Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Benim adım Maria ve İsveç'te NOS'ta Y Healthcare'de çalışıyorum. Hücre yüzey proteinleri genellikle hücreler ve çevreleri arasındaki iletişimde yer alır ve bu nedenle, hücre ortamındaki değişikliklerin neden olduğu hastalıkların yanı sıra diğer biyolojik varyasyonlar hakkında daha fazla bilgi edinmeyi amaçlayan araştırmalara özel bir ilgi gösterir. Bu videoda size basit bir yan göz atlatma hücre yüzeyi etiketleme protokolünü göstereceğim ve bu düşük miktarda proteinleri fiziksel güçlendirme yapmadan görsel olarak zenginleştirebilecek ve bu hücre yüzeyi proteinlerinin teknoloji ile farklılıklarını inceleyebileceksiniz.

Bu teknolojiyi ilginç bulursanız, 2D el kitabında daha fazla bilgi bulabilirsiniz. Ayrıca, bu özel konuyla ilgili işten indirebileceğiniz bir uygulama notumuz var Üstte görülen hücre yüzeyi etiketleme protokolünde, hücreleri hala sağlamken etiketlersiniz. Etiketleme işlemi sırasında, boya sadece hücre yüzey proteinlerine erişebilecektir.

Etiketleme adımından sonra, hücre yüzeyine özgü etiketlemeyi doğrulamak için hücreler analiz edilir. Etiket numunesi, zar ve sitozolik proteinlere ayrıldı. Paralel olarak fraksiyone edilmemiş bir numune hazırlandı.

Karşılaştırma için, bu fraksiyonlama analizi gerekli değildir, ancak burada sadece hücre yüzeyi protokolünün hücre yüzeyi pro ipuçları için spesifik olduğunu göstermek için yapılmıştır. Ayrıca, hücrelerin etiketlemeden önce yalan söylediği aşağıda görülen standart ETH diyet dışı etiketleme protokolünü de gerçekleştirdik ve bu şekilde tüm hücresel proteinler etiketleme için erişilebilir hale geldi. Etiketleme adımından sonra numuneler 2D elektroforezine tabi tutulur.

Yapışık bir hücre, hedeflenen hücre yüzey proteinlerinin sindirimini önlemek için enzimatik olmayan bir prosedür kullanılarak ayrılır. Bu protokolde, lastik polisi kullanıyoruz, ancak enzim üç hücreli ayrışma ortamını kullanmak da bir seçenek sayımıdır ve hücre süspansiyonlarını tüp başına beş ila 10 milyon hücreye böleriz. Hücreler daha sonra peletlenir ve hücre kültürü izlerini gidermek için H-P-S-S-P-H 7.4'te yıkanır.

Serum proteinlerinden ve floresan bileşenlerinden kaynaklanan ortam kontaminasyonu, etiketleme ve algılamayı etkileyebilir. Süspansiyon halinde büyüyen hücreler, yıkamadan sonra etiketleme aşamasından önce doğrudan peletlenir ve yıkanır. Hücre paleti, HPSS pH 8.5 ve bir molar üri içeren 200 mikrolitre buz gibi soğuk etiketleme tamponunda yeniden süspanse edilir.

Hücre yüzeyi proteinlerinin optimum etiketleme koşulları için her zaman pH'ı kontrol edin. Etiketlemeden önce, 10 milyon CHO hücresi için 600 pic kalıp yan gözü kullandık. Yan gözün hücre sayısına en uygun oranı, hücre tipine bağlı olarak değişecektir.

Hücre yüzeyindeki protein konsantrasyonlarını tam olarak bilmediğimiz için. Proteinlerin yan gözle etiketlenmesi için en uygun koşulların nasıl belirleneceği, 2D elektroforez prensipleri ve yöntemleri el kitabında açıklanmıştır. Hücreler yan göz D zemini ile inkübe edilir, karanlıkta buz üzerinde 20 dakika boyunca minimum zar atılır.

Etiketleme reaksiyonundan sonra, reaktif olmayan boya, 20 mikrolitre 10 milimolar lizin eklenerek söndürülür. Etiket hücreleri şimdi fazla yan gözü çıkarmak için soğuk HPSS pH 7.4 tamponunda iki kez yıkanır. Bu nedenle, bir sonraki adım olan hücre lizizinde istenmeyen hücre içi etiketleme veya proteinler için serbest boya kalmayacaktır.

Hücre yüzeyindeki proteinler artık etiketlenir ve hücreler yıkanır ve bitlenmeye hazır hale gelir. Kayıp yıkama adımından elde edilen pelet, yedi molar üri, iki molar thi uria,% 4 chaps, 30 milimolar ağaç, beş milimolar magnezyum asetat pH 8.5 içeren 150 mikrolitrelik soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edilir ve ara sıra girdap vergisi ile en az bir saat buz üzerinde bırakılır. Numuneler artık 2D ayırma için hazırdır.

Elektrolizin ilk adımı, rehidrasyon için IPD şeritleri hazırlamaktır. Kullanılan şeritlerin pH aralığına karşılık gelen IPG tamponu ekleyerek bölgesel rehidrasyon solüsyonu hazırlayın ve solüsyonu rehidrasyon tepsisinin merceğine ekleyin. IPG şeridinin koruyucu filmini çıkarın ve şeritleri, rehidrasyon solüsyonunu içeren rehidrasyon tepsisine kuru bir jel aşağı bakacak şekilde dikkatlice yerleştirin.

IPG kutusunun kapağını kapatın ve şeritleri gece boyunca yeniden sulandırın. Birinci boyut olan izoelektrik odaklamada, proteinler pi'lerine göre ayrılır. Bu, IPG dört üç kullanılarak gerçekleştirilir.

Yeniden sulandırılmış şeritler manifolda yerleştirilir ve elektrot üstüne monte edilir. Her bir numuneden 50 mikrogram, numune uygulama kapakları kullanılarak uygulandı. Fraksiyonlanmamış numuneleri ya önceden fraksiyonlama yapmadan doğrudan uyguladık ya da numuneleri uygulanmadan önce membran ve sitozolik fraksiyonlara fraksiyonlara ayırdık.

Floresan numuneleri ışıktan korumak için kurşun kapatılır. Cihaz tavsiyeye göre programlandı ve gece boyunca çalıştırıldı. Büyük% 12 lamby jeller, yetişkin 12 jel kullanılarak maliyetlendirildi.

Borularda polimerize akry jellerini önlemek için koster yer değiştirme çözeltisi eklendi. Jellerin, kullanımdan önce oda sıcaklığında gece boyunca polimerize olmasına izin verildi. İzoelektrik odaklamadan sonra, şeritler çıkarılır ve sistein kalıntılarının di sülfür bağlarını azaltmak için DTT kullanılarak iki adımda SDS içeren tamponda dengelenir ve ardından akrilamid ile modifikasyonu önlemek için asetamidinizle alkilasyon yapılır.

IPG şeritleri çalışma tamponuna batırılır ve büyük iki kazma jelinin üzerine dikkatlice yerleştirilir. Üstüne bromo anol mavisi ile erimiş %2 agro solüsyon ekleyerek şeritler ile sızdırmaz hale getirilmiş jel arasında hava sıkışmasını önleyin. Jeller artık ikinci boyut SDS sayfa ayrımı için hazırdır İkinci boyut SDS sayfasında.

Proteinler molekül ağırlığına göre ayrılacak ve bu tonal six sistemi ile gerçekleştirilecektir. Elektroforez odasını anodik çalışma tamponu ile doldurun, jelleri yerleştirin ve üst bölmeyi katodik çalışma tamponu programı ile doldurun. Güç kaynağı tavsiyelere göre çalışır ve ikinci boyutu yaklaşık dört ila beş saat boyunca veya boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar ışıktan korur.

İkinci boyut elektroforezinden sonra, tayfun floresan görüntüleyicideki tutucular kullanılarak jel kasetleri yerleştirilir. İki jel ve üç kanal aynı anda taranabilir. Bu iki DL'den elde edilen sonuç, hidrofobik proteinlerin A iki DL'de tespit edilmesi için bilinen bazı kısıtlamalar olsa bile, numunedeki zar proteinlerinin yüksek çözünürlüğünü gösterir.Sonuçlar, burada kırmızı ile gösterilen ve burada yeşil ile gösterilen standart etiketleme protokolü kullanılarak tespit edilmeyen birçok yeni hücre yüzeyi etiket noktasını göstermektedir.

Bu sonuçlar, hücre yüzeyi etiketleme protokolünün, hücre yüzeyi proteinlerini etiketlemek için oldukça spesifik olduğunu göstermektedir. Hücre yüzey proteinleri özel olarak etiketlendiğinden, daha kolay görselleştirilirler ve bol miktarda sitozolik proteinler tarafından zayıflama önlenir. Fraksiyone edilmemiş membran fraksiyonu veya sitozolik fraksiyonu olan jellerin floresan görüntüsü üstte gösterilmiştir.

Aşağıda gümüş ile aynı jel post lekesinin bir görüntüsü bulunmaktadır. Sonuçlar, sitozolik proteinlerin floresan etiketlemesini göstermez, ancak gümüş boyama, jellerde proteinler olduğunu gösterir. Sonuçlar ayrıca, fraksiyonlanmamış ve membran fraksiyonlarından benzer nokta haritası desenlerini gösterir ve 2D elektroforezden önce fraksiyonlamaya gerek olmadığını gösterir, bu da bu protokolü hem basit hem de kullanışlı hale getirir.

SI iki, SI üç ve SCI beş benzer etiketleme modelleri gösterir ve hepsi hücre yüzey protokolü ile uyumludur. Farklı süreler boyunca serum açlığının CHO hücrelerinde hücre yüzey proteinlerinin diferansiyel ekspresyonunu incelemek için üç yan göz DI tabanı minimal dy kullanılarak bir diyet deneyi yapıldı. Deneydeki tüm örneklerden alınan CY iki hücre yüzeyi örneği bir araya getirildi ve dahili bir standart olarak kullanıldı.

Açlık döneminde birkaç hücre yüzey proteininin diferansiyel değişiklikleri takip edilebilir. Hazırlayıcı jeldeki proteinlerin kimliğini bulmak için standart protokol ile tespit edilmeyen hücre yüzeyi protokolü kullanılarak 18'den fazla yeni zar proteini tespit edildi. Analitik veri setindeki noktalarla eşleşmeyi kolaylaştırmak için hücre yüzeyi numunesi ile ani bir artış yapmak gerekliydi.

Sonuçlar var. Sonuçlar, çok sayıda hücre yüzey proteininin yüksek çözünürlüğünü göstermektedir. Bu protokol hücre yüzey proteinleri için çok spesifiktir ve hücre içi proteinlerin etiketlenmesi görülmemiştir.

Bu yöntemle, standart bir protokole kıyasla daha fazla hücre yüzeyi proteini tespit edebilirsiniz ve daha önce gördüğünüz gibi, çalıştırılması çok basit bir protokoldür. Hücre yüzey proteinlerinizi hala sağlamken etiketlemeniz ve bunları zar fraksiyonlaması olmadan doğrudan 2D elektroforez üzerinde çalıştırmanız yeterlidir. Yani bu, hücre yüzey proteinlerini ve D teknolojisine sahip olanların farklılıklarını incelemek için çok iyi bir protokoldür.