Name: Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Öğrenin, hücre izleme boyaları ve akış sitometrisi kullanarak bağışıklık hücrelerinin bölünmesini doğrudan nicelendirmeyi. Bu yöntem, pik modelleme yazılımı ile karmaşık popülasyonlarda proliferasyon yanıtlarını analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Hücre Bilimi ve PTI Araştırma): Yazarlar, özellikle yıllar boyunca bu yöntemlerin geliştirilmesi için teknik ve entelektüel katkıları için aşağıdaki kişilere teşekkür etmek istiyorum Brian Gray (PTI Araştırma), Jan Fisher (Dartmouth Tıp Okulu), Alice Givan (Dartmouth Tıp Okulu), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc) ve Mary Waugh (Dartmouth Tıp Okulu). Onlar da Şekil 2&#39;de gösterildiği verileri oluşturulan Yıllık Araştırma Yöntemleri Dersler ve Flow Sitometri Uygulamaları, 2006 yılının Bowdoin sınıf teşekkür etmek istiyorum. Flow sitometri NIH Paylaşılan Enstrüman Programı ekipman hibe kısmen kurulmuş Roswell Park Kanser Enstitüsü Akım Sitometri Laboratuvarı, gerçekleştirilen ve Milli gelen Çekirdek Grant (5 P30 CA016056-29) destek alır edildiKanser Roswell Park Kanser Enstitüsü ve Abramson Kanser Merkezi Akış Sitometri ve NIH Paylaşılan Enstrüman Programı ekipman hibe kısmen kuruldu Pennsylvania Üniversitesi, Hücre Ayırma Kaynak Laboratuvarı Enstitüsü ve NIH # 2P30 destek alır Ulusal Kanser Enstitüsü&#39;nden CA016520. Şekil 3 ve 5&#39;te gösterilmiştir çalışmaları da PTI Research, Inc verilir Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Ulusal Enstitüsü (NIBIB) den SBIR hibe EB00228 tarafından kısmen desteklenmiştir

1. PKH26 Cep Takip Dye ile Genel Membran Etiketleme (Ref. 25; Şekil 1) <ol><li> 1.9 - 1.1 adımları steril tekniği kullanın. Trombosit kontaminasyonu en aza indirmek için bir son 300 xg spin ilavesi ile laboratuarın standart metod kullanılarak ~ 10 7 insan periferik kan mononükleer hücreleri veya lenfositler (hPBMC, hPBL) hazırlayın. Adım 2 kullanılmak için bir 500 ul alikot (5x10 6 hücre), rezerv, buz üzerinde 10 HBSS +% 1 BSA ve yerinde 7 / ml &#39;de hücreler yeniden süspanse edin. </li><li> Bir 12 x 75 mm&#39;lik polipropilen konik tüpe il 5x10 6 hücreleri (500 ul). 3,5 ml HBSS ile bir kez yıkayın. Dikkatle rezidüel sıvı artık 15-25 daha ul bırakarak, ancak hücreleri çıkarmak için özen, süpernatant aspire. Adım 1.4 &#39;de 2x hücre süspansiyonu hazırlamak için bu tüpü kullanın. </li><li> Basamak 1.2 &#39;de yıkama esnasında hücre, bir 12 x 75 mm&#39;lik polipropilen konik tüpe Seyreltici C etiketleme araç ve 0,5 ml (PKH26GL kit) ekleyin. Hazırlık için bu tüpü kullanınAdım 1.5 2x PKH26 çözümdür. </li><li> Aşama 1.2 &#39;den yıkanmış hücre peleti seyreltici C etiketleme araç 0.5 ml ilave edilir ve tek bir hücre süspansiyonu (2 x hücreleri) elde etmek için 3-4 kez aspire ve dağıtmak. Hücre canlılığı ve kurtarma azaltabilir kabarcık oluşumu ve karıştırma, aşırı kaçının. </li><li> Hemen Adım 1.4 2x hücre süspansiyonu hazırlandıktan sonra, Adım 1.3 ve vorteks için hazırlanan Dilüent C tüp etanol içinde 1.0 mM PKH26 boya stoku (PKH26GL kiti) 2.0 ul ekleyerek 2x (4 uM) boya çözeltisi hazırlamak eşit dağıtmak. </li><li> Hemen Adım 1.5 2x boya çözeltisinin hazırlanmasından sonra, hızla 2x boya çözeltisi içine Adım 1.4 2x hücre süspansiyonu Pipeti ve aynı anda aspire ve tamamen boya hücreleri dağıtmak için 3-4 kez vazgeçemeyeceği yapın:. Doğrudan 1.0 mM boya ekleyin hücreleri; 2x boya içine 2x hücreleri dökün; veya vorteks ise boya 2x 2x hücreleri ekleyin. Boyama neredeyse anlık olduğundan, bu tür yöntemleri daha az verimÖnerilen yöntem daha üniform şiddetleri (Şekil 2). </li><li> 1 dakika sonra, ısı inaktive serum veya hücre zarının içine boya alımını durdurmak için HBSS +5% BSA 1.0 ml ekleyin. Yeterince protein kullanmayı Başarısızlık yıkama adımları sırasında hücreleri ile pelet can ve diğer hücrelerin istenmeyen etiketleme neden bir deney mevcut boya agrega, oluşumu riski. % 10 ısıyla inaktive serum (CM) ve HBSS +% 1 BSA ile orta durdurma ayıraç olarak kullanılacak ise, bir 15 ml polipropilen konik tüpe boyanma gerçekleştirmek ve her adsorpsiyonu temin etmek durdurma reaktif en az 5.0 mL adi boya. </li><li> 5 dk için etiketli hücreler santrifüje @ ~ 400 x g. Hücreler çıkarmadan süpernatant dikkatlice aspire. Iyi recentrifugation önce pelet dispersiyon, CM veya HBSS +1% BSA 4 ml ile iki kez pelet yıkayın. Tüp duvarları üzerinde adsorbe edilen boyarmadde taşınmasını en aza indirmek ve yıkama verimliliği maksimize etmek için, fi sonra taze polipropilen tüp hücreleri aktarmakrst resüspansiyon. Not: yeterince lekeli hücreler topak belirgin bir pembe bir belirti sergileyecektir. </li><li> 1.0 ml HBSS +1% BSA yıkanmış hücre pelletini tekrar. , Hücreleri sayın hücre elde belirlemek, ve 10 7 / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon vermek için hacim ayarlayın. Dikkatli aspirasyon ile, hücre kurtarma ≥% 85 olmalıdır. Hücre kurtarma &lt;% 70 ise, devam etmeden önce nedenini belirlemek. Adım 2 kullanım için buz üzerinde 150 ul kısım (1.5x10 6 hücre) ve yeri çekin. </li></ol> 2. Enstrüman ve Test Ayar Kontrolleri Hazırlanması (Tablo 1) <ol><li> 1, 3, 4, 5 ve 7: beş 1.8 ml Eppendorf tüpleri içine her Adım 1.1 kaydedilmiş hücre süspansiyonu boyanmamış hücreleri 50 ul alikot (5x10 5). 2, 6 ve 8: PKH26 pos üç tüplerin her birine Aşama 1.9 &#39;den hücre 50 ul alikot (5x10 5). </li><li> Tüpler 1-8 için; 10 ul IgG bloğu (Reaktiflerin tabloya bakınız 100 mikrogram / IgG tüp) ekleve ortam sıcaklığında (20-25 ° C) sıcaklıkta 10 dakika için inkübe edilir. </li><li> Tüpler bir doygun 4, 5, 7 ila Tablo 1 &#39;de antikor miktarı (ler), ve 8 ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında ve ışıktan koruyarak için tüm örnekler (Tüpler 1-8) inkübe edilir. </li><li> Tüm örnekler HBSS +1% BSA 1.5 ml ekleyin, pelet santrifüj (5 dak 400 xg) ve dikkatli aspirasyon ile HBSS +1% BSA 1.5 ml ile bir kez yıkayın tarafından hücrelerin hücre kaybını önlemek için. </li><li> HBSS +1% BSA 500 ul her örnek süspanse edin. Sizin sitometresinde analiz edilecek numuneler için gereken, bir 12 x 75 mm yuvarlak dipli tüp transfer. Tablo 1 &#39;de olduğu gibi Tüpler 3, 6, 7 ve 8-100 mg / ml 7-AAD çalışma stok günlük (Reaktiflerin tabloya bakınız) 10 ul ekle. Akış sitometresi kurulum ve boyama doğrulama (3. Basamak) içinde kullanılmadan önce 30 dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin. </li></ol> 3. Akış Sitometresi Kurulum ve Boyama Doğrulama <ol><li> Doğrulayın akış cytometer günlük kalite kontrolü için laboratuvar kurdu prosedürlerini kullanarak, düzgün çalışıyor demektir. Bu sinyaller doğrulama kolayca kullanılmak üzere her spektral pencerede tespit edilir ve detektör çoğalma tepkileri izleme 14 için kullanılacak pencere içinde yoğunluk sinyali doğrusal orantılı olduğu varsayılır. Edilebilir </li><li> Lineer ekran ölçekler kullanılarak FSC vs Tüp 1 için SSC verileri edinin. Lenfosit popülasyonu nokta arsa sol alt kadranda düştüğü her dedektörün amplifikasyonu gibi ayarlayın, her iki parametreyi de off-ölçekli değildir ve eşikleme nedeniyle kesintiye uğramaz. 3.7 - Adımlar 3.3 Tüm örnekler için ungated FSC vs SSC verileri toplayın. </li><li> Tüm 4 floresan dedektörler için renk yok tazminat ve logaritmik ekran ölçekler kullanarak, Tüp 1 için veri edinin. / Hayır hücreleri ilk kanal birkaç biriken ölçekte boyanmamış lenfositlerin otofloresans yerleştirmek için her dedektörün yüksek gerilim (HV) ayarlayın. Her histogram analizi sınır ayarlamaboyanmamış hücrelerinin parlak% 2 karşılık gelmektedir. </li><li> Adımları 3.2 ve 3.3 &#39;te kurulan hiçbir renk tazminat ve HV ayarları kullanarak, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüp 2 için veri elde. PKH26 floresans izlemek için kullanılan dedektör için son kanal birkaç / hiçbir hücre ile, tüm PKH26 pos hücreleri 3. -4 dekadlarıdır tek bir simetrik pik olarak ölçekte göründüğünü doğrulayın. Orada birden zirveleri ya da tepe şekli çarpık ise, minimizasyonu ve karıştırma tekniği (Şekil 2) tuzlu özenle Adım 1&#39;i tekrarlayın. Eğer gerekirse, boya konsantrasyonu ayarlanır. </li><li> Adım 3.3 &#39;de kurulan ayarları kullanarak, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüp 3 için veri elde. 7-AAD floresans izlemek için kullanılan dedektör için, 7-AAD pos hücreleri (cansız hücreleri iyi çözümlenir yani, Adım 3.3 yılında% 2 sınır üzerinde düşüş olduğunu doğrulayınuygulanabilir 7-AAD neg hücreleri). </li><li> Adım 3.3 &#39;de kurulan ayarları kullanarak, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüp 4 için veri elde. CD8 pos hücreleri de boyanmamış hücreleri (yani, FITC dedektör için Adım 3.3 kurulan% 2 sınır üzerinde düşüş) çözümlenir doğrulayın. Tüp 5 ile tekrarlayın ve CD8 pos hücreleri de boyanmamış hücreleri (yani sonbahar APC dedektör için Adım 3.3 kurulan% 2 sınır yukarıda) çözümlenir doğrulayın. </li><li> Adım 3.3 &#39;de kurulan kullanarak ayarları, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüpler 6, 7 ve 8 için veri elde. </li><li> Tüpler 1-5 ve diğer üç florokromlar izlemek için kullanılan dedektörler her florokrom için matris örtüşmeyen bir renk oluşturmak için renk kompanzasyon yazılımı için toplanan liste modunda dosyaları kullanın. Örnek 6 için liste modu dosyası için bu matrisi uygulayın ve doğrulayın PKH26 laboratuvar varlığıeling 7-AAD kut hücreleri algılamak için yeteneğini etkilemez. </li><li> A) 3 düzeldi altgrupları (CD3 neg neg CD4, CD3 pos CD4 neg ve CD3 pos CD4 pos) bir FITC vs ile tespit edilebilir: Renk Örnek 7 için liste modu dosyası için adım 3,8 matris örtüşen ve doğrulamak Uygula APC nokta arsa, ve anti-CD3-FITC ve anti-CD4-APC b) varlığında 7-AAD kutuplu hücreler tespit etme yeteneğine değiştirmez. , Anti-CD3-FITC varlığında PKH26 detektör toplanan veriler için üst sınır% 2 değiştirilmesi durumunda, gerekli olan sınır yeniden ayarlanması. </li><li> Adım 3,8 Örnek 8 için liste modu dosyası için renk örtüşme matris uygulayın. PKH26 etiketleme varlığında Adım 3.3 otofloresans kontrolü kullanarak bu kümesinden FITC, 7-AAD veya APC dedektörler için% 2 sınır değiştirir ise, Tablo 1 Tüp 7 kullanılarak gerektiğinde sınır (lar) yeniden ayarlayın ve doğrulayın o yine disting mümkündüruish CD3 pos CD4 pos, pos CD3 CD4 neg ve CD3 neg neg CD4 hücreleri ayarlanmış sınır (lar) kullanarak. </li></ol> 4. Boya Seyreltme tarafından Hücre Bölünmesi İzleme Proliferasyon Model Seçimi <ol><li> Sizin Sitometre üzerinde kanallar ve logaritmik yıllardır sayısına bağlıdır nesiller arasındaki aralığı belirleyin. Dijital aletleri için bu değer, tipik olarak 4 veya 5 on, dijital sinyal işlemcisi içinde kutuların sayısına göre belirlenir. Analog aletler üzerinde, yıllardır sayısı nadiren bütün bir sayıdır, doğru bir modelleme deneysel olarak tespit edilmesi onlarca yıl kesin sayısı gerektirir. Bunu yapmak için, üretici tarafından atanan göreceli yoğunlukları ile kalibre floresan boncuk karışımı veri deneyde kullanılan aynı detektör yüksek voltaj ayarlarında elde edilir. Boncuk tepe noktalarının konumu int açısından logaritmik ölçekli kalibrasyon sağlarGeçmiş on yılda densite aralığı. Özellikle, bu üretici tarafından değeri log karşı her bir boncuk tip için kanal numarasını çizilmesi ile yapılır. Boncuk veri değerleri için en uygun doğrunun eğimi kanal başına bağıl yoğunluk birimlerinin sayısını verir. Kanal sayısı ile çarpılır, bu değer daha sonra yoğunluğu iki kat azalma (yani, kızı nesil aralık) karşılık gelen kanal sayısı 14 hesaplanabilir hangi tam ölçek için günlük on sayısı olacaktır. </li><li> Nesiller arasında sabit bir aralık kullanmak veya aralık dalgalanmaya bırakmaya karar verin. A Standart (sabit) ayarı, her kuşağın yerini atamak Adım 4.5 belirlenen kuşak boşluk değerini kullanacak ve histogram farklı zirveleri yoksun olduğunda genellikle kullanılır. A Float ayar her kuşak peak pozisyonuna histogramın şekli ile tespit edilebilir ve ne zaman distinguishabl genellikle kullanılırE kuşak zirveleri belirgindir. </li><li> Tüm kuşaklar veya kayan genişliği için sabit bir tepe genişliği kullanacağınıza karar verin. Sabit bir genişlik tüm nesillere modellemek için uyarılmamış kontrol örneği için SD hesaplanan kullanır ve örnek ayırt nesiller zirveleri yoksun olduğunda genellikle seçilir. Bir yüzer genişlik programı bağımsız olarak her kuşak için SD değişmesini sağlar ve en iyi şekilde ayırt edilebilir kuşak zirveleri ile birlikte kullanılır. </li><li> Proliferasyonu analiz modülü (burada ModFit LT Sürüm 3.3) içeren bir program çalıştırın. (Örneğin, Tablo 1&#39;de Tüp 8 olarak zıt PKH26 pos hücreleri uyarılır 96 saat kültür) analiz edilecek veri kümesinin gelen uyarılmış PKH26 pos dosya yükleyin. </li><li> Bu durumda uygulanabilir kapılanan PKH26 (585/42) (7-AAD neg) CD3 pos lenfositler ve küçük moloz ve büyük agrega (Şekil 3) dışlamak için FSC vs SSC içinde, analiz için parametreleri seçin. TanımlarkenBu bölgelerde patlamalar genellikle bulunan yüksek forward scatter alanı vardır ve CD3 ekspresyonu uyarılır kültürlerde aşağı modüle olabilir dikkat etmek dikkatli olun. </li><li> Silahların Sihirbazı&#39;nı kullanarak yeni bir proliferasyon modeli oluşturun. Açık Veri Dosyası (Başlangıç ​​sekmesi) kullanarak, uyarılmamış PKH26 pos kontrol dosyası yüklemek ve bölünmemiş hücrelere karşılık gelen ebeveyn dağılımındaki pik kanalın konumunu tanımlamak. </li><li> Ebeveyn pik konumu ve genişliği (standart sapma) değerleri belirterek, uyarılmamış PKH26 pos kontrol dosyası analiz. Sabit bir zirve genişliği (SD) istenirse, Kilit SD kontrol edin. </li><li> PKH26 negatif kontrol (örn., PKH26 negatif hücreleri 96 saat kültür Tablo 1 &#39;de Tüp 7 zıt olarak) yerleştirin. PKH26 neg denetimi yukarıda dimmest nesil için pik kanalı ayarlayarak nesiller sayısını ayarlayın. Bu nu belirlermodeli doğru sığabilecek kızı nesillerin mber ve genellikle 6-9 nesiller. </li><li> Uyarılan numune için veri dosyasını (örneğin, Tablo 1 &#39;de Tüp 8 olarak zıt PKH26 kutuplu bir hücre stimüle 96 saat kültürü) açık olup Aşama 4.7&#39; de tanımlandığı gibi ebeveyn tepe pozisyon ve şizoaffektif bölgeleri değişmeden kalır teyit etmektedir. Sabit kuşak aralığı isteniyorsa, Standart model seçeneği seçin; aksi Yüzer seçeneğini seçin. </li><li> Adım 4.9 &#39;de tanımlanan aynı modeli kullanarak, veri kümesindeki her bir deney dosyasını analiz edin. Hem görsel hem de azaltılmış ki kare (RCS) değere göre tanımlanan ebeveyn tepe konumuna ufak ayarlamalar çok iyi oturması için gerekli olabilir. </li><li> Veri kümesinde her bir deneysel dosya için en iyi uygun sonucu arzu edilen çoğalma ölçümleri kaydedin. Mümkün ölçümleri kapsamlı bir açıklaması için bkz: Ref. 22. </li></ol>

<ol><li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+RY+%22Living+Color%3A+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+Protocols%22">Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols</a>. Diamond, R. A., DeMaggio, S. , Springer-Verlag. New York, NY. 302-352 (2000).</li>
<li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+2007%3A+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking%2C+Persistence%2C+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8%2B+T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li>
<li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li>
<li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li>
<li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li>
<li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li>
<li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li>
<li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li>
<li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+%28GM-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li>
<li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellVue+Claret%2C+a+New+Far-Red+Dye%2C+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells%3A+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li>
<li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li>
<li>Wallace, P. K., Tario, J. D. Jr, Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., ,, Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry%3A+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li>
<li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients%3A+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
<li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8%2B+T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+cellular+proliferation+data%3A+Avoid+the+panglossian%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259(2010).</li>
<li>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. , Sigma-Aldrich. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf">http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf</a> (2012).</li>
<li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory%5BTitle%5D)+AND+%22T+Cells.+Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li>
</ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr ve PK Wallace Life Technologies, Inc ve BD Biosciences değerlendirmeye için ticaret öncesi hücre izleme reaktifleri aldık. AD Bantly ve JS Moore değerlendirilmesi için reaktifler izleme ticaret öncesi hücre almış boyalar izleme çeşitli CellVue hücre ticaret öncesi karakterizasyonu için PTI Research, Inc Life Technologies, Inc ve finansman. K. Muirhead (Phanos Technologies, Inc danışmanlık hizmetleri sağlar (PKH ve CellVue boyalarının sahibi) ve Sigma-Aldrich ve Moleküler Hedefleme Technologies, Inc için yedekleme teknik destek sağlar SciGro, Inc tarafından istihdam ediliyor bu distribütörleri boyalar). Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Sigma-Aldrich tarafından desteklenmektedir.

Burada açıklanan yöntemler, en güvenilir membran boyalar 13,16,18 kullanarak hPBMC etiketleme ve membran veya protein boyalar 2,11,13,16 kullanarak lenfosit fenotiplen yayılması izleme için optimum sonuçlar vermek bizim kombine laboratuvarlarda bulunan olanlardır 18. Şekiller 1 ve 2 &#39;de gösterildiği gibi, parlak tekdüze etiketleme en kolay fizyolojik tuzları varlığında sınırlayan ve bir karıştırma tekniği kullanılarak elde edilir boya ile aynı konsantrasyon tüm hücrelerin hızlı ve homojen bir poz sonuçları. Membran boyalarla boyanması iki tabakalı lipid bölünme ile oluşur çünkü, ücretsiz boya konsantrasyonu değiştirebilecek diğer değişkenleri de etiketleme verimliliğini etkileyebilir. Örneğin, önceki Dilüent C resüspansiyon için tuz az verimli yıkama yuvarlak alt polistiren tüplerin sonuçlarında etiketlenmesi ve de özellikle, tüp duvarları üzerine adsorpsiyon boya nedeniyle azalan ücretsiz boya konsantrasyonudüşük boya konsantrasyonlarda. Her iki faktör konik alt polipropilen tüplere (Şekiller 3, 4 ve etiketleme kullanılarak yapıldığı zaman daha geniş kapsamlı leke dağılımları vermek eğilimindedir yayınlanmamış sonuçlar). Optimize boyama işlemleri kullanıldığında bile örnek yaşını ve türünü de pik genişliği etkileyebilir. Örneğin, 24 saat eski kan örnekleri veya TRIMA pheresis filtreleri aralığı izole lenfositler için CV ise% 14-20 den taze alınmış bir kan aralığı (Şekil 3, No. 13 ve yayınlanmamış sonuçlar) izole PKH26 Poz lenfositler için CV 25-30 % (Şekil 4 ve Ref. 18). Homojenlik ve cansız hücreler analiz dışında her ikisi de ayırt edilebilir kız zirveleri sırayla gözlenen verilerin (Şekil 5 ve 6 için uygun bir model çoğalma tercih etkiler boya seyreltme profil, belirgin ölçüde etkilememektedir edilebilir ölçüde Boyama </strong&gt;). ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) gibi çoğalması Endeksi ve Öncü Frekans (Şekil 3, 5 ve 6; Çizelge 3) gibi metrikler oluşturmak için kullanılan yazılım burada örnek olarak kullanılmasına rağmen, diğer yazılım paketleri de modül analiz içerir proliferasyon veri. Bunlar FCSExpress (De Novo Yazılım, Los Angeles, CA) ve FlowJo (Ağaç Yıldız, Inc, Ashland, OR). Tüm bu programlar iteratif konumu, yükseklik ve sıralı kızı nesiller temsil Gauss doruklarına SD (veya genişlik) değiştirerek ham veri için en uygun bulmak için bir non-lineer en küçük kareler analizi kullanın. Proliferatif İndeksi (PI) ve Prekürsör Frekans (PF) çoğalması ölçüde en sık kullanılan önlemlerdir. Tarafından tanımlandığı gibi ModFit PI, bir timidin alımının testinin &#39;uyarım endeksi &quot;benzer tahlil boyunca hücre sayısındaki artış, bir ölçüsüdür. PF ilk populat hücre fraksiyonu döndürürçoğalan uyarana cevap iyon. Terminoloji yazılım paketleri (örn., FlowJo ve ModFit &quot;Silahların Endeksi&quot; ne kastedildiği için farklı tanımları ve hesaplamaları kullanabilirsiniz) 22 arasında biraz değişir yana edebiyat okurken Dikkat, ancak tavsiye edilir. Protein boya kullanırken membran boyalarla etiketleme ve proliferasyon analizi için burada tartışılan önemli konular da rastlanmaktadır. Örneğin, karıştırma tekniği dikkat da CFSE (Şekil 6) 2-4,13,18,24 kullanıldığında düzgün dağılımlar ve ayırt edilebilir kız zirveleri elde etmek üzere, ölü / ölen hücrelerin dışlanması ile birlikte, dikkat edilmelidir. Fenotiplen canlılığı değerlendirmesi için florokromlar uygun seçimi özellikle KAKE 2-4,11,13,16,18 gibi görünür yayan protein boyalarla, aşırı spektral örtüşme ve antikor pozitif hücrelerin fark edememe önlemek için de önemlidir </sup&gt;. Izleme boya konsantrasyonu azaltılması bitişik spektral kanal tazminat sorunlar azalır ama yavru hücre yoğunlukları otofloresans örtüşmek başlamadan önce de izlenebilir hücre bölünmeleri sayısını sınırlar. Alternatif olarak, uzak kızıl yayan CellVue Bordo (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) veya menekşe yayan CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) gibi yeni hücre izleme boyaların dengeleme sorun (Şekil 6) azaltabilir kullanır. Membran boyalar genel olarak daha az toksisite 11,26 distorsiyonu üretmeğe temayül gösterir, ancak sonunda, bu boya ya da sınıf ile aşırı-etiketli hücre mümkündür. Bu, kullanılan izleme boya konsantrasyonu izlenir için hücrelerin işlevlerini (Şekil 6) 3,13,16,18 değiştirilmiş olmadığını doğrulamak için her zaman bu nedenle gereklidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya ekipman </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ticari olarak satın </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14175-079 </td><td> Fenol kırmızısı olmadan Kalsiyum ve magnezyum serbest, </td></tr><tr><td> İnsan IgG Cohn fraksiyon II ve III globulinler </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td laboratuvar titrasyon ile belirlenen&gt; doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 mg / ml; azid ücretsiz </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 mg / ml; azid ücretsiz </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH 10-3M PKH26 ve Dilüent C içeren PKH26 kırmızı floresan hücre bağlayıcı kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT veya MINI26-1KT </td><td> Adım 1 usuller de geçerlidirPKH67 içeren kitleri veya diğer CellVue boyalar </td></tr><tr><td> EtOH ve Dilüent C 10-3M CellVue Claret içeren CellVue Claret kadar kırmızı floresan hücre bağlayıcı kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT veya MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (and-6)-carboxyfluorescein diasetat, süksinimidil ester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Sigara floresan; oluşturmak için membran esterazlarla yarılan floresan amino-reaktif carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) </td></tr><tr><td> DEAD / CANLI tamir edilebilir Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Steril 12 konik x 75 mm polipropilen tüpler ve kapakları </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Iyi membran boya boyama etkinliği (; süpernatant aspirasyon sırasında daha az hücre kaybı azalır boya adsorpsiyon) verir </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round alt Polistiren tüpler </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> Bioscience BD </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Ve APC ex; FITC, PKH26, ve 7-AAD (. Em sırasıyla 520 nm, 567 nm ve 655 nm, örneğin 488 nm) tespit edebiliyoruz herhangi sitometresinin. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII Cyan </td><td> Ve APC ex; FITC, PKH26, ve 7-AAD (. Em sırasıyla 520 nm, 567 nm ve 655 nm, örneğin 488 nm) tespit edebiliyoruz herhangi sitometresinin. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratuvar Hazırlayan </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, konsantre stok </td><td> NA </td><td> NA </td><td> PBS içinde 1 mg / ml idi. -20 ° C&#39;de alikotları ve mağaza içinde dondurun </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, kelkral stok </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 mikrogram / PBS ml 1 mg / ml dondurulmuş stok günlük hazırlamak. </td></tr><tr><td> IgG bloğu </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml insan IgG Cohn fraksiyonu II ve III globülinler + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

cep takip boyalar kullanarak hücre bölünmesi İzleme için optimize boyama ve Çoğalma modelleme yöntemleri

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Floresan hücre izleme boyalar, akım ve görüntü sitometrisi ile birlikte, in vitro ve in vivo olarak farklı hücre tipleri etkileşimleri ve kaderi çalışma hangi güçlü araçlardır. 1-5 tür boyalar kullanılarak yayınları binlerce, bazı anlamıyla olsa En sık görülen hücre izleme uygulamaları izleme şunlardır: <ol><li> kök ve progenitör hücre sükunet, proliferasyon ve / veya farklılaşma 6-8 </li><li> antijen tahrik zar transferi 9 ve / ya da öncü hücre proliferasyonunu ve 3,4,10-18 </li><li> immün düzenleyici ve efektör hücre fonksiyonu 1,18-21. </li></ol> Piyasada bulunan hücre izleme boyalar onların kimyaları ve floresans özellikleri yaygın değişebilir ama hücre etiketleme mekanizmasına dayalı iki sınıfa birine büyük çoğunluğu sonbaharda. &quot;Membran boyalar&quot;, yüksek lipofilik boyalar t vardır, PKH26 tiplemesindekihücre zarları 1,2,11 içine stabil ancak non-kovalent şapka bölümü. &quot;Protein boyalar&quot;, KAKE ile özdeşleşen, hücre proteinleri 4,16,18 stabil kovalent bağlar oluştururlar amino-reaktif boyalar vardır. Her sınıf kendi avantajları ve sınırlamaları vardır. Onların başarılı kullanımı için anahtar, özellikle birden çok boyalar farklı hücre tipleri izlemek için kullanılan renkli çalışmalarda, her sınıf 2-4,16,18,24 optimum kullanımını sağlamak kritik sorunları anlamak taşımaktadır. Protokoller hücre izleme boyalar kullanıldığında zayıf veya değişken sonuçlar üç yaygın nedenleri vurgulamak buraya dahil. Bunlar şunlardır: <ol><li> Parlak, homojen, tekrarlanabilir etiketleme ulaşmak için başarısızlık. Bu, herhangi bir hücre izleme çalışması için gerekli bir başlangıç ​​noktasıdır, ama protein boyalar veya antikorlar gibi denge bağlama reaktifleri kullanırken daha membran boyalar kullanarak farklı değişkenler için dikkat gerektirir. </li><li> Suboptimal florokrom kombinasyonlarnd / veya başarısızlık kritik tazminat denetimleri eklemek için. Boya floresan izleme genelde 10 2 - antikor floresans 10&#39;dan 3 kat daha parlak. Bu, izleme boya varlığında kullanılan diğer problar tespit etmek için imkan verecek olduğunu doğrulamak için elzemdir. </li><li> Pik modelleme yazılımı ile iyi bir uyum elde etmek için başarısız. Böyle bir yazılım habercisi frekans veya başka metriklere dayalı farklı popülasyonlar veya uyaranlara boyunca proliferatif cevap kantitatif karşılaştırılması sağlar. Iyi bir uyum elde edilmesi, ancak bir boya dilüsyon profilleri bozabilir hücreleri ölüyor ve gözlenen boya seyreltme profili özellikleri ile modelin altında yatan varsayımların eşleşen / ölü. Çıkarılmasını gerektirir </li></ol> Burada verilen örnekler hücre çoğalması izlemek membran ve / veya protein boyalar kullanılırken bu değişkenlerin sonuçları nasıl etkilediğini göstermektedir.

Immün hücre fonksiyonu ve proliferasyonu izlemek için hücre izleme boyalar başarıyla kullanımı pek çok kritik adımlar içerir. Biz yöntemleri açıklanmaktadır: 1) membran boyalarla parlak, homojen, tekrarlanabilir etiket-ing almak; 2) florokromlar ve veri toplama şartlarının belirlenmesi ve 3) boya seyreltme esas hücre çoğalması ölçmek için bir model seçerek.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Akış ve görüntü sitometrisi ile kombine edilen floresan hücre takip boyaları, ...'nın etkileşimlerini ve kaderlerini incelemek için kullanılan güçlü araçlardır.

Bu yöntemin genel amacı, hücre takip boyaları kullanarak karmaşık popülasyonlar içindeki farklı immün hücre alt kümeleri için hücre bölünmesinin derecesini doğrudan nicelendirmektir. Bu, öncelikle ebeveyn hücre popülasyonunun, hücresel proteinlere stabil bağlanma sağladığı veya hücre membranlarına kovalent olmayan şekilde interkale olduğu bilinen floresan bir boya ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir; böylece stimülasyona yanıt veren boyanmış hücreler takip edilir. Floresan antikorlarla boyama ve çok parametreli akış sitometrisi kullanılarak yapılan analiz, stimüle edilen ilgili immün hücre tipleri arasındaki farklı yanıtların tespit edilmesini sağlar; ancak takip boyası ile boyanmamış kontroller, otofloresanstan ayırt edilebilecek en düşük yavru hücre floresans yoğunluğunu belirlemek için kullanılır. Daha sonra, takip boyasıyla etiketlenmiş ancak stimüle edilmemiş kontroller, bölünmemiş hücrelerin tespit edileceği floresans yoğunluğunu belirlemek için kullanılır. Stimülasyon tipik olarak geniş bir yoğunluk aralığı ile sonuçlanır; çünkü yanıt olarak çoğalan hücreler kademeli olarak daha sönük hale gelirken, yanıt vermeyenler gelmez.Nihayetinde, farklı nesillerdeki hücrelerin göreceli sıklığını tahmin etmek için pik modelleme yazılımının kullanımı, proliferasyon indeksi veya öncül hücre sıklığı gibi metrikler kullanılarak farklı popülasyonlar veya uyaranlar arasındaki proliferatif yanıtların kantitatif karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu tekniğin trityumla işaretleme, timidin inklüzyonu veya KI 67 ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, DI dilüsyonunun, immünofenotiplendirme ve sitokin üretimi gibi diğer akış sitometrik ölçümlerle birleştirilebilen doğrudan bir hücre bölünmesi ölçümü sağlamasıdır. Hücreler tarafından boya alımı son derece hızlı olduğundan, membran boyama yönteminin görsel gösterimi faydalıdır.Sonuç olarak, parlak ve homojen bir boyama elde etmenin anahtarı doğru tekniktir. İnsan periferik kan mononükleer hücreleri izole edildikten sonra, trombosit kontaminasyonunu minimize etmek için oda sıcaklığında 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından peleti %1 BSA içeren HBSS içerisinde 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspande edin ve buz üzerine yerleştirin.500 µL'lik bir alikotu ayırın ve saklayın, ardından başka bir 500 µL'lik hücre alikotunu 12 x 75 mm'lik konik polipropilen bir tüpe aktarın. 3,5 mL HBSS ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; yıkama sırasında PKH 26 GL kitinden 0,5 mL Diluent C etiketleme aracını başka bir 12 x 75 mm'lik konik polipropilen tüpe ekleyin, hücreleri uzaklaştırmamaya dikkat ederek ve 15 ila 25 µL'den fazla artık sıvı bırakmayacak şekilde süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından, hücre peletine 0,5 mL Diluent C etiketleme aracı ekleyin ve tek hücre süspansiyonu elde etmek için çözeltiyi birkaç kez aspire edip dağıtın.Şimdi, dilüent C içeren tüpe iki mikrolitre PKH 26 ekleyerek iki kat XD stok çözeltisini hazırlayın. Hemen ardından, hücre süspansiyonunu taze hazırlanmış iki kat PKH 26 boya çözeltisine pipetleyin ve hücrelerin boya boyunca homojen bir şekilde dağılması için karışımı aynı anda birkaç kez aspire edip boşaltın. Bir dakika sonra, boyanın hücre membranlarına alınmasını durdurmak için bir mililitre ısı ile inaktive edilmiş serum ekleyin. Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, peleti yerinden oynatmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin.Ardından peleti, %10 ısı ile inaktive edilmiş serum içeren dört mililitre tam besiyerinde dağıtın ve hücre süspansiyonunu yeni bir polipropilen tüpe aktarın. Hücreleri iki kez HBSS artı %1 BSA ile yıkayın; yeterince boyanmış hücreler pelette belirgin bir pembe renk gösterecektir. Hücre peletini bir mililitre HBSS artı %1 BSA içinde yeniden süspanse ettikten sonra hücreleri sayın ve ardından nihai konsantrasyon mililitrede 10⁷ hücre olacak şekilde hacmi ayarlayın. Tabloda belirtilen akış sitometrisi protokolüne göre hücreleri boyadıktan sonra, ileri saçılma (forward scatter) ve yan saçılma (side scatter) parametrelerini ve dört floresan dedektördeki sinyalleri ayarlamak için ilk beş tüpü kullanın.Özellikle ikinci tüpteki PKH 26 floresansını izlemek için kullanılan detektör için; tüm PKH 26 boyalı hücrelerin, son kanalda çok az veya hiç hücre bulunmaksızın, üçüncü ila dördüncü onlukta tek bir simetrik pik olarak ölçekte göründüğünü doğrulayın. Ardından, diğer üç florokromu izlemek için kullanılan detektörlerdeki her bir fluro için bir renk örtüşme matrisi oluşturmak amacıyla, renk kompanzasyon yazılımını ve birinci ila beşinci tüpler için toplanan liste modu dosyalarını kullanın.Ardından bu matrisi altıncı örneğin liste modu dosyasına uygulayın. PKH 26 etiketlemesinin varlığının, seven A a D pozitif hücreleri tespit etme yeteneğini değiştirmediğini doğrulamak için şimdi yeni oluşturulan bu renk çakışma matrisini yedinci tüpün liste modu dosyasına uygulayın.Bir FE'ye karşı PC grafiği üzerinde CD3 pozitif CD4 negatif ve CD3 pozitif CD4 pozitif popülasyonları tanımlayın. Anti-CD3, FE ve anti-CD4 A PC varlığının, seven A a D pozitif hücreleri tespit etme yeteneğini değiştirmediğini doğrulayın. Son olarak, tüp 7 için renk örtüşme matrisini tüp 8'in liste modu dosyasına uygulayın.Şimdi, proliferasyon analiz modülü içeren bir programı açın. Analiz edilecek veri setinden stimüle edilmiş PKH 26 boyalı dosyayı yükleyin. Ardından, bu durum için analiz parametrelerini seçin; canlı, seven a a d negatif, cd3 pozitif lenfositler üzerinde kapı yapılmış PKH 26 ve küçük döküntüler ile büyük agregatların dışlanması için ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılım (side scatter) parametrelerini belirleyin.Bu bölgeleri tanımlarken, blastların genellikle bulunduğu yüksek ileri saçılım (forward scatter) alanını dahil etmeye dikkat edin. Ardından, proliferasyon sihirbazını açın. Veri dosyasını açmak için başlangıç sekmesine tıklayın ve ardından uyarılmamış PKH 26 pozitif kontrolünü yükleyin.Bölünmemiş hücrelere karşılık gelen ebeveyn pikin konumunu belirleyin. Ebeveyn pikin konum ve genişlik değerlerini not ederek dosyayı analiz edin. Sabit bir pik genişliği isteniyorsa, lock SD seçeneğini işaretleyin, PKH 26 negatif kontrolünü yükleyin ve dimus yavru nesli için pik kanalını PKH 26 negatif hücrelerin üzerine ayarlayarak nesil sayısını düzenleyin.Bu işlem, kız kuşak sayısını belirler. Model tamamlandığında doğru şekilde uydurulabilir. Uyarılmış PKH 26 pozitif dosyayı yeniden yükleyin.Eğer ayırt edilebilir nesil pikleri belirginse, model seçeneği altındaki yüzer (floating) ayarı seçin. Eğer log onlukları tam olarak 4.0 değilse, makalede tartışıldığı şekilde nesil aralığını ayarlayın. Şimdi, stimüle edilmiş örneği analiz edin ve ebeveyn pik pozisyonu bölgesinin değişmeden kaldığını doğrulayın.Son olarak, uygulanacak veri setindeki her bir deneysel dosya için "analyze" (analiz et) seçeneğini belirleyin. Yeni oluşturulan model ile veri setindeki her bir deneysel dosya için en iyi uyum sonucunda elde edilen istenen proliferasyon metriklerini kaydedin. Bu ilk veri serisi, karıştırma tekniğinin PKH 26 floresan dağılımları üzerindeki etkisini göstermektedir.Kültüre edilen U 9 37 myeloid hücreleri, az önce açıklanan yöntem kullanılarak hücre takip boyası ile boyanmıştır; bu ilk histogram boyanmamış kontrol verilerini göstermektedir. Sitometre ayarları, bu hücrelerden gelen otoflüoresansın ilk dekatta yer alacak ve ilk kanalda hiç veya çok az hücre birikecek şekilde ayarlanmıştır. Bu ikinci histogram ise başarılı PKH 26 boyamasını örneklendirmektedir.İki x hücrenin iki x boyasıyla hızla karıştırılması; parlak, homojen ve simetrik bir floresans dağılımı vermiş, ancak önceki histogram için kullanılan cihaz ayarlarında ölçek dışı kalan hücrelere rastlanmamıştır. İki x hücre, hemen karıştırılmadan iki x boyasına eklendiğinde daha heterojen bir floresans dağılımı elde edilmiştir. Sönük olarak işaretlenmiş bu küçük alt popülasyon, bu deneyin final histogramında daha sonraki bir zaman noktasında mevcut olsalardı, hatalı bir şekilde yavru hücreler olarak yorumlanabilirdi; ayrıca, 3 µL konsantre etanol boya stoğunun yanlışlıkla 0.5 mL iki x hücre süspansiyonuna doğrudan eklenmesi durumunda da yetersiz karışım meydana gelmiş ve bu durum oldukça sönük ve sağa çarpık bir floresans yoğunluk dağılımı ile sonuçlanmıştır.Burada, PKH 20 ile boyanmış insan periferik kan mononükleer hücrelerinin stimülan anti-CD3 ve IL-2 reaktifleri ile veya bunlar olmadan kültüre edildiği bir proliferasyon deneyinden elde edilen tipik sonuçlar gösterilmektedir. 96 saatlik kültürden sonra hücreler hasat edilmiş ve anti-CD3 PE, anti-CD19 APC ve seven-AAD ile karşıt boyama yapılmıştır.İki farklı kapılama stratejisi karşılaştırılmıştır; ilk kapılama stratejisinde, CD3'e karşı 7-AAD nokta grafiği kullanılmıştır. Canlı 7-AAD negatif CD3 pozitif T hücrelerini seçmek için 7-AAD kullanılmıştır. Daha sonra, blast lenfositleri dahil ederken büyük agregatlar dışarıda bırakmak için bir ileri ve yan saçılım bölgesi kullanılmıştır.Boyanmamış kontrol için R1 + R2 kapılı olaylar gri histogramla, PKH26 ile boyanmış ancak uyarılmamış hücreler ise mavi ile gösterilmiştir; uyarılmamış kontroldeki canlı ancak bölünmemiş T hücreleri için parlak, simetrik ve homojen boyamaya dikkat ediniz. Bu veriler önceki şekilde olduğu gibi kapılanmıştır, ancak bu durumda hücreler anti-CD3 ve IL2 ile uyarılmıştır. R1 + R2 kapılı olaylar için PKH26 histogramı, artık ağırlıklı olarak her bir yavru nesil için renkli piklerle temsil edilen, şiddeti azalmış bölünmüş hücreleri içermektedir.Mavi ebeveyn pikinde hala bazı parlak bölünmemiş hücreler kalmış olsa da, yüksek düzeyde bölünmüş hücrelerin yoğunluğunun henüz boyanmamış hücrelerin ölçüldüğü bölgeyle örtüşmediğine dikkat edin; bu durum, buradaki en düşük yoğunluktaki yavru nesillerdeki hücre sayısına dayalı metriklerin tahminini karıştırabilirdi. Aynı veriler, önceki iki figür setiyle aynı şekilde analiz edilmiştir, ancak canlı T hücrelerini seçmek için yalnızca ışık saçılımı ve CD3 kullanılmıştır.Bu kapılama stratejisi, CD3 ile 7-AAD nokta grafiklerinde kalan küçük bir kalıntı popülasyon olan yedi A a D pozitif ölü hücrelerle gösterildiği üzere, ölü hücrelerin çoğunu ancak tamamını değil dışlar. Hücre takip boyaları kullanıldığında, bölünmemiş hücrelerin boyanma yoğunluğu aşırı parlak olduğu için immünofenotipleme için seçilen florokromlar zorlayıcı kompanzasyon sorunları yaratabilir. Bu deneyde, 24 saatlik periferik kan mononükleer hücreleri PKH 26 ile işaretlenmiş ve ardından CD3 ve CD4 antikorları ile bir canlılık boyasıyla karşı boyanmıştır.Bu veri serisinde, 2 µM PKH 26 ile işaretlenmiş hücreler, anti-CD3 FITC ve anti-CD4 APC ile karşıt boyama işlemine tabi tutulmuş ve ardından daha önce kullanılan R1+R2 kapılama stratejisinin aynısı kullanılarak analiz edilmiştir; PKH 26'nın APC kanalına sızıntısı (overlap) çok az olduğu için, kompanzasyon uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın CD4 pozitif ve negatif olaylar net bir şekilde ayırt edilmiştir. Bu veriler, nihai PKH 26 konsantrasyonu 4 µM'ye çıkarıldığında bile canlı CD3 pozitif CD4 pozitif T hücrelerinin nasıl iyi bir şekilde ayırt edilebildiğini göstermektedir. Anti-CD4 PerCP'nin, anti-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 ve canlılık boyası Propidium Iodide (PI) ile birlikte kullanımı, PKH 26'nın PerCP kanalına belirgin sızıntısı nedeniyle çok daha düşük kaliteli sonuçlar vermiştir.Telafi edilmemiş verilerde CD four pozitif ve negatif hücreler birbirinden ayırt edilemedi ve telafi uygulandığında ise yalnızca sınırlı ölçüde ayırt edilebildiler. Nihai PKH 26 konsantrasyonunun dört mikromolar seviyesine çıkarılması, telafi uygulandıktan sonra bile CD four pozitif olayların CD four negatif olaylardan ayırt edilme yeteneğinin tamamen kaybolmasıyla sonuçlandı. CP başına anti CD four içeren veya içermeyen örneklerin esasen özdeş olduğuna dikkat edin.Ardışık kız nesil hücrelerinin sıklığını tahmin etmek için bir boya dilüsyon profili pik modelleme yazılımı kullanılarak analiz edildiğinde, ardışık kız piklerinin konumları ve/veya genişlikleri sabitlenebilir veya serbest bırakılabilir. Bu değerler, ebeveyn piki değerlerine göre belirlenir. Söz konusu değerler, uyarılmamış kontrolden tahmin edilir.Örneğin, bu PKH 26 yoğunluk profili orta derecede yanıt veren bir bireyden alınan uyarılmamış 96 saatlik bir kültürden alınmıştır ve mod fit proliferasyon sihirbazına, bölünmemiş ebeveyn hücreleri temsil eden pik için konum ve genişliğe dair ilk tahmini sağlamak amacıyla kullanılmıştır. Pik konumu için sabit bir ayarın kullanılması, her jenerasyonel pikin ortalamasının, önceki pikin floresans yoğunluğunun tam olarak yarısı olmasını gerektirir. Pik konumu için değişken (float) bir ayar seçeneği, en iyi uyumu elde etmek için ihtiyaç duyulduğunda jenerasyonel piklerin nihai konumlarının beklenen yoğunluklardan farklılaşmasına olanak tanır.Benzer şekilde, pik genişliği için sabit bir ayar, her bir nesil piki genişliğinin, ebeveyn veya uyarılmamış kontrol piki genişliği ile aynı olmasını gerektirir. Pik genişliği için değişken bir ayar ise, bu tabloda en iyi uyumu elde etmek için nihai genişliklerin gerektiği gibi bağımsız olarak değiştirilmesine olanak tanır. Ayırt edilebilir nesil piklerinin belirgin olduğu iki farklı donör için önceki şekillerin analiz sonuçları, bu donörler için gösterilmiştir.En iyi indirgenmiş ki-kare değerleri, hem pik konumunun hem de genişliğinin serbest bırakıldığı durumlarda elde edilmiştir; ayırt edilebilir generasyonel piklerin belirgin olmadığı proliferasyon profilleri için pik konumu için sabit bir ayar önerilir. Bu veriler, bir akış sitometrik immünsüpresyon analizinde farklı immün hücre tiplerinin proliferasyon geçmişlerini ayrı ayrı izlemek için iki takip boyasının kullanımını örneklemektedir. Yeşil renkle gösterilen T efektör hücreleri CFSE ile, mavi renkle gösterilen T regülatör hücreleri ise cell view ile işaretlenmiştir.Bordo etiketli hücre popülasyonları farklı oranlarda karıştırılmış ve anti CD 3, anti CD 28 ve ışınlanmış yardımcı hücrelerin varlığında 96 saat boyunca kültüre edilmiştir. Ardından, hücreler hasat edilmiş ve anti CD 4, PE 7-ADL ve live dead violet ile boyanmıştır. Burada, live dead violet pozitif hücreler kapılamadan sonraki 0,25:1 treg/T efektör oranı için temsilci veriler gösterilmektedir.Lenfositleri ve blastları kapsayan, ancak agregatları ve döküntüleri dışlayan bir ışık saçılım kapısı uygulandı, ardından CD four pozitif olayları kapsayan bir kapı eklendi. Cell view claret boyaması, canlı treg hücrelerinin, yüksek düzeyde prolifere olmuş ve bu nedenle CFSE DIM proliferasyon profilleri sergileyen canlı T efektör hücrelerinden kolayca ayırt edilmesini sağladı; böylece CFSE pozitif T efektör hücreleri ve cell view Claret pozitif treg hücreleri mod fit peak modelleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Yaklaşık 25,000 olay analiz edildi.Bunların %48'i canlı T efektörleri, %6'sı canlı T reg'ler idi; geri kalanı ise ölü hücreler, aksesuar hücreler ve debrisden oluşmaktaydı. Analiz süresi boyunca hücre sayısındaki kat artışı yansıtan hesaplanan proliferasyon indeksi, T efektörleri için 3,85 ve Treg'ler için 1,83 olarak bulundu. Burada, CFSE boya dilüsyon profilinden hesaplanan T efektör hücrelerinin proliferasyon indeksi üzerinde Treg hücre konsantrasyonunun etkisi gösterilmiştir.Treg hücreleri Cell View Claret ile işaretlense de işaretlenmese de sonuçlar aynı çıkmıştır, bu da boyamanın Treg fonksiyonunu değiştirmediğini göstermektedir. İzleme sonucunda beklendiği üzere, Treg hücrelerinin konsantrasyonu azaldıkça efektör T hücrelerinin proliferasyon düzeyi artmıştır. Farklı Treg/efektör T oranlarındaki Cell View Claret boya seyreltme profillerinden Treg hücresi proliferasyon indeksleri de hesaplanmıştır.Beklendiği üzere, T efektör hücre konsantrasyonu arttıkça, T efektör hücrelerinin yokluğunda Treg hücreleri minimal proliferasyon göstermiştir. Bununla birlikte, Treg hücre proliferasyonunun derecesi de artış göstermiştir. Videoyu izledikten sonra, hücre proliferasyonunu izlemek için hücre takip boyalarının nasıl başarıyla kullanılacağına, uygun florokromların ve renk kompanzasyon kontrollerinin nasıl seçileceğine ve boya dilüsyonuna dayanarak hücre bölünmesini nicelendirmek için uygun bir modelin nasıl seçileceğine dair kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu prosedürün yanı sıra, antijene özgü T hücrelerinin boyanması veya durgun ya da yavaş bölünen kök hücre benzeri hücrelerin geri kazanımı için akışla ayıklama gibi deneysel soruları yanıtlamak amacıyla diğer yöntemler de uygulanabilir. İzlediğiniz için çok teşekkürler.

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

, Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu protokol, meme kanseri hücre dizilerinde hücre proliferasyonunu analiz etmek için üç farklı yöntemin kullanımını açıklar. Bu, geleneksel hücre sayımı, lüminesans tabanlı hücre canlılığı ve bir hücre görüntüleyici kullanımı yoluyla hücre sayımının kullanımını içerir. Her biri, hücre proliferasyonunun tekrarlanabilir ölçümü için avantajlar sunar.

Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır ve yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir okumadır. Bu nedenle, proliferasyonun ölçülmesi hücre biyolojisinde sıkça kullanılan bir ispondur. Burada, yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde kullanılabilecek basit ve çok yönlü bir proliferasyon ölçme yöntemi salıyoruz.

Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme

Hücre bölünmeleri floresan etiketli proteinler ve zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Burada sunulan protokolü kullanarak, kullanıcılar hücre bölünmesi zamanlama dinamiklerini, mitotik mil montajını ve kromozom kongresini ve segregasyonlarını analiz edebilirler. RNA girişimini (RNAi) aracılı gen nakavtı sonrası bu olaylardaki kusurlar değerlendirilebilir ve ölçülebilir.

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, temel ve translasyonel araştırmalar için gelişmiş bir model sistemdir. Bu yöntem makalesi, farklı organoid fenotiplerin eşzamanlı kinetik değerlendirmesi için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntülemenin kullanımını detaylandırmaktadır.

Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme

Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.

Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Öğrenin, hücre izleme boyaları ve akış sitometrisi kullanarak bağışıklık hücrelerinin bölünmesini doğrudan nicelendirmeyi. Bu yöntem, pik modelleme yazılımı ile karmaşık popülasyonlarda proliferasyon yanıtlarını analiz etmenizi sağlar.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Daha fazla video keşfet