Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Bu yöntemin genel amacı, karmaşık popülasyonlar içindeki farklı bağışıklık hücresi alt kümeleri için hücre bölünmesinin derecesini doğrudan ölçmek için hücre izleme boyalarını kullanmaktır. Bu, ilk olarak ana hücre popülasyonunun, hücresel proteinlere stabil bağlanma sağladığı bilinen bir floresan boya ile işaretlenmesi veya stimülasyon sayaçlarına yanıt veren boya etiketli hücrelerin izlenmesi için hücresel zarlara kovalent olmayan bir şekilde interkalatasyon yapılması, floresan antikorlarla boyama ve çok parametreli akış sitometrisi kullanılarak analiz, uyarılan ilgilenilen bağışıklık hücresi türleri arasındaki farklı yanıtların saptanmasına izin verir, Ancak, izleme boyası etiketli otofloresan izleme boyasından ayırt edilebilen en düşük yavru hücre floresan yoğunluğunu belirlemek için boyanmamış kontroller kullanılır, ancak daha sonra bölünmemiş hücrelerin tespit edileceği floresan yoğunluğunu belirlemek için uyarılmamış kontroller kullanılır. Stimülasyon tipik olarak, yanıt olarak çoğalan hücreler giderek daha yavaş hale geldiğinden, ancak yanıt vermeyenler olmadıkça geniş bir yoğunluk aralığına neden olur.

Sonuç olarak, farklı nesillerdeki hücrelerin nispi frekansını tahmin etmek için tepe modelleme yazılımının kullanılması, proliferasyon indeksi veya öncü frekans gibi metrikleri kullanarak farklı popülasyonlar veya uyaranlar arasında proliferatif tepkilerin nicel olarak karşılaştırılmasına izin verebilir. Bu tekniğin tritiated, thy dahil etme veya KI 67 ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, DI seyreltmesinin, immünofenotipleme ve sitokin üretimi gibi diğer ME akış sitometrik ölçümleriyle birleştirilebilen doğrudan bir hücre bölünmesi ölçüsü sağlamasıdır. Membran boya boyama yönteminin görsel olarak gösterilmesi, hücreler tarafından boya alımı son derece hızlı olduğu için yararlıdır.

Sonuç olarak, iyi bir teknik, parlak homojen boyama elde etmenin anahtarıdır. İnsan periferik kan mononükleer hücreleri izole edildikten sonra, trombosit kontaminasyonunu en aza indirmek için 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra peleti HBSS artı% 1 BSA'da mililitre başına 10 ila yedinci hücrelerde yeniden süspanse edin ve buzun üzerine yerleştirin.

500 mikrolitrelik bir Eloqua'yı çıkarın ve ayırın, ardından 500 mikrolitrelik başka bir hücre alikotunu 12 x 75 milimetre konik polipropilen tüpe aktarın. 3,5 mililitre HBSS ekleyin ve hücreleri 400 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün, yıkama sırasında PKH 26 GL kitinden 0,5 mililitre seyreltici C etiketleme aracını başka bir 12 x 75 mililitre konik polipropilen tüpe ekleyin, süper natini dikkatlice aspire edin, 15 ila 25 mikrolitreden fazla artık sıvı bırakmadan ve herhangi bir hücreyi çıkarmamaya dikkat edin. Daha sonra, hücre peletine 0.5 mililitre seyreltici C etiketleme aracı ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için çözeltiyi birkaç kez aspire edin ve dağıtın.

Şimdi, seyreltici C içeren tüpe iki mikrolitre PKH 26 ekleyerek iki XD stoğunu hazırlayın.Ancak şimdi hücre süspansiyonunu hemen taze hazırlanmış iki XPKH 26 boya çözeltisine pipetleyin ve hücreleri boya boyunca eşit şekilde dağıtmak için karışımı aynı anda aspire edin ve dağıtın. Bir dakika sonra, boyanın hücre zarlarına alımını durdurmak için bir mililitre ısıyla inaktive edilmiş serum ekleyin. Hücreleri döndürdükten sonra, peleti çıkarmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Daha sonra peleti% 10 ısıyla etkisiz serum içeren dört mililitre tam ortama dağıtın ve hücre süspansiyonunu taze bir polipropilen tüpe aktarın. Hücreleri HBSS artı %1 BSA'da iki kez yıkayın, yeterince boyanmış hücreler pelette belirgin bir pembe renk tonu sergileyecektir Hücre peletini bir mililitre HBSS artı %1 BSA'da yeniden askıya aldıktan sonra, hücreleri sayın ve ardından hacmi, mililitre başına 10 ila yedinci hücreler arasında bir nihai konsantrasyon verecek şekilde ayarlayın. Hücreleri tabloda belirtilen akış sitometrik protokolüne göre boyadıktan sonra, ileri saçılma ve yan saçılma parametrelerini ve dört floresan dedektörünün tümündeki sinyalleri ayarlamak için ilk beş tüpü kullanın.

Özellikle, ikinci tüpteki PKH 26 floresansını izlemek için kullanılan dedektör için. Tüm PKH 26 lekeli hücrelerin, üçüncü ila dördüncü on yılda ölçekte tek bir simetrik tepe olarak göründüğünü ve son kanalda çok az hücre olduğunu veya hiç hücre olmadığını doğrulayın. Daha sonra, diğer üç florokromları izlemek için kullanılan dedektörlerdeki her fluro için bir renk örtüşme matrisi oluşturmak için renk dengeleme yazılımını ve bir ila beş tüpler için toplanan liste modu dosyalarını kullanın.

Ardından bu matrisi örnek altı için liste modu dosyasına uygulayın. PKH 26 etiketlemesinin varlığının yedi A D pozitif hücreyi tespit etme yeteneğini değiştirmediğini doğrulamak için. Şimdi bu yeni kurulan renk örtüşme matrisini yedinci tüp için liste modu dosyasına uygulayın.

Bir FE ve bir PC grafiğinde CD üç pozitif, CD dört negatif ve CD üç pozitif CD dört pozitif popülasyonu tanımlayın. Anti CD üç, FE ve anti CD dört A PC'nin varlığının yedi A D pozitif hücreyi tespit etme yeteneğini değiştirmediğini onaylayın. Son olarak, yedinci tüp için renk örtüşme matrisini sekizinci tüp için dosya liste moduna uygulayın.

Şimdi bir proliferasyon analiz modülü içeren bir program açın. Uyarılmış PKH 26 lekeli dosyayı analiz edilecek veri kümesinden yükleyin. Daha sonra, bu durumda analiz için parametreleri seçin, PKH 26, canlı yedi a d negatif cd, üç pozitif lenfosit ve küçük döküntülerin ve büyük agregaların dışlanması için ileri saçılmaya karşı yan saçılma üzerine kapılıdır.

Bu bölgeleri tanımlarken, patlamaların tipik olarak bulunduğu yüksek ileri saçılma alanını dahil etmeye dikkat edin. Ardından, çoğalma sihirbazını açın. Veri dosyasını açmak için başlat sekmesine tıklayın ve ardından uyarılmamış PKH 26 pozitif kontrolünü yükleyin.

Bölünmemiş hücrelere karşılık gelen ebeveyn zirvesinin konumunu tanımlayın. Ebeveyn tepe konumu ve genişliği değerlerini not ederek dosyayı analiz edin. Sabit bir tepe genişliği isteniyorsa, SD kilidini kontrol edin, P KH 26 negatif kontrolünü yükleyin ve dimus kızı nesli için tepe kanalını PKH 26 negatif hücrelerin üzerine ayarlayarak nesil sayısını ayarlayın.

Bu, kız nesillerin sayısını belirler. Model tamamlandığında doğru bir şekilde sığabilir. Uyarılmış PKH 26 pozitif dosyasını yeniden yükleyin.

Ayırt edilebilir nesil zirveleri belirginse, model seçeneği altında kayan ayarı seçin. Günlük on yıllar tam olarak 4.0 değilse, makalede tartışıldığı gibi nesil aralığını ayarlayın. Şimdi, uyarılmış numuneyi analiz edin ve ebeveyn tepe pozisyonu bölgesinin değişmeden kaldığını onaylayın.

Son olarak, uygulanacak veri kümesindeki her deneysel dosya için analiz et'i seçin. Model, veri kümesindeki her deneysel dosya için en uygun olandan kaynaklanan istenen çoğalma ölçümlerini yeni oluşturdu ve kaydetti. Bu ilk veri serisi, karıştırma tekniğinin PKH 26 floresan dağılımları üzerindeki etkisini göstermektedir.

Kültürlendiğinde, U 9 37 miyeloid hücreler, az önce açıklanan yöntem kullanılarak hücre izleme boyası ile boyandı, bu ilk histogram boyanmamış kontrol verilerini gösterir. Sitometre ayarları, ilk kanalda hiç hücre birikmeden veya çok az hücre birikmeden ilk on yılda bu hücrelerden otofloresan yerleştirmek için ayarlandı. Bu ikinci histogram, iyi bir PKH 26 boyamayı göstermektedir.

İki x hücresinin iki x boyası ile hızlı bir şekilde karıştırılması, parlak, homojen ve simetrik bir floresan dağılımı verdi, ancak önceki histogram için kullanılan cihaz ayarlarında ölçek dışı hücre yoktu. Hemen karıştırılmadan iki x boyasına iki x hücresi eklendiğinde, daha heterojen bir floresan dağılımı elde edildi. Loş etiketli hücrelerin bu küçük alt popülasyonu, bu deneyin son histogramında daha sonraki bir zaman noktasında mevcut olsaydı, hatalı bir şekilde yavru hücreler olarak yorumlanacaktı, üç mikrolitre konsantre etanol boya stoğu yanlışlıkla doğrudan 0.5 mililitre iki x hücre süspansiyonuna eklendiğinde de zayıf karıştırma meydana geldi ve son derece loş ve sağa çarpık bir floresan yoğunluğu dağılımı elde edildi.

Burada, PKH 20 ile boyanmış insan periferik kan mononükleer hücrelerinin stimülatör ile veya stimülatör olmadan kültürlendiği bir proliferasyon deneyinden elde edilen tipik sonuçlar. Anti CD üç ve IL iki reaktifleri gösterilmiştir. 96 saatlik kültürden sonra, hücreler hasat edildi ve anti CD, üç FE anti CD 19 A PC ve yedi A a d ile karşı boyandı.

İlk geçit stratejisinde iki farklı geçit stratejisi karşılaştırıldı, CD üçe karşı yediden oluşan bir nokta grafiği. A, A, D, canlı yedi a a d negatif CD, üç pozitif T hücresi seçmek için kullanıldı. Daha sonra, patlatma lenfositlerini dahil ederken büyük agregaları dışarı çıkarmak için bir ön ve yan saçılma bölgesi kullanıldı.

Boyanmamış kontrol için R bir artı R iki kapılı olaylar, gri histogram ile temsil edilir ve PKH 26 boyanmış, ancak uyarılmamış hücreler mavi notadadır, uyarılmamış kontrolde canlı ancak bölünmemiş T hücreleri için parlak simetrik homojen boyama. Bu veriler önceki şekille aynı şekilde kapılandı, ancak bu durumda, hücreler anti CD üç ve IL iki ile uyarıldı. R bir artı R iki kapılı olaylar için PKH 26 histogramı, artık her bir yavru nesil için renkli tepelerle temsil edilen azaltılmış yoğunluğa sahip çoğunlukla bölünmüş hücreler içeriyor.

Her ne kadar bazı parlak bölünmemiş hücreler hala mavi ebeveyn zirvesinde kalsa da. Yüksek oranda bölünmüş hücrelerin yoğunluğunun, boyanmamış hücrelerin ölçüldüğü bölge ile henüz örtüşmediğine dikkat edin, bu da buradaki en düşük yoğunluklu yavru nesillerdeki hücre sayısına dayalı metriklerin tahminini karıştıracaktır. Aynı veriler, önceki iki şekil seti ile analiz edildi, ancak canlı T hücrelerini seçmek için sadece ışık saçılımı ve CD üç kullanıldı.

Bu geçit stratejisi, CD'de kalan yedi A a D pozitif ölü hücrelerin küçük kalıntı popülasyonu tarafından gösterildiği gibi, ölü hücrelerin çoğunu hariç tutar, ancak hepsini değil, üç A A D nokta grafiği. İmmünofenotipleme için kullanılan florokromların seçimi, bölünmemiş hücrelerin boyama yoğunluğu son derece parlak olduğundan, hücre izleme kalıpları kullanılırken zorlu telafi sorunları yaratabilir. Bu deneyde, 24 saatlik periferik kan mononükleer hücreleri PKH 26 ile etiketlendi ve daha sonra CD üç ve CD dördüne karşı antikorlar artı bir canlılık boyası ile karşı boyandı.

Bu veri serisinde, iki mikromolar PKH 26 ile etiketlenmiş hücreler, anti CD üç FZ yedi A D ve anti CD dört A PC ile karşı boyandı ve daha sonra aynı R bir artı R iki geçit stratejisi kullanılarak analiz edildi, çünkü PKH 26'nın A PC kanalına çok az örtüşmesi vardır, Dörtlü pozitif ve negatif olaylar, tazminat uygulanıp uygulanmadığı net bir şekilde çözüldü. Bu veriler, canlı CD üç pozitif CD dört pozitif T hücresinin, son PKH 26 konsantrasyonu dört mikromolar seviyeye yükseltildiğinde bile nasıl iyi çözüldüğünü göstermektedir. Anti CD üç FE iki mikromolar PKH 26 ile kombinasyon halinde CP başına dört anti CD kullanımı ve pro üçe canlılık kalıbı, PKH 26'nın CP başına kanala önemli ölçüde örtüşmesi nedeniyle çok daha kötü sonuçlar verdi.

CD dört pozitif ve negatif hücre, telafi edilmemiş verilerde birbirinden çözülemedi ve kompanzasyon uygulandığında sadece marjinal olarak çözüldü. Nihai PKH 26 konsantrasyonunun dört mikromolar seviyeye yükseltilmesi, kompanzasyon uygulandıktan sonra bile CD dört pozitiften CD dört negatif olayı çözme yeteneğinin tamamen kaybolmasına neden oldu. CP başına anti CD dört içeren veya içermeyen örneklerin temelde nasıl aynı olduğuna dikkat edin.

Bir boya seyreltme profili, ardışık yavru nesillerdeki hücrelerin sıklığını tahmin etmek için tepe modelleme yazılımı kullanılarak analiz edildiğinde, ardışık yavru tepelerin konumları ve/veya genişlikleri sabit veya yüzer olabilir. Ebeveyn zirvesi için değerlere göre. Bu değerler uyarılmamış kontrolden tahmin edilir.

Örneğin, bu PKH 26 yoğunluk profili, orta derecede bir yanıtlayıcıdan uyarılmamış 96 saatlik bir kültürden alınmıştır ve mod fit proliferasyon sihirbazına, bölünmemiş ebeveyn hücrelerini temsil eden tepe için ilk konum ve genişlik tahminini sağlamak için kullanılmıştır. Tepe konumu için sabit bir ayarın kullanılması, her nesil tepe noktasının ortalamasının, önceki tepe noktasının floresan yoğunluğunun tam olarak yarısı olmasını gerektirir. Tepe konumu için bir şamandıra ayarı, en iyi uyumu elde etmek için nesil tepe noktalarının nihai konumlarının gerektiği gibi beklenen yoğunluklardan farklı olmasına izin verir.

Benzer şekilde, tepe genişliği için sabit bir ayar, her bir nesil zirvesinin genişliğinin, ebeveyn veya uyarılmamış kontrol zirvesininkiyle aynı olmasını gerektirir. En yüksek genişlik için bir şamandıra ayarı, bu tabloya en iyi uyumu elde etmek için nihai genişliklerin gerektiği gibi bağımsız olarak değiştirilmesine olanak tanır. İki farklı bağışçı için önceki rakamların analizlerinin sonuçları, belirgin kuşak zirvelerinin belirgin olduğu bu bağışçılar için gösterilmiştir.

En iyi indirgenmiş ki-kare değerleri, ayırt edilebilir kuşak zirvelerinin belirgin olmadığı proliferasyon profilleri için hem tepe konumunun hem de genişliğin yüzmesine izin verildiğinde elde edildi, tepe konumu için sabit bir ayar önerilir. Bu veriler, bir akış sitometrik immün supresyon testinde farklı immün hücre tiplerinin proliferasyon geçmişlerini ayrı ayrı izlemek için iki izleme boyasının kullanımını göstermektedir. Yeşil ile gösterilen T efektör hücreleri CFSE ile etiketlendi ve mavi ile gösterilen T düzenleyici hücreler hücre görünümü ile etiketlendi.

Bordo işaretli hücre popülasyonları değişen oranlarda karıştırıldı ve 96 saat boyunca anti CD üç, anti CD 28 ve ışınlanmış aksesuar hücrelerin varlığında kültürlendi. Daha sonra hücreler toplandı ve anti CD dört, PE boyutu yedi ve canlı ölü menekşe ile boyandı. Burada. 0.25'e bir treg / T efektör oranı için temsili veriler, canlı ölü menekşe pozitif hücreler dışarı atıldıktan sonra gösterilir.

Lenfositleri ve patlamaları içeren, ancak agregaları ve döküntüleri dışlayan bir ışık saçılma kapısı uygulandı, ardından CD dört pozitif olayı içerecek bir kapı izledi. Hücre görünümü bordo boyama, canlı treg hücrelerinin yüksek oranda prolifere olan canlı T efektör hücrelerden kolayca ayırt edilmesini sağladı ve bu nedenle CFSE pozitif T efektör hücreler için CFSE DIM proliferasyon profilleri ve hücre görünümü Bordo pozitif treg hücreleri mod fit pik modelleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Yaklaşık 25.000 olay analiz edildi.

Bunların% 48'i canlı T efektörleriydi,% 6'sı canlı T reg'leriydi, geri kalanı ölü hücreler, aksesuar hücreler ve döküntülerdi. Test süresi boyunca hücre sayısındaki kat artışını yansıtan hesaplanan proliferasyon indeksi, T efektörleri için 3.85 ve Tregs için 1.83 idi. Burada, tregs hücre konsantrasyonunun, CFSE boya seyreltme profilinden hesaplanan T efektör hücrelerinin proliferasyon indeksi üzerindeki etkisi gösterilmektedir.

Sonuçlar, treg hücrelerinin hücre görünümü bordo ile etiketlenip etiketlenmediği veya boyanmadan bırakılıp bırakılmadığı konusunda aynıydı, bu da treg fonksiyonunun boyama ile değiştirilmediğini gösteriyordu. Beklendiği gibi izleme ile, treg hücrelerinin konsantrasyonu azaldıkça tektor proliferasyonunun kapsamı artmıştır. Treg hücre proliferasyon indeksleri, farklı treg / T efektör oranlarında hücre görünümü bordo boya seyreltme profillerinden de hesaplandı.

Beklendiği gibi, Treg'ler, T efektör hücre konsantrasyonu arttıkça T efektör hücrelerinin yokluğunda minimal proliferasyona uğradı. Bununla birlikte, treg hücre proliferasyonunun derecesi de artmıştır. Videoyu izledikten sonra, hücre proliferasyonunu izlemek için hücre izleme boyalarının nasıl başarılı bir şekilde kullanılacağını, uygun florokromların ve renk dengeleme kontrollerinin nasıl seçileceğini ve boya seyreltmesine dayalı hücre bölünmesini ölçmek için uygun bir modelin nasıl seçileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürle birlikte, antijene özgü T hücrelerinin boyanması veya hareketsiz veya yavaş bölünen kök benzeri hücrelerin geri kazanılması için akış sıralaması gibi deneysel soruları yanıtlamak için başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. İzlediğiniz için çok teşekkürler.