Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

Bu demonstrasyonun genel amacı, üç farklı hücre proliferasyon testini karşılaştırmak ve her bir yöntemin avantaj ve dezavantajlarını sunmaktır. Bu yöntem, en uygun hücre çoğalması yönteminin kullanılması gibi kanser araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre görüntüleyici adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin hazırlanması çok önemlidir.

Uygun hücre sayma maskesini uygulamadan önce hücrelere odaklanmanızı gerektirirler. Bu prosedüre başlamak için, fenol kırmızısı içermeyen DMEM kullanarak T75 santimetre kare doku kültürü şişelerinde üç gün boyunca iki MCF-7 hücre hattını %75 ila 80 oranında birleşecek şekilde büyütün. Üç gün sonra, ortamı bir atık kabına dökerek hücreleri şişelerden çıkarın.

Ardından, hücre tabakasını hemen iki mililitre önceden ısıtılmış iki kez tripsin ile yıkayın. Tripsini aspire edin ve bir inkübatöre yerleştirmeden önce hücre katmanına iki mililitre önceden ısıtılmış tripsin ekleyin. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mililitre ısıtılmış taze takviye edilmiş DMEM ile yıkayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Beş dakika sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Daha sonra, hücre peletini beş mililitre taze takviye edilmiş DMEM içinde yeniden askıya alın.

Hücre sayımı yapmak için, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 900 mikrolitre DPBS'nin bir katı ile seyreltin. Ardından, otomatik hücre sayacına yeni bir 60 mikrometre sensör yerleştirin. Pistonu basılı tutun ve sensörü seyreltilmiş hücre süspansiyonuna daldırın.

Hücre sayacındaki pistonu yavaşça serbest bırakın. Ardından, tamamlandığında sensörü hücre sayacından çıkarın. Hücreleri, üç ila beş gün boyunca hücre büyümesi ve proliferasyonun ölçülmesi için yer açmak için yaklaşık% 20 birleşimde 96 oyuklu bir plakada 100 mikrolitrelik bir son hacimde tohumlayın.

Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını belirlemek için, hem ortamı hem de tripsini bir hücre kültürü inkübatöründe, fırında veya su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından, ortamı hücrelerden bir atık kabına aspire edin. Daha sonra, 30 mikrolitre iki kez tripsin ile bir kez yıkayın ve ortamı tekrar atık kabına aspire edin.

Daha sonra, hücreleri tekrar 30 mikrolitre iki kez tripsin ile yıkayın ve 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için plaka kenarına hafifçe vurun. Daha sonra, 50 mikrolitre takviye edilmiş DMEM ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonu oluşana kadar hücreleri pipetleyerek karıştırın.

Cam kapak kızağını sayma odalarının üzerine yerleştirin ve kapak kayma kenarları ile helositometre arasında Newton'un kırılma halkaları görünene kadar yapıştırın. Ardından, 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu kapak fişinin altına nazikçe pipetleyin ve sayım odasının kılcal hareketle dolmasına izin verin. Ardından, ızgara düzenindeki sayma odalarını 10x büyütme altında görselleştirin.

Bu prosedürde, lüminesans reaktifini 22 santigrat derece su banyosunda 30 dakika boyunca çözdürün. Homojen bir karışım elde etmek için şişeyi yavaşça ters çevirin. Daha sonra, bir tabak tohumlanmış hücreyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dengeleyin.

Daha sonra, her oyuğa 100 mikrolitre lüminesans reaktifi ekleyin. İçeriği bir orbital çalkalayıcı üzerinde iki dakika karıştırın. Ardından, plakanın oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin.

Çok modlu plaka okuyucu yazılımını kullanarak bir lüminesans deneyi yapmak için çok modlu plaka okuyucuyu açın ve yazılımı açın. Görev Yöneticisi'nde Denemeler'i ve Yeni Oluştur'u seçin. Ardından, yan araç çubuğundan Dosya'yı seçin ve Protokol sekmesi altında Prosedür'ü seçin.

Ardından, plaka tipi olarak Greiner 96 düz tabanlı'yı seçin ve Kapağı Kullan kutusunu işaretleyin. Okuma yöntemi kutusunun altındaki Okuma eylemini seçin. Ardından, algılama yöntemi olarak Lüminesans'ı seçin ve Adımı Oku kutusunun OK.In tıklayın, Tam Plaka sekmesi altında taranacak kuyuları seçin ve boş kuyu görevi görecek kuyuları seçin.

Filtre Kümesi'ni Filtreyi Boşalt olarak ayarlayın. Kuyu başına 135 saniyelik Entegrasyon Süresi ve 5 milimetre Okuma Yüksekliği ile Kazancı 6,5'e ayarlayın. Lüminesans okuma ayarlarını kaydetmek için Tamam'a tıklayın.

Lüminesans okuması yapmak için, Enstrüman Kontrolü sekmesini seçerek plaka tutucuyu çıkarın ve Plaka Çıkışı'na tıklayın. 96 oyuklu plakayı, kapağın açık olduğundan emin olarak plaka tutucuya yerleştirin. Alet Kontrolü sekmesi altındaki Plaka Girişi'ne tıklayarak plaka tutucuyu kapatın.

Ardından, ışıldayan bir okuma gerçekleştirmek için araç çubuğunda Şimdi Oku'yu tıklatın. Bundan sonra, daha fazla analiz için her kuyu için RLU ölçümlerini bir elektronik tabloya aktarın. Bir hücre görüntüleme deneyi kurmak için çok modlu hücre görüntüleyiciyi açın ve yazılımı açın.

Görev Yöneticisi'nde, Denemeler sekmesini seçin ve Yeni Oluştur'u seçin. Dosya araç çubuğunda, Protokol sekmesine ve ardından Prosedür sekmesine tıklayın. Sıcaklığı Ayarla eylemini seçin.

İnkübatörü Açık olarak ayarlayın ve Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ön Isıtma'yı işaretleyin, ardından ayarları kaydetmek için Tamam'ı tıklayın. Ardından, Okuma eylemini seçin.

Algılama yöntemi olarak Görüntü'ye tıklayın. Ardından, Uç Nokta/Kinetik okuma türünü ve Filtreler optik türünü seçin ve Tamam'a tıklayın. Bundan sonra, tıklayın Tam Plaka sekmesine gidin ve görüntülenecek plakadaki kuyuları seçin. Ayarları kaydetmek için Tamam'a tıklayın.

Şimdi, açılır Hedefler seçeneğinden 2,5 kat hedefini seçin. Kanallar sekmesi altında, GFP 469.525 ve Parlak Alan'ı seçin. Her iki kanal için Otomatik Pozlama'yı kontrol edin ve otomatik pozlama kuyusunu seçin.

Otomatik netleme ayarlarını belirlemek için, Seçenekler'i tıklatın. Otomatik odaklama seçenekleri için, Tarama yöntemini seçin ve ardından otomatik odaklama. Ayarları kaydetmek için Tamam'a tıklayın.

Bundan sonra, kuyu merkezinden yatay ve dikey ofseti sıfıra ayarlayın. Üçe iki montajda kuyucuk başına birden fazla görüntüyü taramak için seçin. Ardından, prosedür ayarlarını kaydetmek için Tamam'a tıklayın.

Seçilen plaka üzerindeki deneyi okumak için Cihaz Kontrolü sekmesine tıklayın ve Plaka Çıkışı işlevini seçin. Kapağın açık olduğundan emin olarak plaka tutucuya 96 oyuklu bir plaka yerleştirin. Instrument Control (Cihaz Kontrolü) sekmesi altında, Plate In (Plaka Girişi) fonksiyonunu seçin.

Ardından, plaka sekmesinden Şimdi Oku'yu seçin ve tohumlamadan 96 saat sonrasına kadar her 24 saatte bir okumayı tekrarlayın. Bir görüntüyü analiz etmek için, görüntülenen plakadaki Veri sekmesine tıklayın ve Resim GFP 469, 525 artı Parlak Alan'ı seçin. Ardından, görüntülenen kutuya çift tıklayın.

Şimdi, yüklü bir resme tıklayın. Analiz Et'i seçin ve ardından analiz edilecek montajın tek görüntüsünü seçin. Ardından, Tamam'ı tıklayın. Ardından, yalnızca GFP kanalını kontrol edin ve parametreleri Tablo 3'te belirtildiği gibi ayarlayın.

Bundan sonra, tıklayın Başlama parametreleri görüntülenen hücrelere uygulamak için. Görüntü başına hücre sayısını belirlemek için kullanılan, görüntülenen hücrelerin üzerine yerleştirilen hücre sayma maskesini gözlemleyin. Değişiklikleri Uygula'ya tıklayın ve deney boyunca görüntülenen her plaka için bu ayarları koruyun.

Bu şekilde, MCF-7-LeGO hücrelerinde ve MCF-7-delta 40p53 hücrelerinde hücre proliferasyonunu ölçmek için incelenen farklı yöntemler arasındaki korelasyon ilişkilerini karşılaştırmak için doğrusal bir regresyon analizi yapılmıştır. Bir Pearson korelasyon katsayısı hesaplandı ve hücre proliferasyonunu ölçen farklı yöntemler arasındaki anlamlılık belirlendi. Lüminesans tabanlı tahlilin karşılaştırılması ile hücre görüntüleyici arasında en güçlü korelasyon gözlendi.

Burada, hücreler %100'e yakın birleşmeye ulaşana kadar her 24 saatte bir hücre görüntüleyici kullanılarak yakalanan GFP pozitif MCF-7-LeGO ve MCF-7-delta 40p53 meme kanseri hücrelerinin temsili görüntüleri gösterilmektedir. Bu yöntem, hücre büyümesini birden fazla gün boyunca görsel olarak izleyebilmek ve farklı hücre hatları arasındaki hücre boyutunu ve hücre morfolojisini karşılaştırmak da dahil olmak üzere yararlı hücresel bilgiler sağlar. Test edilen her yöntemin avantaj ve dezavantajlarının bir özeti burada gösterilmektedir, bu da yöntemlerin her birinin çok yönlülüğünü gösterir ve okuyuculara en uygun yöntemi seçmede yardımcı olur.

Bu videoyu izledikten sonra, üç farklı hücre proliferasyon testini iyi anlamalı ve hangisinin kendi deneysel tasarımınıza en uygun olduğunu belirleyebilmelisiniz.