Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Benim adım Maria ve İsveç'teki NOS'ta bulunan Y Healthcare'de çalışıyorum. Hücre yüzey proteinleri genellikle hücreler ile çevreleri arasındaki iletişime katılırlar ve bu nedenle, hücre ortamındaki değişikliklerin yol açtığı biyolojik varyasyonların yanı sıra hastalıklara dair daha fazla bilgi edinmeyi amaçlayan araştırmalarda özel bir ilgi odağıdırlar. Bu videoda size basit bir yan bakışlı kaçınma hücre yüzeyi etiketleme protokolü göstereceğim; böylece fiziksel güçlendirme olmaksızın, düşük bolluktaki bu proteinleri görsel olarak zenginleştirebilecek ve bu teknoloji ile hücre yüzey proteinleri arasındaki farklılıkları inceleyebileceksiniz.

Bu teknolojiyi ilgi çekici bulduysanız, 2D el kitabında daha fazla bilgi bulabilirsiniz. Ayrıca, bu özel konuyla ilgili olarak job adresinden indirebileceğiniz bir uygulama notumuz mevcuttur. Yukarıda görülen hücre yüzeyi işaretleme protokolünde, hücreleri henüz bozulmamış haldeyken işaretlersiniz. İşaretleme işlemi sırasında, boya yalnızca hücre yüzeyi proteinlerine erişebilecektir.

Etiketleme adımının ardından, hücre yüzeyine özgü etiketlemeyi doğrulamak için hücreler analiz edilir. Etiketli örnek, membran ve sitozolik proteinler şeklinde fraksiyonlara ayrılmıştır. Paralel olarak fraksiyona ayrılmamış bir örnek hazırlanmıştır.

Karşılaştırma amacıyla, bu fraksiyonlama analizi gerekli değildir; ancak burada sadece hücre yüzeyi protokolünün hücre yüzeyi proteinleri için spesifik olduğunu göstermek amacıyla yapılmıştır. Ayrıca, aşağıda görülen standart ETH diyet dışı etiketleme protokolünü de uyguladık; hücreler etiketlemeden önce lizize edilir ve bu sayede tüm hücresel proteinler etiketleme için erişilebilir hale gelir. Etiketleme adımının ardından, örnekler 2D elektroforeze tabi tutulur.

Hedeflenen hücre yüzey proteinlerinin sindirimini önlemek için yapışkan hücreler enzim dışı bir prosedür kullanılarak ayrıştırılır. Bu protokolde kauçuk polisman kullanıyoruz, ancak enzim içermeyen hücre ayrıştırma ortamı kullanmak da bir seçenektir; hücre süspansiyonlarını sayın ve tüp başına 5 ila 10 milyon hücre olacak şekilde paylaştırın. Ardından, hücre kültürü kalıntılarını uzaklaştırmak için hücreler çöktürülür ve H-P-S-S-P-H 7.4 ile yıkanır.

Serum proteinlerinden ve floresan bileşenlerden kaynaklanan besiyeri kontaminasyonu, etiketleme ve deteksiyon süreçlerini etkileyebilir. Süspansiyonda büyüyen hücreler, yıkama sonrası etiketleme adımından önce doğrudan pelletlenir ve yıkanır. Hücre pelletlemesi, HPSS pH 8.5 ve bir molar uria içeren 200 µL buz gibi soğuk etiketleme tamponu ile yeniden süspanse edilir.

Hücre yüzey proteinlerinin optimal etiketleme koşulları için her zaman pH değerini kontrol edin. Etiketlemeden önce, 10 milyon CHO hücresi için 600 pmol side-eye kullandık. Side-eye ile hücre sayısı arasındaki optimal oran, hücre tipine göre değişiklik gösterecektir.

Hücre yüzeyindeki kesin protein konsantrasyonları bilinmediğinden, proteinlerin yan-zincir etiketlemesi için optimal koşulların nasıl belirleneceği 2D elektroforez prensipleri ve yöntemleri el kitabında açıklanmıştır. Hücreler, yan-zincir D floor, minimal dice ile buz üzerinde, karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edilir.

Etiketleme reaksiyonundan sonra, reaksiyona girmemiş boya, 20 µL 10 mM lizin eklenerek söndürülür. Fazla boyayı uzaklaştırmak için etiketlenen hücreler, soğuk HPSS pH 7.4 tamponu ile iki kez yıkanır. Böylece, bir sonraki adım olan hücre lizisinde, istenmeyen hücre içi etiketleme veya protein etkileşimleri için ortamda serbest boya kalmamış olur.

Hücre yüzeyindeki proteinler artık etiketlenmiş olup hücreler yıkanmış ve liz edilmeye hazırdır. Son yıkama adımından elde edilen pelet; yedi molar üre, iki molar tiyüre, %4 CHAPS, 30 milimolar Tris, beş milimolar magnezyum asetat pH 8.5 içeren 150 µL soğuk liz tamponu içinde yeniden süspanse edilir ve ara ara vorteksleyerek en az bir saat boyunca buz üzerinde bekletilir. Örnekler artık 2D ayırma işlemi için hazırdır.

Elektrolizin ilk adımı, rehidrasyon için IPD şeritlerini hazırlamaktır. Kullanılan şeritlerin pH aralığına uygun IPG tamponu ekleyerek rehidrasyon çözeltisini hazırlayın ve çözeltiyi rehidrasyon tepsisinin haznesine ekleyin. IPG şeridinin koruyucu filmini çıkarın ve şeritleri, kurutulmuş jel kısmı aşağıya bakacak şekilde, rehidrasyon çözeltisi içeren rehidrasyon tepsisine dikkatlice yerleştirin.

IPG kutusunun kapağını kapatın ve şeritleri gece boyunca rehidre edin. İlk boyutta, izoelektrik odaklama ile proteinler pI değerlerine göre ayrılır. Bu işlem IPG four three kullanılarak gerçekleştirilir.

Rehidrate edilen şeritler manifolda yerleştirilir ve elektrot üzerine monte edilir. Numune uygulama kapakları kullanılarak her bir numuneden 50 µg uygulandı. Numuneler, ön fraksiyonasyon yapılmadan doğrudan veya uygulama öncesinde membran veletozolik fraksiyonlara ayrılarak uygulandı.

Floresanlı örnekleri ışıktan korumak için kapak kapatılır. Cihaz, önerilere göre programlanmış ve gece boyunca çalıştırılmıştır. Yetişkin 12 jel kullanılarak büyük %12'lik lamby jelleri hazırlanmıştır.

Tüplerde akrilamid jellerin polimerize olmasını önlemek için Coster yer değiştirme çözeltisi eklendi. Jellerin kullanımdan önce oda sıcaklığında gece boyunca polimerize olmasına izin verildi. İzoelektrik odaklama işleminden sonra şeritler çıkarıldı ve SDS içeren tamponda iki aşamada dengeye getirildi; önce sistein kalıntılarının disülfit bağlarını indirgemek için DTT kullanıldı, ardından akrilamid tarafından modifikasyonu önlemek için iodoasetamid ile alkilasyon yapıldı.

IPG şeritleri yürütme tamponuna daldırılır ve büyük iki boyutlu jellerin üzerine dikkatlice yerleştirilir. Şeritler ile jel arasında hava kalmasını önlemek için üzerine bromofenol mavisi içeren eritilmiş %2 agar çözeltisi eklenerek mühürlenir. Jeller artık ikinci boyut SDS-PAGE ayrımı için hazırdır. İkinci boyut SDS-PAGE aşamasında.

Proteinler moleküler ağırlıklarına göre ayrılacaktır ve bu işlem tonal six sistemi ile gerçekleştirilir. Elektroforez tankını anodik çalışma tamponu ile doldurun, jelleri yerleştirin ve üst bölmeyi katodik çalışma tamponu ile doldurun. Güç kaynağını önerilere göre programlayın ve ikinci boyutu, yaklaşık dört ila beş saat boyunca veya boya cephesi jelin altına ulaşana kadar ışıktan koruyarak çalıştırın.

İkinci boyut elektroforezden sonra, jel kasetleri tutucular kullanılarak typhoon floresan görüntüleme cihazına yerleştirilir. İki jel ve üç kanal aynı anda taranabilir. Bu iki boyutlu jel elektroforezden (2D-GE) elde edilen sonuç, hidrofobik proteinlerin 2D-GE ile tespit edilmesindeki bazı bilinen kısıtlamalara rağmen, örnekteki membran proteinlerinin yüksek çözünürlükte olduğunu göstermektedir. Sonuçlar, standart etiketleme protokolüyle (burada yeşil ile gösterilen) tespit edilemeyen ve burada kırmızı ile gösterilen birçok yeni hücre yüzey etiketi lekesini ortaya koymaktadır.

Bu sonuçlar, hücre yüzeyi işaretleme protokolünün hücre yüzeyi proteinlerini işaretlemede oldukça spesifik olduğunu göstermektedir. Yalnızca hücre yüzeyi proteinleri işaretlendiği için, bu proteinler daha kolay görselleştirilir ve bol miktarda bulunan sitozolik proteinlerin neden olduğu sinyal azalması önlenmiş olur. Fraksiyonlanmamış membran fraksiyonu veya sitozolik fraksiyon içeren jellerin floresan görüntüsü üstte gösterilmiştir.

Aşağıda, aynı jelin gümüşle boyanmasından sonraki görüntüsü yer almaktadır. Sonuçlar,le sitozolik proteinlerin floresan işaretlenmediğini göstermekte, ancak gümüş boyama jellerde proteinler olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuçlar ayrıca, fraksiyone edilmemiş ve membran fraksiyonlarından benzer spot haritası modelleri sergileyerek, 2D elektroforez öncesinde fraksiyona gerek olmadığını göstermektedir; bu durum, protokolü hem basit hem de kullanışlı kılmaktadır.

SI iki, SI üç ve SCI beş benzer etiketleme modelleri göstermektedir ve tamamı hücre yüzeyi protokolü ile uyumludur. Farklı sürelerde serum açlığına maruz bırakılan CHO hücrelerindeki hücre yüzeyi proteinlerinin diferansiyel ekspresyonunu incelemek amacıyla, her üç yan göz DI taban minimal dy kullanılarak bir diyet deneyi gerçekleştirilmiştir. Deneydeki tüm örneklerden alınan CY iki hücre yüzeyi örnekleri havuzlanmış ve internal standart olarak kullanılmıştır.

Açlık dönemi boyunca birkaç hücre yüzey proteinindeki diferansiyel değişiklikler takip edilebilirdi. Hazırlık jelindeki proteinlerin kimliğini belirlemek için kullanılan standart protokolle tespit edilemeyen 18'den fazla yeni membran proteini, hücre yüzey protokolü kullanılarak tespit edildi. Analitik veri setindeki lekelerle geri eşleştirmeyi kolaylaştırmak için hücre yüzey örneği ile destekleme (spike) yapmak gerekliydi.

Sonuçlar burada yer almaktadır. Sonuçlar, çok sayıda hücre yüzeyi proteininin yüksek çözünürlükte elde edildiğini göstermektedir. Bu protokol hücre yüzeyi proteinleri için oldukça spesifiktir ve hücre içi proteinlerin herhangi bir işaretlenmesine rastlanmamıştır.

Bu yöntemle, standart bir protokole kıyasla daha fazla hücre yüzeyi proteinini saptayabilirsiniz ve daha önce gördüğünüz üzere, uygulanması oldukça basit bir protokoldür. Hücre yüzeyi proteinlerini henüz bozulmamışken etiketler ve membran fraksiyonlaması yapmadan doğrudan 2D elektroforezde yürütürsünüz. Bu nedenle, hücre yüzeyi proteinlerini ve bunların D teknolojisi ile olan farklılıklarını incelemek için oldukça uygun bir protokoldür.