 bir Morfoloji numarası veren tek boyutlu bir hat olarak basitleştirilmiş olabilir. Uzamış düzensiz pelet veya öbekler gibi tüm ara morfolojik formları nedenle 0 ve 1 arasında değerler olacaktır. Oldukça büyük partiküller oldukça düşük sayıda morfoloji 11 geniş bir yüzey veya ince uzun parçacıklar yüksek bir mantar partikülleri, sonuçlanacaktır. Standart şartlarda reaktör 1 morfolojisi sergileyen 0,8 etrafında bir Morfoloji numarası. 10 g / L talk pudra ile birlikte reaktöre 4 morfolojisi 0,1 etrafında bir Mn sahiptir. 1 ve 3 g / L, talk pudra konsantrasyonları ile reaktörler 2 ve 3 için Morfoloji sayısı dağınık bir biçim gösteren, bu iki uç arasında yer almaktadırlogy. Mikro partikül bağımlı morfolojisi yakından β-fructofuranosidase verimliliği ile ilgili olduğundan, Şekil 5&#39;e benzer Morfoloji sayısı ve verimlilik matematiksel bir korelasyon elde edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel tasarım ve analitik prosedür genel şeması. A. Nijer 72 saat boyunca tankı biyoreaktör karıştırılmış bir 3 L (mikro parçacıklar olan veya olmayan) yetiştirilmektedir. 24 saat sonra, 48 ve 72 ha Örnek tekrar özel verimlilik hesaplanması için kullanılmaktadır biyokütle kuru ağırlık ve β-fructofuranosidase aktivitesi, belirlenmesi için alınır. 48 saat sonra mantar morfolojisi mikroskopta incelenir ve dijital görüntü analizi ile karakterizedir. Görüntü analizi ve ilgili parametrelerin matematiksel özel verimlilik ile korele bir Morfoloji numarası için birleştirilmiştir. <imgalt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. A. morfolojik yapılarının mikroskobik oluşturulan görüntüler için görüntü işleme Aşamaları Nijer. Adım 1: mikroskopta görüntü elde etme. Adım 2: görüntü iyileştirme gerekirse. Adım 3: Görüntü İkiye Ayırma, ImageJ üretilen siyah-beyaz (ikili) görüntü. Adım 4: ikili görüntü ile işlenir ve istenmeyen bir nesne temizlenir. Adım 5: morfolojik analiz açık kaynak program İmageJ olan &quot;parçacıklar Analiz&quot; fonksiyonu ile yapılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Şekil 3. A. Farklı morfolojik katma mikro parçacıklar konsantrasyonuna bağlı Nijer. Mikro parçacıklar sayesinde artan konsantrasyonu pelet boyutu tam olarak küçük bir çekirdek kabuğu topakları, küçük sürüler ve hatta serbestçe dağılmış misel kadar azaltılabilir ekledi. As Morfoloji mühendisliğibatık kültüründe mikro partikül takviyesiyle pergillus Nijer SKAn1015. Olmadan mikro (A), 10 mg / L (B), 0.1 g / L (C), 0.2 g / L (D), 0.3 g / L (E), 0.6 g / L (F), 1.0 g / L (G), 1.5 g / L (H), 2.0 g / L (I), 2.5 g / L (J), 3.0 g / L (K), 3.5 g / L (L), 4.0 g / L (M g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) ve), 4.5 g / L (N), 5.0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 40-50 g / L (T). Görüntüler ekiminin 72 saat sonra ışık mikroskobu alınmıştır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Şekil 4. Bağımlılığı in Fructofuranosidase aktivitesi talk mikro partikül konsantrasyonu 1 g / L (reaktör 2), 3 g / L (reaktöre 3) ve 10 g / L (reaktör 4). Reaktör 1 mikro partikülleri ilave edilmez; burada kültivasyonu standart koşullar altında yapılır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Şekil 5. Morfoloji Temsilcisi iyi bir korelasyon (R 2 = 0.91)numarası ve spesifik üretkenliği. Morfoloji numarası özel verimlilik (ordinat) karşı (apsis) çizilir. Doğrusal olmayan regresyon üstel korelasyon verir.

<ol><li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWucherpfennig%2C+T+%22Advances+in+Applied+Microbiology%22">Advances in Applied Microbiology</a>. 72, Academic Press. 89-136 (2010).</li>
<li>Driouch, H., Hänsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger%3A+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li>
<li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li>
<li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fungi+in+good+shape%3A+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered+Bugs%22%5BJournal%5D)">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li>
<li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li>
<li>Kaup, B. -A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms%3A+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li>
<li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li>
<li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li>
<li>Zuccaro, A., GÃ¶tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li>
<li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+glucose+oxidase%2C+peroxidase%2C+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li>
<li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5(2006).</li>
</ol>

Ben ifşa hiçbir şey yok.

Mantar morfolojik değişiklikler, uzun yıllar beri biyoteknoloji ilgi olmuştur. Farklı çalışmalarda, pH değeri, güç girişi, sıcaklık, orta besinlerin veya inokulum konsantrasyonu 1 olarak seçilen proses parametreleri değiştirmek için çalıştı, ama aksine morfolojisi oldukça özensiz ve eksik kontrolü, yüksek enerji maliyetleri, önleme etkisi veya ürün istikrarsızlık, acı var parçacıklarının mikro takviyesi parçacık boyutu ve konsantrasyon ince ayarlanmış değişimi yoluyla fungal morfolojisi kesin bir mühendislik sağlar. Bu yeni olanaklar A. ile biyoteknolojik üretim optimizasyonu ve yüksek üreten morfoloji ısmarlama tasarım için mikro parçacıklar kullanmak açar Nijer ve diğer ipliksi mikroorganizma. Dijital görüntü analizi fungal makro morfolojisi karakterize etmek için kolay bir tekrarlanabilir bir yöntemdir. Ancak, boyut, şekil ve yüzey karakteristik için parametrelerin çeşitliLiteratürde tanımlanan morfolojik yapıları ter karmaşık mantar morfoloji hızlı değerlendirme yapar. Ilgili parametrelerin bir birleşimi olarak sunulan Morfoloji sayısı, bu eksikliği ortadan kaldırır ve morfolojik yapılarının kapsamlı karakterizasyonu için değil, aynı zamanda verimliliği ile doğrudan matematiksel bir korelasyon için sadece kullanılabilir. Bu da mümkün ihtiyacı süreci için verilen morfolojisi ve bu nedenle morfolojisi bir özelleştirme ile verimlilik tahmini vermektedir. Morfoloji numarasını kullanarak, çeşitli pelet ve ağır adımlarla yürümek morfolojileri 4,5 ayırt etmek mümkündür. Morfoloji sayısının daha da geliştirilmesi için fraktal boyutunun dikkate umut vermektedir. A fraktal boyut bir nesne 13 özellikleri dolum karmaşıklığı ve kütlesinin bir ölçüm vermekte ve bu nedenle misel morfolojisinin bütünsel karakterizasyonu için predestinated edilir. Crmisel büyüme formu daha önce çok daha büyük bir kültür suyu viskoziteleri 2 sergiledikleri gösterilmiştir çünkü yüksek üreten misel morfolojisi eation Ancak, özellikle büyük ölçekli ekimi işlemi performans sorunlarına yol açabilir. Bu ısı ve kütle transferi ve daha yüksek bir güç girişi ve 1 işletmek ekimi daha pahalı hale gerektiren durgun olmayan karışık bölgeleri, oluşumu ile ilgili sorunlara yol açabilir. Morfolojisi değişen ve daha modellerinde dahil edilebilir, bu nedenle fungal morfoloji ve kültür bulyonu viskozite arasındaki ilişkiyi göz önüne alınmalıdır.

ve Özelleştirme aspergillus nijer</emtalk mikro parçacıkların toplama yoluyla> morfolojisi

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Ipliksi mantar A. Nijer gıda ilaç endüstrisi için endüstriyel süreçleri geniş bir yelpazede yaygın olarak kullanılan bir türdür. Bu ipliksi organizmanın en ilgi çekici ve çoğu zaman kontrol edilemeyen özelliklerinden biri karmaşık morfolojisini. Bu yoğun küresel pelet viskoz miselyumla (Şekil 1) arasında değişmektedir. Çeşitli proses parametreleri ve malzemeyi fungal morfolojisi 1 etkilemekte olarak da bilinirler. Optimum verimlilik, belirli bir morfolojik yapısı ile güçlü bir korelasyon bu yana, mantar morfolojisi genellikle, sanayi üretiminde verimlilik darboğaz temsil eder. Kesin morfolojik şeklini kontrol A yalındır ve zarif yaklaşımı artan enzim üretimi 2-6 katkıda kültür ortamına inorganik çözünmeyen mikro partiküller (sulu magnezyum silikat, alüminyum oksit veya titanyum oksit, silikat gibi) eklenmesidir. Bir obv olmadığındanmikro partikül bağımlı morfolojisi ve enzim üretimi arasındaki ious ilişki matematiksel olarak verimlilik ve morfolojik görünüm bağlamak için arzu edilir. Bu nedenle kantitatif bir kesin ve bütünsel morfolojik tanımlama hedeflenmektedir. Böylece, biz üretmek ve karakterize mikro partikül bağımlı morfolojik yapıları ve muhtemelen ipliksi mikroorganizmaların morfonogenezi daha iyi anlaşılmasına katkıda verimlilik (Şekil 1) mantar morfoloji ilişkilendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Rekombinant suşu A. Nijer SKAn1015 tankı biyoreaktör karıştırılmış bir 3 L 72 saat için yetiştirilmektedir. G / L önceden aşılama için 1 g / L, 3 g / L ve 10 konsantrasyonda talk mikro partiküllerinin eklenmesi ile morfolojik özellikleri çeşitli çoğaltılabilir şekilde oluşturulur. Steril örnekleri üretilen enzim büyüme ve gelişme aktivitesinin belirlenmesi için 24, 48 ve 72 saat sonra alınmıştır.oluşan ürün değeri yüksek enzim β-fructofuranosidase, gıda ya da diğerleri arasında glukoz 7-9 için sukroz reaksiyonu katalize ilaç sanayi, neo-şeker oluşumu için önemli bir biocatalyst olduğunu. Bu nedenle, sukroz eklendikten sonra glikoz miktarının üretilen β-fructofuranosidase miktarı anlamına gelmektedir. Glikoz miktar 96-kuyucuklu plaklar içinde mikro titre yüksek verim analizi için değiştirilmiş bir GOD / POD-Assay 10 tarafından yapılmaktadır. 72 saat sonra Mantarların morfolojisi mikroskopta incelenir ve dijital görüntü analizi ile karakterizedir. Bunu yaparken, Feret çapı gibi mantar makro morfolojisi, projeksiyon alanı, çevre, dairesellik, boy oranı, yuvarlaklık und sağlamlık için parçacık şekli faktörleri açık kaynak görüntü işleme programı ImageJ ile hesaplanır. İlgili parametreleri kapsamlı bir karakterizasyonu sağlayan bir boyutsuz Morfoloji numarası (Mn) 11, birleştirilerekmantar morfolojisi. Morfoloji sayısı ve verimlilik yakın bir ilişki matematiksel regresyon ile vurgulanır.

Tam olarak oluşturmak ve kapsamlı ipliksi mantar morfolojisi karakterize bir yöntem<em&gt; Aspergillus Nijer</em&gt; Morfolojik görünüm ve verimlilik matematiksel bir korelasyon olanak sağlayan açıklanmıştır.

Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer</emTalk Mikro Parçacıkların toplama yoluyla> Morfolojisi

Filamanöz fungus A. niger, gıdadan ilaç endüstrisine kadar geniş bir yelpazedeki endüstriyel süreçlerde yaygın olarak kullanılan bir suştur. En ...

Bu yöntem, fungal morfoloji ile üretkenlik arasındaki ilişkiyi saptamak amacıyla, filamentli fungus olan aspergillus Niger'in mikropartikül bağımlı morfolojik yapısını oluşturur ve karakterize eder. Spesifik üretkenliği hesaplamak için sekiz Niger'i, üç litrelik karıştırmalı tank biyoreaktörde mikropartiküllerle veya mikropartiküller olmadan 72 saat boyunca kültüre edin. Belirlenen zaman noktalarında örnekler alın ve biyokütle, kuru ağırlık ve β-fruktosidaz aktivitesini belirleyin.72 saat sonra, fungal morfolojiyi mikroskopi ile inceleyin ve dijital görüntü analizi ile karakterize edin. Ardından, görüntü analizinin ilgili parametrelerini, spesifik üretkenlik ile matematiksel olarak ilişkili olan bir morfoloji numarasında birleştirin. Sonuç olarak bu yöntem, filamentöz mikroorganizmaların morfojenezini daha iyi anlamak için Aspergillus niger morfolojisini hassas bir şekilde oluşturabilir ve kapsamlı bir şekilde karakterize edebilir.Aspergillus niger, onlarca yıldır biyoteknolojide önemli bir endüstriyel iş gücü olmuştur. A. niger ve ilgili türlerin en ilgi çekici ve genellikle kontrol edilemeyen özelliklerinden biri, kültür koşullarına bağlı olarak yoğun küresel peletlerden viskoz misellere kadar uzanan karmaşık morfolojileridir. Prosedürümüzün temel avantajı, mikropartiküllerin eklenmesi yoluyla fungal morfolojiyi artık özellikle proses ihtiyaçlarına göre özelleştirebiliyor olmamızdır.Şu ana kadar, fungal morfolojinin bu şekilde özelleştirilmesi için başka bir yöntem tanımlanmamıştır. Bu yöntem, filamentöz mikroorganizmaların kültivasyonuna ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çünkü endüstriyel uygulamalar için fungal morfolojiyi kontrol etmek ve ayrıca yüksek verimli bir fungal morfoloji ile düşük verimli olanı birbirinden ayırt etmek kritik öneme sahiptir.Protokolümüz, fungal morfolojinin istenilen şekilde özelleştirilmesi ve karakterizasyonu için gerekli araçları sağlamaktadır. Bu yöntem, Aspergillus niger morfolojisi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, Penicillium veya Streptomyces suşları gibi diğer filamentli mikroorganizmalara da uygulanabilir. Eşlik eden protokolde detaylandırıldığı üzere, steril kültürler için dört biyoreaktör hazırlayın.Mikropartikül ilavesine dayanan metin; farklı morfolojilere sahip Aspergillus niger kültürlemesi. 72 saat sonra, 50 mililitre kültür sıvısı örneğini bir Falcon tüpüne aktarın.Biyokütle örnekleri, desikatörde kurutulduktan sonra en az iki kez paralel olarak alınmalıdır; selüloz filtre mikroskala ile tartın. Filtreyi, su jetli vakum pompasına bağlı bir büchner hunisine yerleştirin; önce 10 mililitre örneği, ardından biyokütleden ortam bileşiklerini uzaklaştırmak için 10 mililitre deiyonize suyu filtreleyin. Filtreyi ortadan bir kez katlayın.Cam bir petri kabına yerleştirin ve sabit ağırlığa ulaşana kadar kompartıman kurutucuda bekletin. Filtreyi bir desikatöre aktarın ve soğumasını bekleyin. Ardından ağırlığı ölçün.Glukoz oksidaz ve peroksidaz enzim analizleri için ağırlık hesaplaması, filtre farkı ve ardından örnek hacmine bölünme yoluyla litre başına biyokütle kuru ağırlığını hesaplayın. Örnekleri 1,5 mililitrelik bir şırınga geçişi kullanarak buz üzerinde saklayın. Kültür süspansiyonunu bir selüloz asetat filtre aracılığıyla bir reaksiyon tüpüne aktarmak beta frukto SASE analizini gerçekleştirir.İstatistiksel sağlamlık için iki üçlü örnek kullanarak başarıyı titizlikle sağlıyoruz. Analize başlamak için test tüpüne 20 µL örnek ekleyin; sakkarozun glikoza parçalanmasının pH ve sıcaklık bağımlılığını kontrol etmek için 20 µL örnek yerine 20 µL deiyonize su kullanın. Ayrıca, her örnek için kültür besiyerindeki kalıntı glikoz miktarına yönelik bir negatif kontrol hazırlayın.Isı ile inaktive edilmiş numuneden 20 µL. Sukrozdan glikoza reaksiyonu başlatmak için 200 µL 1.65 molar sukroz çözeltisi ekleyin. pH 5.4'te 20 µL numune içeren tüm reaksiyon tüplerini 40 °C'lik bir ısıtma bloğunda 20 dakika boyunca inkübe edin. Tüpleri buz üzerinde soğuttuktan sonra, 95 °C'de 10 dakika ısıtarak reaksiyonu durdurun.Gerektiğinde örnekleri santrifüjleyin ve ölçülen absorbansın kalibrasyon değer aralığında olması için örnekleri analiz için seyreltin. Ardından, her reaksiyon için bir mikrotitrasyon plağına iki µL örnek ekleyin. Örnek ölçümlerini üç paralel (triplicate) olarak gerçekleştirin.Ayrıca, 1 mM ile 15 mM arasında değişen 10 glukoz çözeltisi için bir standart eğri hazırlayın. Sıfır noktası kalibrasyonu için 2 µL deiyonize su kullanın. Ardından, her birine 200 µL reaktif çözeltisi ekleyin.Kuyucuklar oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir. Absorpsiyon, 96 kuyucuklu bir sunrise Mikroplaka okuyucu ve Magellan veri geri çağırma yazılımı kullanılarak 450 nanometrede ölçülür. Sonuç grafiği bir hesap tablosuyla açılır ve bir standart eğri kalibrasyon hattı oluşturulur.Her bir örnek için aktiviteyi hesaplayın. Ardından, uygun negatif kontrol değerlerini örnek aktivitesinden çıkararak beta fruktosidaz aktivitesini belirleyin. Son olarak, biyokütle kuru ağırlığını ve beta fruktosidaz aktivitesini hesaba katarak spesifik üretkenliği hesaplayın.Üç mililitre kültür süspansiyonunu plastik bir Petri kabına yerleştirin ve morfolojik yapıları ayırmak için fizyolojik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltin. Mikroskobik görüntülerin kalitesi olağanüstü öneme sahiptir. Sonraki görüntü analizi için seyreltme aşamasında dikkatli olunmalıdır.Petri kabını, entegre kamerası bulunan bir mikroskobun altına yerleştirin. Her görüntüde en az bir nesnenin tamamen yer aldığından emin olarak, örnek başına morfolojik yapılara ait yaklaşık 100 görüntü elde edin ve kaydedin. Farklı reaktörlerden gelen örnekleri içeren kaplarla, her seferinde yeni görüntüler elde ederek aynı şekilde devam edin.Farklı miktarlarda talk pudrası eklenerek büyütülen farklı reaktörlerden alınan örneklerin farklı morfolojik büyüme formlarını not edin. Ardından, aynı örneğe ait tüm görüntüleri görüntü işleme programı Image J'de açın. İşlem aracını kullanarak görüntüyü binary (ikili) hale getirin.Komutu bir görüntü serisinin tamamına uygulamak için görüntüleri siyah beyaz hale getirin. Ardından bir makro kodu kullanın ve ölçek çubuğu içeren resimlerden birini açın. 2000 mikrona karşılık gelen piksel sayısını belirlemek için ölçek çubuğu boyunca düz bir çizgi çizin.Analiz aracını seçin, ölçümü ayarlayın ve şekil faktörleri, feret çapı, alan ve çevre seçeneklerini belirleyin. Bir dizi görüntüyü işlemek için bir makro kodu kullanın. Şimdi, şekil faktörü değerlerinin sonuçlarını tabloya döken hesap çizelgesini açın.Her görüntü için, tek bir örneğe ait tüm görüntülerle birlikte her bir görüntü için bir morfoloji sayısı hesaplayın. Morfoloji sayısı için ortalama değeri hesaplayın. Morfoloji sayısı ile spesifik üretkenliği grafiklemek için bir grafikleme ve veri analiz programı kullanın.Artan konsantrasyonlarda talk mikropartiküllerinin eklenmesi yoluyla matematiksel regresyon ile matematiksel ilişkiyi belirleyin. Sekiz Niger SKAN 10 15. Standart koşullarda beklenen pelet morfolojisi sergilenirken, morfoloji gerçek bir pelet morfolojisinden dağılmış veya hatta misel morfolojisine dönüşmüştür.İlginç bir şekilde, miselyal morfoloji, besiyerinin litre başına 10 gram talk mikropartikülleri ile takviye edilmesiyle oluşturulur. Eş zamanlı olarak, Beto Frukto tase aktivitesi yaklaşık üç kat artar; litre başına bir veya üç gram talk tozu takviyesi, otomatik görüntü analizi ile belirlenen parametreler kullanıldığında, fruktoz aktivitesinin iki katına çıktığı yaygın bir morfolojiye yol açar. Mikropartiküle bağlı morfoloji, morfoloji ile kapsamlı bir şekilde tanımlanabilir.Not düşülsün ki, pürüzsüz peletler halindeki tam yuvarlak parçacıklar mikroskobik görüntülerde mükemmel daireler olarak görünür. Morfoloji sayısı, standart koşullarda bire yaklaşan bir değere sahiptir. Birinci reaktördeki morfoloji, 0,8 civarında bir morfoloji sayısı sergilemektedir.Litre başına 10 gram talk pudrası içeren dördüncü reaktördeki morfoloji. Morfoloji sayısı 0,1 civarındadır. Litre başına bir ve üç gram talk pudrası konsantrasyonlarına sahip ikinci ve üçüncü reaktörler için morfoloji sayısı ise bu uç değerler arasında yer alarak dağılmış bir morfoloji sergilemektedir.Mikropartikül bağımlı morfoloji, beta fruktozit üretkenliği ile yakından ilişkili olduğundan, gelişimden sonra morfoloji, sayı ve üretkenlik arasında iyi bir matematiksel korelasyon bulunmaktadır. Bu teknik, biyoteknoloji alanındaki araştırmacıların fungal morfolojiyi ve özellikle bunun üretkenlikle olan ilişkisini daha ayrıntılı incelemesinin önünü açmıştır. Belirli morfolojik fungal çapraz tiplerin ayrıntılı oluşturulmasına yönelik bu prosedürün ardından, filamanlı mikroorganizma kültivasyonlarının diğer önemli yönleri araştırılabilir.Örneğin, misel morfolojisinin palat morfolojisinden çok daha viskoz olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, sürecin genel verimliliği, istenen ürünün saflaştırılması ve karşılaşılan sorunlar nedeniyle olumsuz etkilenmektedir. Belirlediğimiz morfoloji sayısı; kültür, protoloji ile ilgili modellerin oluşturulmasına yardımcı olacak ve genel olarak fungal morfolojiye dair anlayışımızı geliştirecektir.

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Taramalı elektron mikroskobu gözlemi için biyolojik örneklerin işlenmesindeki sorunlar arasında hücre çökmesi, ıslak mikro ortamlardan alınan örneklerin işlenmesi ve hücre tahribatı yer alır. Çiçek meristemleri, oomycete kistleri ve mantarlar (Agaricales) gibi zorlu numunelerin hazırlanması için uygun düşük maliyetli ve nispeten hızlı protokoller burada derlenmiş ve detaylandırılmıştır.

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Rpda gibi sınıf 1 histon uyku (hdacs), mantar enfeksiyonları tedavi etmek için potansiyel hedefler olarak önem kazanmıştır. Burada, histon deasetilaz inhibitörlerinin in vitro etkinliğini test etmesini sağlayan bir HDAC aktivite tahlil Ile birlikte tap-Tagged rpda ' nın spesifik zenginleştirme için bir protokol sunuyoruz.

Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Bu protokol zebra balığı larvalarında bir Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. Aspergillus sporları larvaların arka beyinlerine mikroenjeksiyona sokuldu ve immünosupresyona neden olmak için kimyasal tedavi kullanıldı. Enfeksiyon ilerlemesi, mantar büyümesini ve immün yanıtları ve canlı sporların koloni oluşturan birim kaplama ile numaralandırılmasını izlemek için günlük görüntüleme kurulumu ile izlenir.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

CRISPR-Cas9 genom düzenleme sistemi, model ve model olmayan türlerde kullanılan kullanımı kolay bir genom editörüdür. Burada, model olmayan bir ipliksi askomisetit mantarının çiftleme genine erken dur kodonu tanıtmak için kullanılan bu sistemin protein bazlı bir versiyonunu sıyoruz.

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Burada, süper emici polimer bazlı ototrofik sistemlerde arbusküler mikorizal mantarları aşılamak ve gözlemlemek için basit ve ucuz bir tekniği açıklıyoruz.

Süper Emici Polimer Bazlı Ototrofik Sistemlerde Arbusküler Mikorizal Kültürlerin Aşılanması ve Gözlemlenmesi

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Öğrenin Aspergillus niger'in mikropartikül kullanarak morfolojisini özelleştirme ve üretkenlikle ilişkilendirme yöntemini. Bu biyoteknoloji protokolü filamentli mikroorganizmaların morfojenez anlayışını geliştirir.

Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer Morfolojisi

Daha fazla video keşfet