Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Bu metodolojinin amacı, Taramalı Elektron Mikroskobu veya SEM altında en iyi gözlemleri için bitkilerden, oomycetes'ten ve mantarlardan elde edilen hassas dokuları ele almaktır. Bu yöntem, hemen hemen her mantar, mikrop, mor-forite ve bunların nasıl enfekte oldukları, kolonize oldukları ve konakçılarına nasıl bağlandıkları ile ilgili soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Geliştirilmiş metodolojimizdeki teknik, sucul ekosistemlerdeki mi-toh-minlerin bulunduğu numuneleri sabitlemek içindir.

Bu tekniğin temel avantajı, pahalı ve kolay erişilebilir kaynakları kullanarak enfeksiyonun temel yönlerini görselleştirmemize izin vermesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü adımlar geleneksel protokollerden çılgınca değiştirilmiştir. Ve yayınlanmış yöntemler, ayrıntılar olmadan genel prosedürleri açıklar.

Başlamak için, formol ve asetik alkolü veya FAA sabitleyiciyi bir aldehit filtresi ile donatılmış bir çeker ocakta hazırlayın. 85 kısım %70 denatüre etanol, 10 kısım %60 formaldehit çözeltisi ve beş kısım buzlu asetik asit. Çeker ocak altında, FAA stoğunu ayrı kaplara dökün.

Böcekler, mantarlar veya aşırı hava koşullarından zarar görmediklerinden emin olarak düzeltmek için çiçek veya vejetatif meristemleri seçin. İstenmeyen materyali çıkararak dalları kesin ve numuneyi hemen FAA solüsyonuna koyun. 72 ila 96 saat sonra, FAA'yı kimyasal bertaraf için plastik bir kaba dökün.

Kalan FAA'yı çıkarmak için numuneleri hemen üç kez taze %70 etanol ile yıkayın. Sabit malzeme% 70 etanolde süresiz olarak saklanabilir. Dokuların kurumasını önlemek için numuneleri etanol ile kaplı bir Petri kabına inişleyin.

Kontrast beyaz dokuyu daha iyi görmek için tabanı kuru, siyah bir silikonla kaplı bir Petri kabı kullanın. Dokuyu ayrı kaplara aktarın ve ardından bunları %70 etanol içeren bir Petri kabına daldırın. Kapakları kapların üzerine koyun ve bol miktarda %70 etanol içeren plastik santrifüj tüpüne koyun.

Kesilen materyali hermetik kavanozlarda veya santrifüj tüplerinde bir etanol serisinden geçirin. Numuneleri her çözeltide en az bir saat bekletin. Daha sonra numuneleri gece boyunca %100 etanol solüsyonunda saklayın.

Etanol serisini takiben, malzeme içeren kapları CPD'ye aktarın. SEM numune tutucularının altına numune kimlik numarasını yazın. Ardından saplamaların üstünü çift taraflı bantla kapatın.

Saplamaları bir numune tutucuya yerleştirin. Stereo mikroskop altında, CPD'de önceden kurutulmuş olan genç ve hassas numuneleri taşıyan kapları dikkatlice açın. CPD işleminden sonra numunelerin daha hafif ve elektrostatiklere karşı hassas hale geldiğini unutmayın.

Toz veya yabancı maddeleri önlemek için numuneler çıkarıldıktan sonra kapları kapatın. İstenilen pozisyon için önceden planlama yaparak numuneleri saplamaların yapışkan yüzeyine koyun. Numuneler yüzeye temas ettiğinde, onları çıkarmak çok zordur.

Bu noktada büyük bir diseksiyon yapmaya çalışmayın. Sadece alınması kolay olan istenmeyen dokuyu çıkarın. Palinolojik çalışmalar için, anterleri inceleyin ve saplamalardaki polenleri ortaya çıkarmak için açın.

Yeniden hidrasyonu önlemek için numuneleri gece boyunca silika jel içeren hermetik bir kapta koruyun. Numuneleri gözcü-kaplayıcı kullanarak kaplayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi SEM'e aktarın. Kistlerin dikenlerinin diferansiyel büyümesini ayrı Petri kaplarında test etmek için, farklı yüzeylere 0,5 mililitre ikincil kist süspansiyonu koyun.

Yüzeyler karbon, altın ve bakır transmisyon elektron mikroskobu ızgaralarını içerebilir. Önceden, ağartılmış somon ve hake balığı pulları ve cam kapak kaymaları. Kistleri 20 santigrat derecede 70 dakika inkübe edin, bu da kistlerin yüzeye yapışmasını kolaylaştırır.

Sıvıyı çıkarın ve kistlerin sabitlenmesi için her yüzeye 0,5 mililitre% 2 glutaraldehit ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında çeker ocak altında bir saat bekletin. Glutaraldehiti çıkarın ve numuneleri bir etanol serisinden dehidre edin, 15 dakika boyunca etanol çözeltilerinin her birinden beş mililitre ekleyin.

Son %100 etanol çözeltisine girdikten sonra, numune kapalı bir Petri kabında bir aya kadar saklanabilir. Izgaraları ve ölçekleri Petri kabından, numuneleri birbirinden ayrı tutan CPD'ye uygun bir tutucuya, örneğin bir CPD ızgara tutucusuna veya bir istifleme numune tutucusuna dikkatlice aktarın. Izgarayı ve tartıları cımbızla alın, kistlerin her zaman ızgaralara bakması gerektiğini unutmayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi, farklı yüzeylerdeki davranışlarını gözlemlemek için oositlerin SEM numune hazırlığını gerçekleştirmeden önce CPD'yi kullanarak materyali kurutmaya devam edin. Her numuneyi filtre kağıdı ile dikkatlice sarın ve yaklaşık 0,5 ila bir santimetre kare kurşun kalem etiketli zarflar oluşturun. Numuneleri ezmemeye dikkat edin.

Filtre kağıdını ataşlarla kapatın. Daha sonra paketlenmiş örnekleri bir Petri kabına aktarın ve sporların etrafındaki dokuyu yeniden sulandırmak için 10 mililitre suya batırın. Numuneleri hemen bir mikrodalgaya koyun.

Su buharlaşmaya başladığında malzemeyi çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Daha sonra numuneyi bir etanol serisinden geçirin. Numune miktarına bağlı olarak, bu adım için bir beher veya santrifüj tüpü kullanın.

Numuneleri her çözeltide 15 dakika bekletin. Ardından, örnekleri metin protokolünde açıklandığı gibi CPD'ye yerleştirin. SEM gözlemi için sporları monte etmek için zarfları açın.

Daha sonra sporları saplamaların yapışkan yüzeyi ile toplayın ve ezmemeye dikkat edin. Son olarak, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi numunelerin altın kaplamasını ve SEM gözlemini gerçekleştirin. Burada, osmiyum tetroksit ile muamele edilen ve bu videoda gösterilen FAA CPD protokolü kullanılarak hazırlanan anacyclus clavatus'un çiçek tomurcukları gösterilmektedir.

Ayrıca, herhangi bir tedavi olmaksızın kurutulmuş phellorinia herculanea örnekleri ve bu videoda gösterildiği gibi tedavi edilen mantar sporları da gösterilmiştir. Bu şekil, SEM altında yakalanan erken, orta ve geç çiçek gelişimini göstermektedir. Bu görüntü, genç bir reh-cim'in üstten görünümüdür.

Burada jinezyum farklılaşması sırasında bir çiçek tomurcuğu ve antezde bir çiçek gösterilmiştir. Bazı yapıların SEM altında görüntüleme için düzeltilmesi ve korunması zor olabilir. Örnekler arasında ıslak ortamlardan gelenlerin yanı sıra süslemeli olanlar ve indumenta olanlar sayılabilir.

Burada, saprolegnia parasitica'nın dikenlerinin cam, karbon, bakır, altın, mezgit pulları ve somon pulları üzerindeki diferansiyel büyüme modelleri gösterilmiştir. Bu, saprolegnia parasitica'nın aseksüel yaşam döngüsünü gösteren bir videodur. Eşeysiz yaşam döngüsü, bu organizmaların sucul veya nemli ortamlarında dağılması için önemlidir.

Ayrıca, bu aşamada üretilen hayvanat bahçesi spoorları, saprolegnials takımının parazitik türlerinde birincil enfeksiyon birimini temsil eder. Bu teknikte ustalaşmak üç ila beş gün içinde yapılabilirken, düzgün bir şekilde gerçekleştirildiği gibidir. Madrid'deki Kraliyet Botanik Bahçesi'nde bu zaman diliminde dış kullanıma sağlanan SEM terapilerini tamamlamak için para kullandık.

Bu videoyu izledikten sonra, araştırmacılar SEM gözlemi için hassas biyolojik materyali nasıl etkili bir şekilde toplayacaklarını ve düzelteceklerini bileceklerdi. Hücrelerin tahrip olması, organ bozulması veya ıslak ortamlardan alınan numunelerin kötü korunması bu prosedürle kolayca aşılabilir. Bu prosedürü denerken, SEM yoluyla yapılan gözlemin yüzeylerin yüksek büyütmeli çalışmasıyla sınırlı olduğunu hatırlamak önemlidir.

Ayrıca CPD tedavisinden önce, contalar şok edici değişikliklerden ve hava ile doğrudan temastan korunmalıdır. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, fitoloji alanındaki araştırmacıların, özellikle balıkçılığa ilgi duyan türlerde, bulaşıcı süreç sırasında spor yapısını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu prosedürü takiben, hücre bileşiminin iç yapısının belirli bir organda veya hücrelerde veya polende nasıl olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için İletim Mikroskobu veya TM gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Formalin ve gluteraldehitin manipüle edilmesinin son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocak altında çalışmak ve maske, laboratuvar önlüğü ve eldiven kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.