Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Bu yöntemin genel amacı, hücre takip boyaları kullanarak karmaşık popülasyonlar içindeki farklı immün hücre alt kümeleri için hücre bölünmesinin derecesini doğrudan nicelendirmektir. Bu, öncelikle ebeveyn hücre popülasyonunun, hücresel proteinlere stabil bağlanma sağladığı veya hücre membranlarına kovalent olmayan şekilde interkale olduğu bilinen floresan bir boya ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir; böylece stimülasyona yanıt veren boyanmış hücreler takip edilir. Floresan antikorlarla boyama ve çok parametreli akış sitometrisi kullanılarak yapılan analiz, stimüle edilen ilgili immün hücre tipleri arasındaki farklı yanıtların tespit edilmesini sağlar; ancak takip boyası ile boyanmamış kontroller, otofloresanstan ayırt edilebilecek en düşük yavru hücre floresans yoğunluğunu belirlemek için kullanılır. Daha sonra, takip boyasıyla etiketlenmiş ancak stimüle edilmemiş kontroller, bölünmemiş hücrelerin tespit edileceği floresans yoğunluğunu belirlemek için kullanılır. Stimülasyon tipik olarak geniş bir yoğunluk aralığı ile sonuçlanır; çünkü yanıt olarak çoğalan hücreler kademeli olarak daha sönük hale gelirken, yanıt vermeyenler gelmez.

Nihayetinde, farklı nesillerdeki hücrelerin göreceli sıklığını tahmin etmek için pik modelleme yazılımının kullanımı, proliferasyon indeksi veya öncül hücre sıklığı gibi metrikler kullanılarak farklı popülasyonlar veya uyaranlar arasındaki proliferatif yanıtların kantitatif karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu tekniğin trityumla işaretleme, timidin inklüzyonu veya KI 67 ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, DI dilüsyonunun, immünofenotiplendirme ve sitokin üretimi gibi diğer akış sitometrik ölçümlerle birleştirilebilen doğrudan bir hücre bölünmesi ölçümü sağlamasıdır. Hücreler tarafından boya alımı son derece hızlı olduğundan, membran boyama yönteminin görsel gösterimi faydalıdır.

Sonuç olarak, parlak ve homojen bir boyama elde etmenin anahtarı doğru tekniktir. İnsan periferik kan mononükleer hücreleri izole edildikten sonra, trombosit kontaminasyonunu minimize etmek için oda sıcaklığında 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından peleti %1 BSA içeren HBSS içerisinde 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspande edin ve buz üzerine yerleştirin.

500 µL'lik bir alikotu ayırın ve saklayın, ardından başka bir 500 µL'lik hücre alikotunu 12 x 75 mm'lik konik polipropilen bir tüpe aktarın. 3,5 mL HBSS ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; yıkama sırasında PKH 26 GL kitinden 0,5 mL Diluent C etiketleme aracını başka bir 12 x 75 mm'lik konik polipropilen tüpe ekleyin, hücreleri uzaklaştırmamaya dikkat ederek ve 15 ila 25 µL'den fazla artık sıvı bırakmayacak şekilde süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından, hücre peletine 0,5 mL Diluent C etiketleme aracı ekleyin ve tek hücre süspansiyonu elde etmek için çözeltiyi birkaç kez aspire edip dağıtın.

Şimdi, dilüent C içeren tüpe iki mikrolitre PKH 26 ekleyerek iki kat XD stok çözeltisini hazırlayın. Hemen ardından, hücre süspansiyonunu taze hazırlanmış iki kat PKH 26 boya çözeltisine pipetleyin ve hücrelerin boya boyunca homojen bir şekilde dağılması için karışımı aynı anda birkaç kez aspire edip boşaltın. Bir dakika sonra, boyanın hücre membranlarına alınmasını durdurmak için bir mililitre ısı ile inaktive edilmiş serum ekleyin. Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, peleti yerinden oynatmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin.

Ardından peleti, %10 ısı ile inaktive edilmiş serum içeren dört mililitre tam besiyerinde dağıtın ve hücre süspansiyonunu yeni bir polipropilen tüpe aktarın. Hücreleri iki kez HBSS artı %1 BSA ile yıkayın; yeterince boyanmış hücreler pelette belirgin bir pembe renk gösterecektir. Hücre peletini bir mililitre HBSS artı %1 BSA içinde yeniden süspanse ettikten sonra hücreleri sayın ve ardından nihai konsantrasyon mililitrede 10⁷ hücre olacak şekilde hacmi ayarlayın. Tabloda belirtilen akış sitometrisi protokolüne göre hücreleri boyadıktan sonra, ileri saçılma (forward scatter) ve yan saçılma (side scatter) parametrelerini ve dört floresan dedektördeki sinyalleri ayarlamak için ilk beş tüpü kullanın.

Özellikle ikinci tüpteki PKH 26 floresansını izlemek için kullanılan detektör için; tüm PKH 26 boyalı hücrelerin, son kanalda çok az veya hiç hücre bulunmaksızın, üçüncü ila dördüncü onlukta tek bir simetrik pik olarak ölçekte göründüğünü doğrulayın. Ardından, diğer üç florokromu izlemek için kullanılan detektörlerdeki her bir fluro için bir renk örtüşme matrisi oluşturmak amacıyla, renk kompanzasyon yazılımını ve birinci ila beşinci tüpler için toplanan liste modu dosyalarını kullanın.

Ardından bu matrisi altıncı örneğin liste modu dosyasına uygulayın. PKH 26 etiketlemesinin varlığının, seven A a D pozitif hücreleri tespit etme yeteneğini değiştirmediğini doğrulamak için şimdi yeni oluşturulan bu renk çakışma matrisini yedinci tüpün liste modu dosyasına uygulayın.

Bir FE'ye karşı PC grafiği üzerinde CD3 pozitif CD4 negatif ve CD3 pozitif CD4 pozitif popülasyonları tanımlayın. Anti-CD3, FE ve anti-CD4 A PC varlığının, seven A a D pozitif hücreleri tespit etme yeteneğini değiştirmediğini doğrulayın. Son olarak, tüp 7 için renk örtüşme matrisini tüp 8'in liste modu dosyasına uygulayın.

Şimdi, proliferasyon analiz modülü içeren bir programı açın. Analiz edilecek veri setinden stimüle edilmiş PKH 26 boyalı dosyayı yükleyin. Ardından, bu durum için analiz parametrelerini seçin; canlı, seven a a d negatif, cd3 pozitif lenfositler üzerinde kapı yapılmış PKH 26 ve küçük döküntüler ile büyük agregatların dışlanması için ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılım (side scatter) parametrelerini belirleyin.

Bu bölgeleri tanımlarken, blastların genellikle bulunduğu yüksek ileri saçılım (forward scatter) alanını dahil etmeye dikkat edin. Ardından, proliferasyon sihirbazını açın. Veri dosyasını açmak için başlangıç sekmesine tıklayın ve ardından uyarılmamış PKH 26 pozitif kontrolünü yükleyin.

Bölünmemiş hücrelere karşılık gelen ebeveyn pikin konumunu belirleyin. Ebeveyn pikin konum ve genişlik değerlerini not ederek dosyayı analiz edin. Sabit bir pik genişliği isteniyorsa, lock SD seçeneğini işaretleyin, PKH 26 negatif kontrolünü yükleyin ve dimus yavru nesli için pik kanalını PKH 26 negatif hücrelerin üzerine ayarlayarak nesil sayısını düzenleyin.

Bu işlem, kız kuşak sayısını belirler. Model tamamlandığında doğru şekilde uydurulabilir. Uyarılmış PKH 26 pozitif dosyayı yeniden yükleyin.

Eğer ayırt edilebilir nesil pikleri belirginse, model seçeneği altındaki yüzer (floating) ayarı seçin. Eğer log onlukları tam olarak 4.0 değilse, makalede tartışıldığı şekilde nesil aralığını ayarlayın. Şimdi, stimüle edilmiş örneği analiz edin ve ebeveyn pik pozisyonu bölgesinin değişmeden kaldığını doğrulayın.

Son olarak, uygulanacak veri setindeki her bir deneysel dosya için "analyze" (analiz et) seçeneğini belirleyin. Yeni oluşturulan model ile veri setindeki her bir deneysel dosya için en iyi uyum sonucunda elde edilen istenen proliferasyon metriklerini kaydedin. Bu ilk veri serisi, karıştırma tekniğinin PKH 26 floresan dağılımları üzerindeki etkisini göstermektedir.

Kültüre edilen U 9 37 myeloid hücreleri, az önce açıklanan yöntem kullanılarak hücre takip boyası ile boyanmıştır; bu ilk histogram boyanmamış kontrol verilerini göstermektedir. Sitometre ayarları, bu hücrelerden gelen otoflüoresansın ilk dekatta yer alacak ve ilk kanalda hiç veya çok az hücre birikecek şekilde ayarlanmıştır. Bu ikinci histogram ise başarılı PKH 26 boyamasını örneklendirmektedir.

İki x hücrenin iki x boyasıyla hızla karıştırılması; parlak, homojen ve simetrik bir floresans dağılımı vermiş, ancak önceki histogram için kullanılan cihaz ayarlarında ölçek dışı kalan hücrelere rastlanmamıştır. İki x hücre, hemen karıştırılmadan iki x boyasına eklendiğinde daha heterojen bir floresans dağılımı elde edilmiştir. Sönük olarak işaretlenmiş bu küçük alt popülasyon, bu deneyin final histogramında daha sonraki bir zaman noktasında mevcut olsalardı, hatalı bir şekilde yavru hücreler olarak yorumlanabilirdi; ayrıca, 3 µL konsantre etanol boya stoğunun yanlışlıkla 0.5 mL iki x hücre süspansiyonuna doğrudan eklenmesi durumunda da yetersiz karışım meydana gelmiş ve bu durum oldukça sönük ve sağa çarpık bir floresans yoğunluk dağılımı ile sonuçlanmıştır.

Burada, PKH 20 ile boyanmış insan periferik kan mononükleer hücrelerinin stimülan anti-CD3 ve IL-2 reaktifleri ile veya bunlar olmadan kültüre edildiği bir proliferasyon deneyinden elde edilen tipik sonuçlar gösterilmektedir. 96 saatlik kültürden sonra hücreler hasat edilmiş ve anti-CD3 PE, anti-CD19 APC ve seven-AAD ile karşıt boyama yapılmıştır.

İki farklı kapılama stratejisi karşılaştırılmıştır; ilk kapılama stratejisinde, CD3'e karşı 7-AAD nokta grafiği kullanılmıştır. Canlı 7-AAD negatif CD3 pozitif T hücrelerini seçmek için 7-AAD kullanılmıştır. Daha sonra, blast lenfositleri dahil ederken büyük agregatlar dışarıda bırakmak için bir ileri ve yan saçılım bölgesi kullanılmıştır.

Boyanmamış kontrol için R1 + R2 kapılı olaylar gri histogramla, PKH26 ile boyanmış ancak uyarılmamış hücreler ise mavi ile gösterilmiştir; uyarılmamış kontroldeki canlı ancak bölünmemiş T hücreleri için parlak, simetrik ve homojen boyamaya dikkat ediniz. Bu veriler önceki şekilde olduğu gibi kapılanmıştır, ancak bu durumda hücreler anti-CD3 ve IL2 ile uyarılmıştır. R1 + R2 kapılı olaylar için PKH26 histogramı, artık ağırlıklı olarak her bir yavru nesil için renkli piklerle temsil edilen, şiddeti azalmış bölünmüş hücreleri içermektedir.

Mavi ebeveyn pikinde hala bazı parlak bölünmemiş hücreler kalmış olsa da, yüksek düzeyde bölünmüş hücrelerin yoğunluğunun henüz boyanmamış hücrelerin ölçüldüğü bölgeyle örtüşmediğine dikkat edin; bu durum, buradaki en düşük yoğunluktaki yavru nesillerdeki hücre sayısına dayalı metriklerin tahminini karıştırabilirdi. Aynı veriler, önceki iki figür setiyle aynı şekilde analiz edilmiştir, ancak canlı T hücrelerini seçmek için yalnızca ışık saçılımı ve CD3 kullanılmıştır.

Bu kapılama stratejisi, CD3 ile 7-AAD nokta grafiklerinde kalan küçük bir kalıntı popülasyon olan yedi A a D pozitif ölü hücrelerle gösterildiği üzere, ölü hücrelerin çoğunu ancak tamamını değil dışlar. Hücre takip boyaları kullanıldığında, bölünmemiş hücrelerin boyanma yoğunluğu aşırı parlak olduğu için immünofenotipleme için seçilen florokromlar zorlayıcı kompanzasyon sorunları yaratabilir. Bu deneyde, 24 saatlik periferik kan mononükleer hücreleri PKH 26 ile işaretlenmiş ve ardından CD3 ve CD4 antikorları ile bir canlılık boyasıyla karşı boyanmıştır.

Bu veri serisinde, 2 µM PKH 26 ile işaretlenmiş hücreler, anti-CD3 FITC ve anti-CD4 APC ile karşıt boyama işlemine tabi tutulmuş ve ardından daha önce kullanılan R1+R2 kapılama stratejisinin aynısı kullanılarak analiz edilmiştir; PKH 26'nın APC kanalına sızıntısı (overlap) çok az olduğu için, kompanzasyon uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın CD4 pozitif ve negatif olaylar net bir şekilde ayırt edilmiştir. Bu veriler, nihai PKH 26 konsantrasyonu 4 µM'ye çıkarıldığında bile canlı CD3 pozitif CD4 pozitif T hücrelerinin nasıl iyi bir şekilde ayırt edilebildiğini göstermektedir. Anti-CD4 PerCP'nin, anti-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 ve canlılık boyası Propidium Iodide (PI) ile birlikte kullanımı, PKH 26'nın PerCP kanalına belirgin sızıntısı nedeniyle çok daha düşük kaliteli sonuçlar vermiştir.

Telafi edilmemiş verilerde CD four pozitif ve negatif hücreler birbirinden ayırt edilemedi ve telafi uygulandığında ise yalnızca sınırlı ölçüde ayırt edilebildiler. Nihai PKH 26 konsantrasyonunun dört mikromolar seviyesine çıkarılması, telafi uygulandıktan sonra bile CD four pozitif olayların CD four negatif olaylardan ayırt edilme yeteneğinin tamamen kaybolmasıyla sonuçlandı. CP başına anti CD four içeren veya içermeyen örneklerin esasen özdeş olduğuna dikkat edin.

Ardışık kız nesil hücrelerinin sıklığını tahmin etmek için bir boya dilüsyon profili pik modelleme yazılımı kullanılarak analiz edildiğinde, ardışık kız piklerinin konumları ve/veya genişlikleri sabitlenebilir veya serbest bırakılabilir. Bu değerler, ebeveyn piki değerlerine göre belirlenir. Söz konusu değerler, uyarılmamış kontrolden tahmin edilir.

Örneğin, bu PKH 26 yoğunluk profili orta derecede yanıt veren bir bireyden alınan uyarılmamış 96 saatlik bir kültürden alınmıştır ve mod fit proliferasyon sihirbazına, bölünmemiş ebeveyn hücreleri temsil eden pik için konum ve genişliğe dair ilk tahmini sağlamak amacıyla kullanılmıştır. Pik konumu için sabit bir ayarın kullanılması, her jenerasyonel pikin ortalamasının, önceki pikin floresans yoğunluğunun tam olarak yarısı olmasını gerektirir. Pik konumu için değişken (float) bir ayar seçeneği, en iyi uyumu elde etmek için ihtiyaç duyulduğunda jenerasyonel piklerin nihai konumlarının beklenen yoğunluklardan farklılaşmasına olanak tanır.

Benzer şekilde, pik genişliği için sabit bir ayar, her bir nesil piki genişliğinin, ebeveyn veya uyarılmamış kontrol piki genişliği ile aynı olmasını gerektirir. Pik genişliği için değişken bir ayar ise, bu tabloda en iyi uyumu elde etmek için nihai genişliklerin gerektiği gibi bağımsız olarak değiştirilmesine olanak tanır. Ayırt edilebilir nesil piklerinin belirgin olduğu iki farklı donör için önceki şekillerin analiz sonuçları, bu donörler için gösterilmiştir.

En iyi indirgenmiş ki-kare değerleri, hem pik konumunun hem de genişliğinin serbest bırakıldığı durumlarda elde edilmiştir; ayırt edilebilir generasyonel piklerin belirgin olmadığı proliferasyon profilleri için pik konumu için sabit bir ayar önerilir. Bu veriler, bir akış sitometrik immünsüpresyon analizinde farklı immün hücre tiplerinin proliferasyon geçmişlerini ayrı ayrı izlemek için iki takip boyasının kullanımını örneklemektedir. Yeşil renkle gösterilen T efektör hücreleri CFSE ile, mavi renkle gösterilen T regülatör hücreleri ise cell view ile işaretlenmiştir.

Bordo etiketli hücre popülasyonları farklı oranlarda karıştırılmış ve anti CD 3, anti CD 28 ve ışınlanmış yardımcı hücrelerin varlığında 96 saat boyunca kültüre edilmiştir. Ardından, hücreler hasat edilmiş ve anti CD 4, PE 7-ADL ve live dead violet ile boyanmıştır. Burada, live dead violet pozitif hücreler kapılamadan sonraki 0,25:1 treg/T efektör oranı için temsilci veriler gösterilmektedir.

Lenfositleri ve blastları kapsayan, ancak agregatları ve döküntüleri dışlayan bir ışık saçılım kapısı uygulandı, ardından CD four pozitif olayları kapsayan bir kapı eklendi. Cell view claret boyaması, canlı treg hücrelerinin, yüksek düzeyde prolifere olmuş ve bu nedenle CFSE DIM proliferasyon profilleri sergileyen canlı T efektör hücrelerinden kolayca ayırt edilmesini sağladı; böylece CFSE pozitif T efektör hücreleri ve cell view Claret pozitif treg hücreleri mod fit peak modelleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Yaklaşık 25,000 olay analiz edildi.

Bunların %48'i canlı T efektörleri, %6'sı canlı T reg'ler idi; geri kalanı ise ölü hücreler, aksesuar hücreler ve debrisden oluşmaktaydı. Analiz süresi boyunca hücre sayısındaki kat artışı yansıtan hesaplanan proliferasyon indeksi, T efektörleri için 3,85 ve Treg'ler için 1,83 olarak bulundu. Burada, CFSE boya dilüsyon profilinden hesaplanan T efektör hücrelerinin proliferasyon indeksi üzerinde Treg hücre konsantrasyonunun etkisi gösterilmiştir.

Treg hücreleri Cell View Claret ile işaretlense de işaretlenmese de sonuçlar aynı çıkmıştır, bu da boyamanın Treg fonksiyonunu değiştirmediğini göstermektedir. İzleme sonucunda beklendiği üzere, Treg hücrelerinin konsantrasyonu azaldıkça efektör T hücrelerinin proliferasyon düzeyi artmıştır. Farklı Treg/efektör T oranlarındaki Cell View Claret boya seyreltme profillerinden Treg hücresi proliferasyon indeksleri de hesaplanmıştır.

Beklendiği üzere, T efektör hücre konsantrasyonu arttıkça, T efektör hücrelerinin yokluğunda Treg hücreleri minimal proliferasyon göstermiştir. Bununla birlikte, Treg hücre proliferasyonunun derecesi de artış göstermiştir. Videoyu izledikten sonra, hücre proliferasyonunu izlemek için hücre takip boyalarının nasıl başarıyla kullanılacağına, uygun florokromların ve renk kompanzasyon kontrollerinin nasıl seçileceğine ve boya dilüsyonuna dayanarak hücre bölünmesini nicelendirmek için uygun bir modelin nasıl seçileceğine dair kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu prosedürün yanı sıra, antijene özgü T hücrelerinin boyanması veya durgun ya da yavaş bölünen kök hücre benzeri hücrelerin geri kazanımı için akışla ayıklama gibi deneysel soruları yanıtlamak amacıyla diğer yöntemler de uygulanabilir. İzlediğiniz için çok teşekkürler.