Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, burada sunulan durumda sadece tek bir gen veya genetik diziden başlayarak, bir hedef proteinin x-ışını kristalografisi ile yapılandırılmış olarak belirlenmesi için çok hedefli bir yaklaşım kullanmaktır. Hedef protein, viral replikasyonun önemli bir bileşeni olan influenza A'dan PB iki polimeraz alt birimidir. Çoklu hedef yaklaşımı, ilk olarak tek hedef diziye ve protein hakkında bilinen diğer bilgilere dayalı olarak bir dizi genetik yapının paralel olarak tasarlanması ve klonlanmasıyla elde edilir.

İkinci adım, her yapı için ekspresyon seviyelerini test etmek ve hücre kültüründe büyük ölçekli protein ekspresyonu için en iyisini seçmektir. Bir sonraki adım, hedef proteinleri ekspresyon materyalinden çıkarmak için açık hücrelerin kırılmasını ve her birinin çok yüksek saflıkta rafine edilmesini gerektirir. Daha sonra, x-ışını çalışmaları için uygun bir kristal formu elde etmek için her bir protein ile bir dizi kristalizasyon denemesi yapılır.

Yüksek çözünürlüklü x-ışını kırınım verileri daha sonra bir veya daha fazla kristal üzerinde toplanır ve her bir hedef proteinin yapısını özetleyen bir elektron yoğunluğu haritasını çözmek ve rafine etmek için kullanılır. Bu sonuçlar, elektron yoğunluğu haritasına dayalı olarak hedef proteinin üç boyutlu bir yapısının oluşturulmasına izin verir. Çok hedefli işleme, yoldaki her potansiyel barikatta uygulanabilir alternatifler sağlayarak yapılandırılmış belirlemede başarı olasılığını büyük ölçüde artırır.

Birden fazla hedefin paralel olarak çalışması da son derece verimlidir ve her adımda protein başına harcanan zamanı ve maliyeti azaltır. İlaçlanabilir hedefler için yapılandırılmış belirlemenin tamamlanma oranını artırma potansiyeli, yılda daha fazla tedavi geliştirme fırsatına izin verecektir. Bu yöntem yapısal biyolojide değerli bilgiler sağlayabilse de, bu yöntemlerle elde edilen yüksek kaliteli protein, herhangi bir protein bazlı araştırmayı destekleyebilir.

Sürecin her aşaması kendi bilimine sahiptir ve kendi uzmanlığını gerektirir, ancak insan enstrümantasyonuna ve bilgi birikimine yapılan yatırım, tüm parçalar bir araya getirildiğinde güzel bir şekilde karşılığını verebilir. Araştırma için bir hedef gen ve gen ürünü seçildikten sonra, ilk adım birden fazla genetik varyantın veya yapının tasarımını gerektirir. Gen oluşturucu yazılım, bu yapıları, tasarlanmış sentetik gen dizileri üzerindeki ilgili kodla birlikte protein düzeyinde tasarlamak için kullanılır.

Hizalama görüntüleyici modülünü ve yapı tasarım modülünü kullanarak, protein dizisi hizalamalarını karşılaştırın ve protein yapıları, tasarım, insert, PCR ve vektör, PCR, terminal primerleri veya amperleri tanımlayın. Daha sonra, her bir amino asit dizisini tasarlanmış nükleik asit dizisi üzerinde bir koda geri çevirmek için gen oluşturucunun proteinden DNA'ya algoritmasını kullanın. Belirli bir hücre satırındaki ifade sırasını optimize etmek için kullanım tablosundaki uygun kodu kullanın.

Bu durumda, e coli bakterileri. Hedef gen dizisi hazır olduğunda, geni sanal olarak klonlayın ve bakteri ekspresyonu için uygun bir vektör plazmidine yerleştirin. Bu durumda, modifiye edilmiş bir PET 28 vektörü.

Bu vektör, ekspresyon ve protein saflaştırması için gerekli olan bazı bileşenleri içerir. Hedef gen, proteinin N veya C terminalinde bir histamin etiket dizisi ve saflaştırma sırasında etiketin çıkarılmasına izin vermek için bir bölünme dizisi içerecek şekilde modifiye edilir. Vektör ayrıca ekspresyon testi ve fermantasyon için bir antibiyotik direnç genine sahiptir.

Her bir hedef protein genetik dizisi daha sonra boru klonlamasına hazırlık olarak standart gen sentezi yöntemleriyle oluşturulur: polimeraz eksik primer uzatma klonlaması veya boru klonlama, hedef genin amaçlanan vektöre tamamlayıcı olan primerlerle amplifiye edildiği PCR tabanlı bir klonlama stratejisidir. Bu yöntem, PCR ürünlerini değişken tek sarmallı terminallerle bırakan geç evre PCR'nin eksik doğasından yararlanır. Her reaksiyona beşer mikrolitre ileri ve geri primer ekleyerek PCR veya IPCR ekini hazırlıyorum.

Bir plaka haritasına göre 96 oyuklu bir plakada, plaka haritasına göre uygun kuyucuğuna her tam uzunlukta sentetik genden iki mikrolitre ekleyin. Her birine 25 mikrolitre PFU ana karışımı ekledikten sonra, aşağıdaki PCR koşullarını kullanarak reaksiyonları 25 kez iyice döngüye sokun. 30 saniye boyunca 95 santigrat derecede denatüre edin.

Anıl'ı 50 santigrat derecede 45 saniye bekletin ve 68 santigrat derecede üç dakika uzatın. Fragman amplifikasyonu, IPCR ürünlerinin AGROS jel analizi ile doğrulanır. Başarılı IPCR ürünleri sağlam bantlarla temsil edilir.

Daha az arzu edilen sonuçlar genellikle ayrı bir reaksiyonda soluk veya lekeli bantlar olarak görülür. Plazmit ekspresyonu vektör PCR ile amplifiye edilir veya VPCR fragman amplifikasyonu, VPCR ürünlerinin AROS jel analizi ile doğrulanır. IPCR ve VPCR ürünleri yükseltildikten sonra, bir birleştirme plakasına eklenir ve birleştirme reaksiyonu için bir termodöngüleyiciye konur.

Başarılı bir şekilde klonlanan yapılar daha sonra kimyasal olarak yetkin e coli hücrelerine dönüştürülür ve ekspresyon test çizgisini başlatmak için gliserol saplarında saklanır. Klonlanmış bir gliserol stoğundan her numunenin küçük bir miktarı ayrı bir agar plakası üzerine yerleştirilir. Plaka, bakteri besin suyu ve vektörde kodlanan antibiyotik belirteci Kanamisin ile yapılır ve ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir.

Taze yetiştirilmiş agar plakasından tek bir koloni seçerek her numune için bir ön kültür başlatın. Paralel işleme için kutu misin ve glikoz ile desteklenmiş 1.2 mililitre TB suyunu aşılamak için bu koloniyi kullanın. Her ön kültür, 96 kuyucuklu yuvarlak bir alt blokta büyütülür.

Dakikada 220 dönüşte çalkalama ile gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Bir gecede büyümeden sonra. Aşılamak için 40 mikrolitre ön kültür kullanarak her numune için küçük ölçekli indüksiyon kültürleri başlatın.

1.2 mililitre TB suyu. Mililitre başına 50 miligram kutu misin ve novajen gece ekspres sistemi ile desteklenmiştir. Birincisi, indüksiyon kültürlerini 48 saat boyunca 20 santigrat derecede büyütün, 220 RPM hasat hücresinde 15 dakika boyunca 4.000 GForce biriminde santrifüjleme ile çalkalayın.

Süpernatanı dökün ve saflaştırmadan sonra daha fazla işlemden önce peletleri en az bir saat eksi 20 santigrat derecede saklayın. Üreticinin protokolüne göre bir kaliper laboratuvarı CHIP 90 sistemi kullanarak kılcal elektroforez ile bölünme reaksiyonu olan ve olmayan proteini analiz edin. İnfluenza durumunda, bir PB iki protein alt birimi olan 34 yapının 14'ü çözünür hedef proteine yol açtı ve bir sonraki adıma girdi: büyük ölçekli fermantasyon.

Büyük ölçekli bir fermantasyona başlamak için, mililitre başına 50 miligram içeren 100 mililitre bakteri hücre kültürü suyunu aşılayın. Bir gliserol stoğundan misin ve bir gecede 37 santigrat derecede büyüyebilir mi? Ertesi gün 220 RPM'de çalkalayarak, aşılamak için 10 mililitre kullanarak ön kültürü genişletin.

Otomatik indüksiyon ortamı ve mililitrede 50 miligram içeren bir litre et suyu, iki litrelik şaşkın bir şişede misin yapabilir. Genişletilmiş kültürleri yaklaşık her 30 dakikada bir 37 santigrat derecede çalkalayın. 600 nanometre dalga boyunda UV absorbansını ölçerek kültürün optik yoğunluğunu kontrol edin.

0,6'lık bir optik yoğunluğa ulaşıldığında, istenen büyüme süresinden sonra çalkalama inkübatörünün sıcaklığını 20 santigrat dereceye değiştirin. İfade testi için her yapıdan temsili bir 10 mililitre Ali dörtlüsü çıkarın. Hücreleri 15 dakika boyunca 5.000 GForce biriminde santrifüjleme ile hasat edin.

Süpernatanı dökün ve hücre peletini eksi 80 santigrat derecede dondurun. Bu prosedüre başlamak için, hücre macununu lizis tamponunda bir ila beş ana hacim oranında çözün ve yeniden süspanse edin. Dört santigrat derecede 30 dakika kuvvetlice karıştırın.

Beherin yanından gevşek parçaları kırmak için temiz bir spatula kullanın. Bir masonik sonikat ile buz üzerindeki hücreleri mekanik olarak lyce. Ham lizatı, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 18.000 GForce biriminde santrifüjleme ile berraklaştırın.

Süpernatanı toplayın ve büyük ölçekli saflaştırmaya devam etmeden önce analiz için küçük bir alikot saklayın. SDS sayfası jel analizi ile her kültürün büyük ölçekli protein ekspresyonunu onaylayın. Bu temsili SDS sayfası sonucu, sağlam protein ekspresyonu, kabaca %50 çözünürlük ve yaklaşık %50 bölünme gösterir.

Bu durumda, histidin etiketi, orijinal yapıda tasarlanmış olan ilave bir protein çözünürlük etiketi ile birlikte çıkarıldı. Nikel reçinesi, benzersiz histamin etiketine sahip hedef proteini, doğal bakteriyel proteinler de dahil olmak üzere diğer tüm hücresel materyallerden ayırmak için kullanılır. Bir nikel bir kolon, depolama tamponunu çıkarmak için dört kolon hacmi UE suyu ile yıkanarak hazırlanır, ardından bir kolon hacmi tampon B ve beş kolon hacmi tampon gelir.

A için E dengeleme paralelleştirmesi, aynı anda birden fazla sütunu çalıştırabilen protein üreticisi ile yapılır. Histamin etiketli çözündürülmüş protein içeren her bir arıtılmış lizatı dakikada iki mililitre hızında ayrı bir sütuna yükleyin, ardından tampon A ile birkaç sütun hacmi yıkaması yapın, akışı tampondan toplayın ve analiz için saklayın. Bağlı proteini, 95 ila beş 60 ila 40'ta tampon A ve B ile bir dizi adım gradyanında elute edin ve son olarak% 100 tampon B. Tampon B'deki bileşenler, nikel reçinesi için histamin ile rekabet eder ve böylece proteini belirli bir oranda kolondan çıkarır.

Her elüsyon fraksiyonunu ayrı ayrı toplayın. Bir nikel bir sütun üzerinde yapılan bir çalıştırmadan elde edilen temsili bir kromatogram sonucu burada gösterilmektedir. Nikel bir kaçan fraksiyonları, ham lizatı, arıtılmış lizatı ve nikel olanı SDS sayfası tarafından analiz edin ve kolon saflaştırması sırasında toplanan 280 nanometredeki UV absorbansı ile karşılaştırın.

Bu adım, saflaştırmanın başarılı olup olmadığını belirler. Daha sonraki işlemler için ilerlemek üzere hedef proteini içeren fraksiyonları seçin ve bir araya getirin. Bu aşamadaki toplam protein miktarını, proteinin teorik sönme katsayısı ile hesaplayın, 280 nanometrede UV absorbansını ölçün ve havuzlanmış fraksiyonların toplam hacmini hesaba katın.

Analiz için küçük bir örnek kaydedin. Hedef protein için gen, ULP biri tarafından bir bölünme bölgesi olarak tanınan spesifik bir dizi ile kodlandı, böylece ULP bir eklendiğinde, histidin etiketi ile ilgilenilen protein arasında bölünme ile sonuçlandı. Bu işleme başlamak için, havuzlanmış fraksiyonlarda bulunan her beş miligram protein için bir tane olmak üzere proteaz gibi bir mikrolitre ubikitin ekleyin.

Bu noktada, parçalanmış protein, diyaliz tüpü kullanılarak daha ileri işlemler için tampon B'den tampon A'ya aktarılır, proteini iki litre tampona, A ise dört saat boyunca karıştırılarak diyalize edilir. Diyalizden sonra PB iki için 10 kilodaltonluk bir moleküler ağırlık kesimi kullanın. Hedef proteinin ULP olan ve olmayan başka bir SDS sayfa jeli çalıştırın.

Bu, ULP bir bölünmenin başarılı olup olmadığını belirleyecek ve daha sonraki işlemler için ileriye taşınması için en iyi fraksiyonların seçilmesine izin verecektir. Burada, polimeraz pb'nin üç yapısı için temsili SDS sayfamızın sonuçları gösterilmiştir. Birinci şeritte iki alt birim moleküler ağırlık belirteci bulunur.

İki, altı ve 10 numaralı şeritler, nikel bir sütundan toplanan proteinlerdir. Üç, yedi ve 11 numaralı şeritler, nikel iki ve dört, sekiz ve 12 şeritlerinden A tamponunda parçalanmış proteinin akışını içerir. Tampon B'deki histamin etiketinin nikel ikiden çıkarılmasını gösterin.

Histaminin çıkarılmasından sonra, nikel ikiden toplanan fraksiyonlar konsantre edilir. SEC'e başlamak için, hedefin moleküler ağırlığına bağlı olarak uygun reçine tekrar seçilmelidir Bu durumda, acere S 110 üzeri 30 GL sütunu kullanılır ve beş mililitrelik bir şırınga kullanılarak dakikada 0,5 mililitre akış hızında 200 mililitre SEC tamponu ile dengelenir, numuneyi 10 mililitrelik numune döngüsüne yükleyin ve SEC kolon çalışmasına başlayın. Küçük hacimli fraksiyonları toplarken UV emici kromatogramı 280 nanometrede izleyin.

İlgili tüm SEC kesirlerini SDS sayfası üzerinden çalıştırın. Protein kristalizasyon denemelerine standart yaklaşım, buhar difüzyonunu içeren oturarak damla yöntemi ile gerçekleştirilir. Her bir hedef protein için en başta iki veya daha fazla seyrek matris ekranı kurmak alışılmadık bir durum değildir.

Bu işlemi başlatmak için, 96 kuyulu kompakt bir genç kristalizasyon plakasının her bir rezervuarını 80 mikrolitre ile önceden doldurun, seçilen kristalizasyon süzgecindeki her koşul, 96 kuyucuğun her birine SEC tamponunda 0,4 mikrolitre protein dağıtın. Daha sonra 0,4 mikrolitre kristalizasyon süzgeci ekleyin ve her birindeki damlanın tamamen karışmasını sağlayın. Tüm trite'yi kristal berraklığında tavan bandı ile kaplayın, her kuyuda tam bir sızdırmazlık sağlayın, plakayı 16 santigrat derecede çevresel titreşimlerden arınmış, rahatsız edilmeyen bir yerde saklayın.

Önümüzdeki birkaç hafta boyunca diseksiyon mikroskobu altında periyodik olarak protein kristalizasyonunu kontrol edin. Protein kristalleri görünmezse, farklı koşullara sahip yeni plakalar ayarlayın ve hasattan önce başarı olasılığını artırmak için son damladaki protein konsantrasyonunu değiştirin. Sıvı nitrojen ile doldurulmuş bir doerde A LS tarzı bir diski soğutun ve hasada başlamak için bir kapakla örtün.

Kuyuyu hedef protein kristali ile kaplayan şeffaf bandı yakındaki bir boşluğa kesin. Karşılık gelen kristalleşme koşulundan 1.6 mikrolitre ekleyin ve 0.4 mikrolitre etilen glikol ile birleştirin. Kristalleşme durumundaki% 20'lik bir etilen glikol çözeltisi protein kristalini korur.

Kriyo dondurma sırasında, kristali mikroskop altında analiz edin ve ilmeğin iç çapını kristalin maksimum genişliğiyle eşleştirerek hasat için uygun bir kriyo döngüsü seçin. Kriyo halkasını manyetik bir kristal çubuğa takın ve kristali doğrudan kuyu çözeltisinden geçirin. Hasat edilen kristalle kriyo halkasını hemen bir kriyoprotektan içine daldırın ve ardından LS tarzı bir diske daldırın.

Yanıp sönmek için, istenen sayıda kristal için kristali tekrar dondurun. Hasat tamamlandıktan sonra, diskin üzerine bükülmüş dilleri olan flaş donmuş kristaller içeren manyetik bir kapak yerleştirmek için bir disk çubuğu kullanın. Bir sonraki adım için diski ters çevirin.

Diskin üzerine bir disk itici vidalayın, ardından diski KU aktör yapıcısına aktarın ve kapağı delmek için kullanın. Diskteki kristaller, J Director görüntü elde etme yazılımı kullanılarak x-ışını kırınım çalışmaları için hazır olana kadar sıvı nitrojen banyosunda donmuş halde kalır. 0,5 derecede kristal tarama, ışın yarığı, 50 milimetre dedektör mesafesi, 70 derecede görüntü adımı ve 30 saniyelik pozlama uzunluğu için aşağıdaki parametreleri ayarlayın.

Burada, bir kristal taranırken görüntü elde etme yazılımından örnek bir ekran görüntüsü verilmiştir, orta panel, üç boyutlu yapı belirleme için gereken eksiksiz bir veri seti için yüksek çözünürlükte yeterli görüntüleri toplayan temsili bir kristalden gözlemlenen x-ışını kırınımını gösterir. Bu videoda gösterilen klonlama ve protein saflaştırma stratejileri, dokuzunun kırınım çalışmaları için uygun kristaller verdiği 14 saflaştırılmış PB ile sonuçlandı. Şirket içi x-ışını kırınım veri seti, ossec variax hf, HF optiği ve bir Saturn 944 plus CCD dedektörü ile donatılmış bir rigaku süper parlak FRE artı dönen anotlu x-ışını jeneratörü kullanılarak QK alfa radyasyonuna sahip dokuz yapının beşinde toplandı.

Polimeraz PB iki alt biriminin bir X-ışını kırınım görüntüsü burada gösterilmiştir. Her bir veri seti işlendi ve PB iki alt biriminin toplam dört yapısı belirlendi. Her yapı hakem tarafından gözden geçirildi ve halkın erişimi için protein veri bankasına yüklendi.

Bu şekil, kristalografik asimetrik birimdeki moleküllerin şerit diyagramlarını göstermektedir. Dört PB iki yapıdan, ikincil yapılar, karşılık gelen PDB kodlarıyla gökkuşağı deseninde renklendirilir. Bu tabloda, bu video makalesinde açıklanan yöntemlerle influenza PB iki hedefi için sonuç analizi gösterilmektedir.

Genden yapıya belirleme için çok hedefli paralel işleme boru hattı, klonlama, çözünürlük, saflaştırma, kristalizasyon ve yapı belirleme olmak üzere beş adımda gösterilmektedir. Yapısal biyoloji boru hattımızın çıktısı sadece yapı tabanlı araştırmalar için temel sağlamakla kalmaz, aynı zamanda ilaç geliştirme için yeni başlangıç noktalarını belirlemek için protein fonksiyonunu doğrulamak için fonksiyonel tahliller veya yeni bileşiklerin bir MAR veya SPR'de biyofiziksel taraması gibi ek çalışmaları da besler. Bu teknik ve onunla birlikte icat edilen araçlar, yapısal biyologların, insan sağlığı ve hastalığı üzerinde büyük bir etkisi olan yapı tabanlı ilaç tasarımı da dahil olmak üzere birçok keşif temelli araştırmayı tespit etmelerinin önünü açmaya yardımcı oldu.

Bu videoyu izledikten sonra, çok hedefli paralel işlemenin yapılandırılmış belirlemenin başarısını nasıl büyük ölçüde artırabileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir yapısal biyoloji laboratuvarında çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve laboratuvar faaliyetlerine katılırken KKD kullanımı gibi uygun önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.