SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Bu deney, metillenmiş bir tandem etek içeren DNA'ya bağlı bir proteinin kırınım kalitesi kristallerinin nasıl elde edileceğini detaylandırır. GATC. Protein DNA kompleksinin kristal paketlenmesini desteklemek için tekrarlayın. DNA uzunluğunun rasyonel tasarımı, GATC aralığı ve DNA uçları ile başlayın, DNA'yı saflaştırmak için tamamlayıcı tek sarmallı oligonükleotidler ile devam edin ve daha sonra hemi metillenmiş DNA dupleksini oluşturmak için anel ile devam edin, daha sonra kompleksi oluşturmak için saflaştırılmış dizi A'da karıştırın.

Daha sonra, ticari seyrek matris ekranları kullanarak kristalizasyon denemeleri ile protein DNA kompleksinin kırınım kalitesi kristallerini büyütmek için en uygun koşulları bulun. Gösterilen sonuçlar. Değişen DNA uzunluğunun, GATC aralığının ve uçlarının CQ A DNA kristallerinin kırınım kalitesi üzerindeki etkisini paylaşın.

Bu çalışmanın amacı, DNA'ya bağlı CK'nin kırınım kalitesi kristallerini elde etmektir, ancak aynı zamanda, bu prosedürün Chang, A'da laboratuvarımdan doktora araştırmacısı için kullanılacağını gösteren diğer protein DNA komplekslerinin kristalizasyonu için DNA dupleksleri tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken genel değişkenlerin anlaşılmasına da yardımcı olabilir. Bu çalışma, DNA replikasyon düzenleyici proteinlerin bir varyantını kullanmaktadır. Kararlı dimerler oluşturan ve izasyonu ile DNA bağlanma alanları arasında kısaltılmış bir bağlayıcı bölgeye sahip olan bir arama yapın.

Bu varyant, DNA'nın tandem GATC tekrarlarına bağlanmasını kısıtlar, DNA üzerinde yalnızca bir tur ile ayrılır, önce T yedi promotör plakasının kontrolü altında DEMETRIC seq A'yı kodlayan plazmid ile BBL 20 1D üç hücreyi dönüştürür. Mililitre başına 100 mikrogram içeren LB agar plakaları üzerindeki dönüşüm reaksiyonu, ampisilin ve gece boyunca bakteri inkübatöre yerleştirilir. Karışık koloniler seçin ve küçük ölçekli bir gece kültürü başlatın.

Ertesi sabah aşılayıcı, gece boyunca 10 mililitre aşı ile bir litre kültür. Kültür log fazındayken, protein üretimini indüklemek için iki mililitre 0.5 molar IPTG ekleyin. 37 santigrat derece orbital çalkalayıcıda üç saat boyunca inkübasyona devam edin.

Daha sonra hücreleri 10 dakika boyunca 3.300 G'de santrifüjleme ile hasat edin. Reese, hücre paletini saflaştırmada askıya alın, sonikasyonla bir yalanı tamponlayın ve lizatı 40 dakika boyunca 39.000 kez G'de santrifüjleme ile temizleyin. Şimdi S süpernatanı saflaştırma tamponu ile dengelenmiş bir heparin kolonuna yükleyin.

CK proteinini elüte etmek için. Bir molar sodyum klorür CK proteini yaklaşık 0.7 molar sodyum klorürde elutes için doğrusal bir gradyan kullanın. CK içeren fraksiyonları çekin ve numunenin iyon mukavemetini düşürmek için seyreltin.

Daha sonra numuneyi, saflaştırma tamponu ile eşit bir katyon değişim kromatografi sütunu E'ye yükleyin. Saf CK proteinini yaklaşık 0.4 molar sodyum klorürde döngüye sokmak için doğrusal bir tuz gradyanı uygulayın. CK içeren kesirleri birleştirin.

Mililitre başına üç miligrama konsantre olun ve depoda saklayın. Tampon tasarımı, tamamlayıcı metillenmemiş ve metillenmiş oligonükleotidler. 800 mikrolitre otoklavda, çift damıtılmış su girdabında her liyofilize tek iplikli DNA'nın bir mikromol örneklerini hazırlayın ve şimdi 15 dakika ve 800 mikrolitre bekletin.

20 ila 30 nükleotid, uzun oligonükleotidler için her numuneye iki kez önceden ısıtılmış yükleme tamponu hazırlayın, büyük% 10'luk bir denatüre edici jel hazırlayın. Polimerize olduktan sonra tarağı çıkarın ve iyice durulayın. Üst ve alt rezervuarları bir kez TBE çalışma tamponu ile dolduran jeli birleştirin.

Jeli 55 santigrat dereceye kadar ısıtmak için jeli 750 voltta önceden çalıştırın. Ardından çalışmayı durdurun ve kuyuları çalışan tampon ile iyice durulayın. Şimdi oligonükleotidleri iki dakika boyunca 90 santigrat dereceye ısıtın.

Girdap ve dönüş. Numuneler hemen jeli yüklemeye devam eder. Oligonükleotid göç edene kadar jeli yaklaşık 700 voltta çalıştırın.

Yarısı: %10'luk bir poli akrilamid jel üzerinde alph fenol mavisi ko, yaklaşık 20 baz uzunluğunda oligonükleotidler ve yaklaşık 60 baz uzunluğunda ksilen syl ff ile göç eder. Jeli aparattan sökün ve ara parçaları düz bir yüzeyde çıkarın. Bir cam plakayı çıkarın ve jeli plastik sargı ile örtün.

Ardından jeli çevirin, diğer cam plakayı çıkarın ve jeli plastik sargı ile örtün. Ardından, UV ışığı ve jelin arkasında bir floresan plaka kullanarak bantları işaretleyin. DNA gölgesini bir jiletle görmek için bandı kesin ve küçük parçalara ayırın.

Her numuneyi 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. Dokuz mililitre elucian tamponu ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalama ile seyreltin. Jel yüklemeli bir pipet ucu kullanarak çözeltiyi dikkatlice bir otoklav santrifüj tüpüne aktarın.

Akrilamid parçalarının aktarılmasını önlemek için, bir mililitre üç militer sodyum asetat, bir pH yedi artı 25 mililitre soğutulmuş %100 etanol ekleyin, eksi 20 santigrat derecede en az üç saat inkübe edin. Çökeltilmiş DNA'yı santrifüjleyin. Daha sonra peletleri hız süpürgesinde orta ısıda kurutun, her peleti 400 mikrolitre otoklavda, çift damıtılmış suda yeniden süspanse edin ve taze bir tüpe aktarın.

pH yedide 40 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve bir mililitre% 100 etanol girdabı ekleyin ve 18.000 kez 15 dakika santrifüjlemeden sonra eksi 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. G, DNA peletlerini 100 mikrolitre% 70 soğuk etanol ile durulayın ve kalan tuz dönüşünü 18.000 kez altı dakika boyunca çıkarın. G daha sonra etanolü atın ve peleti bir hızlı vakumda kurutun.

Şimdi her peleti 100 mikrolitre otoklav çift damıtılmış suda tekrar gönderin. Spektrometri ile oligonükleotidlerin konsantrasyonunu belirleyin. Hemi metillenmiş DNA duplekslerini hazırlamak için, önce tamamlayıcı tek ipliklerin eşit molo konsantrasyonlarını karıştırın.

Daha sonra karışımları bir su banyosunda beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın Telleri anillemek için. Numunelerin su banyosunun içinde oda sıcaklığına yavaşça soğumasını bekleyin. Eşit hacimlerde 81 mikromolar saflaştırılmış CQ bir protein ve 81 mikromolar hem metillenmiş DNA'yı birleştirin.

Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ticari seyrek matris elekleri kullanarak kristalleşme koşulları için elek kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. İlk kristalleşme uçları belirlendikten sonra, elde edilen CK DNA kristallerini ağlamak ve korumak için kırınım kalitesinde kristaller yetiştirmek için koşulları optimize edin.

Kristalizasyon çözeltisinde bulunan PEG 400 miktarını ya %25'lik bir nihai konsantrasyona yükseltin ya da kristalizasyon çözeltisine %20 gliserol ekleyin. Naylon halka flaşı ile tek tek kristalleri çıkarın. Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun.

Şimdi her kristalin kırınım sınırını 100 k'da test edin. Hemi metillenmiş DNA'ya bağlı kısaltılmış CK mutantının kristal yapısını elde etmek için, DNA üzerindeki üç parametreyi, Hemi metillenmiş GATC dizileri arasındaki boşluğu, dubleksin uzunluğunu ve beş asal çıkıntının yokluğunu veya varlığını art arda optimize ediyoruz. Bu çalışma, uç terminal alanında daha fazla ligamentizasyonu önleyen bir nokta mutasyonu ve tandem DNA bağlanmasını kısıtlayan kısaltılmış bir bağlayıcı ile bir arama varyantı kullanmaktadır.

DNA elektromobilite kayma tahlillerinde yalnızca bir tur ile ayrılan GATC tekrarları, modifiye edilmiş CK proteininin tercihen dokuz ila 10 baz çifti ile ayrılmış GATC tekrarlarını bağladığını gösterir. Bu nedenle, ilk ekranlar, metillenmiş iki kenar içeren 23 ila 24 baz çifti uzunluğunda dubleksler kullanır. GATC, dokuz veya 10 baz çifti ile ayrılmış tekrarlar.

Üç dubleks, güzel şekilli kristaller verdi. Kristallerin hiçbiri yüksek çözünürlüğe sapmadı. Veriler, kristalleşme için dokuz baz çiftinin A-G-A-T-C ayrılmasının tercih edildiğini, iki GATC bölgesi arasına bir CG dinükleotidi dahil ederek oluk omurga etkileşimlerini beklenmedik bir şekilde artırdığını, kristallerin kırınım sınırını değiştirmediğini gösterdi.

Buna karşılık, çıkıntıların uzunluğunun optimize edilmesi, moleküler temasları ve kristal morfolojisini önemli ölçüde değiştirdi. Bir etek metillenmiş DNA dupleksine bağlı bu CK proteininin kristal yapısı, DNA dubleksinin serbest yüzünün, protein ve DNA'nın nispi boyutuna rağmen kristal temaslara girmediğini, simetri eşleri arasındaki etkileşimlerin çoğuna protein, protein ve protein DNA etkileşimlerinin aracılık ettiğini doğruladı. İlginç bir şekilde, bu özel durumda, beş asal dinükleotid çıkıntısının faydalı etkisi, sahte sürekli bir DNA'nın oluşumundan kaynaklanmaz.

Bunun yerine, metillenmiş ipliğin beş asal ucu, DNA eksenlerinden uzağa doğru çıkıntı yapar ve kompleksin proksimal CK molekülü ile etkileşime girer, bu da kristal ambalajı değiştirmek için neden iki nükleotidin kesinlikle gerekli olduğunu açıklar. Bu videoyu izledikten sonra, proteinlerin nasıl saflaştırılacağını ve protein DNA kompleksi kristalizasyonu için DNA dublekslerinin nasıl tasarlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu protokolün CK DNA kompleksini kristalize etmek için bir cihaz olmasına rağmen, DNA uzunluk dizisinin ve uçlarının rasyonel optimizasyonunun, diğer protein DNA komplekslerinin kristalizasyonu için DNA duplekslerinin tasarımı için genel bir çerçeve sağladığını hatırlamak önemlidir.