Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Bu videoda gösterilen yöntem, embriyonik sülfatın içsel veya dışsal talimatlarla belirlenip belirlenmediğini değerlendirmek için tek bir blaser'ın kültürünü izole olarak tanımlamak için bölünme aşaması opus embriyosunun kader haritalarını kullanır, ilk bölünme karığının hayvan yarımküresinin hafif pigmentli alanını ikiye böldüğü ilk iki hücre embriyosu toplanır. Bu embriyolar, embriyolar 16 ila 32 hücreye ulaştığında kültürlenir, daha sonra vitel zarı çıkarılır ve komşu hücreler seçilen hücreden diseke edilir. Örnek olarak, disseke edilmiş blaster daha sonra burgu kaplı bir kültürde iyi ve kültürlenmiş bir çöküntüye aktarılır.

Eksplan istenen aşamaya ulaştığında, in situ hibridizasyon, QPCR veya immünohistokimya kullanılarak gen veya protein ekspresyonunu değerlendirmek için hasat edilir. Bu tekniğin kültürleme, büyük embriyonik hücre grupları veya oturum açma organı gibi diğerlerine göre en büyük avantajı, gelişimsel kaderi soy izleme çalışmalarından bilinen tek embriyonik küfürlerin, ilave büyüme faktörleri veya komşu hücrelerin varlığı olmadan kültürlenebilmesidir. Bu nedenle, hücreye özgü faktörlerin, bu küfrün belirli bir dokunun öncüsü olmasını emredip etmediğini veya çevredeki hücrelerden sinyaller gerektirip gerektirmediğini doğrudan test edebilirsiniz.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, Blairs'in diseksiyonu ve bunların kültür kuyularına aktarılması stereo mikroskop altında hassas manipülasyonlar gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir. Bu videoda, maternal kaynaklı mRNA'ların diseksiyon mikroskobu altında çalışarak hücreleri nöral bir kadere doğru yönlendirip yönlendirmediğini göstermek için bu yöntemi kullanacağım. Illumina aşındırıcı film kullanarak dört set forseps keskinleştirin.

Bir çift forseps, işlem sırasında bir ucun hasar görmesi durumunda yedek olarak işlev görür, dört forsepsin tümünü otoklavlayın ve steril bir kapta saklayın, her biri 0.1 x ve 1.0 x modifiye barth salin veya MBS'den 500 mililitre yapın ve bunları filtreyle sterilize edin. Bu çözeltileri 14 ila 18 santigrat derecede aylarca vidalı kapaklı bir şişede saklayın, 100 mililitre bir X kültüründe% 2 elektroforez dereceli aros hazırlayın. Aros mikrodalgayı çözmek, aros sıvı haldeyken bir sonraki ihtiyaç duyulduğunda aroları sıvılaştırmak için orta otoklav.

Steril 24 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğunun dibine yaklaşık 0,5 mililitre dökün. Bu, implantların plastiğe yapışmasını önleyecektir. Daha sonra iki ila 360 milimetrelik Petri kabının dibine yaklaşık iki ila üç mililitre dökün ve dağıtmak için hafifçe döndürün.

Bunlar diseksiyon çanakları görevi görür ve aros embriyoların plastiğe yapışmasını önler. Zarları çıkarıldıktan sonra, aros soğuduğunda ve alev sertleştiğinde, altı inçlik bir mera pipetinin ucu bir top halinde eriyene kadar pipetlenir. Topu kısa bir süre yeniden çerçeveleyin, ardından kültür plakasının bir kuyusunda aros yüzeyine hafifçe dokundurun.

Bu, X explan'ın yerleştirileceği sığ bir çöküntü yaratacaktır. Plakadaki her kuyucuk için tekrarlayın. Daha sonra, kültür plakasının her bir kuyusunu bir mililitre bir x steril kültür ortamı ile doldurun.

Ardından, blaster ayrımını kolaylaştırmak için diseksiyon kabını 0,1 XMBS ile doldurun. Diseksiyon kapları hazırlandıktan sonra, döllenmiş yumurtaları jöle katları çıkarılmış olarak 0,5 x kültür ortamı içeren 100 milimetrelik Petri kaplarına aktarın. Hemen kullanılmayanlar 14 santigrat derecede kültürlenebilirken, ilk yemek iki hücreli embriyo için incelenir.

İlk Petri kabındaki embriyoları bir diseksiyon mikroskobu kullanarak inceleyin, plastik bir transfer pipeti kullanın, yaklaşık 101 hücre ve iki hücreli embriyoyu 0.5 x kültür ile doldurulmuş ayrı bir kaba aktarın. Orta. Petri kabını 14 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bu tahlilin bir hücrenin gelişim potansiyelini doğru bir şekilde değerlendirme yeteneği, kader haritalarına dayalı olarak doğru küfrün incelenmesine dayanır.

Bu nedenle, iki hücre aşamasında doğru pigmentasyon paternine sahip embriyoların seçilmesi çok önemlidir ve sonuç olarak düzenli bölünme modellerine uyar. Burada gösterildiği gibi. Düzenli bölünmeler genellikle embriyonun sadece bir tarafında meydana gelir.

Bu embriyolar, donör hücre normal taraftan geliyorsa, hala donör olarak kullanılabilir. Embriyolar iki hücre aşamasına ulaştığında, ilk bölünme karığının hayvan yarımküresindeki hafif pigmentli alanı ikiye böldüğü olanları ayrı bir tabağa sıralayın, diseke edilecek embriyonun yaklaşık beş katını sıralayın. Bunlar exrelease için bağışçılar olacak.

Kalan iki hücreli embriyoları, ekstansı evrelemek için kardeş kontrolleri olarak hizmet etmek üzere prosedür boyunca donör embriyoların yanında ayrı bir tabakta tutun. Embriyolar sıralandıktan ve parçalara ayrıldıktan sonra, daha fazla bir hücre ve iki hücreli embriyo bulmak için inkübatördeki bulaşıklara geri dönün. Bir hücreli embriyoların bölünmesi yaklaşık 90 dakika sürdüğünden, bu yumurta toplama işleminden iki saat sonrasına kadar yapılabilir.

Sergiyi hazırlamak için, bir diseksiyon kabına beş ila 10 embriyo yerleştirin. Daha sonra ilk embriyoyu şeffaf vitel zarı forseps ile kavranabilecek şekilde konumlandırın. Genellikle görülemez, ancak embriyonun yüzeyinin üzerinde açık bir peral boşluk ile ayrıldığı hayvan direğinde kavranabilir.

Bir elinizle keskinleştirilmiş bir forseps kullanarak, zarar vermemek için incelenecek blasterden belirli bir mesafeden kavrayın. Daha sonra keskinleştirilmiş forsepslerle diğer yandan zarı diğer forsepsin ucuna yakın bir şekilde kavrayın ve zarı soymak için nazikçe zıt yönlere çekin. Zar çıkarıldığında embriyo düzleşecektir.

Daha sonra, forseps ile komşu bir hücre tutun ve bu hücreyi bir tutamak olarak kullanın, böylece disseke edilecek hücre diğer yandan forseps ile doğrudan temas etmez, kalan komşu hücreleri nazikçe istenen küfürden uzaklaştırın. Aynı kaderi paylaşan orta hat hücreleri hedeflenirse, bir çift olarak birlikte çıkarılabilirler. Son olarak, tutamak hücresini inceleyin.

Küfür veya amer çiftini steril bir cam pipetle alın, hava kabarcıklarından ve aşırı emişten kaçının. Mera pipetinin ucunu kültür ortamının yüzeyinin altına, X explan kültür kabının bir kuyusuna yerleştirin ve blaster'ı nazikçe dışarı atın. Yerçekimi ile sığ çöküntüye kaymalıdır.

Birden fazla embriyodan elde edilen küfürler, bir kültürde aynı depresyona yatırılarak tek bir eksplan halinde birleştirilebilir. Peki, bu işlemi diseksiyon kabında kalan embriyolarla tek tek tekrarlayın. Yaklaşık 10 embriyodan sonra, diseksiyon kabı hücresel kalıntılarla doldurulacaktır.

Bu olduğunda, bir sonraki diseksiyon kabına geçin. Tüm diseksiyonlar yapıldıktan sonra, explan'ın sığ çöküntülerde olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, %70 Etanol içinde sterilize edilmiş bir saç halkası ve son diseksiyondan yaklaşık bir saat sonra tezgahta oda sıcaklığında havayla kurutulmuş inkübe implantları ile nazikçe çukura itilebilirler.

İyileşmiş ekplanı çevreleyen kalıntıları steril bir cam mera pipet kültürü ile temizleyin. 14 ila 20 santigrat derece sıcaklıkta, kardeş kontrol embriyolarını içeren Petri kabının yanındaki explan plakası. Kardeş embriyolar, küfür explan'ın gelişim aşamasını gösterecektir.

Kültürde yaklaşık bir ila iki saat sonra, ekilen blastomerler yaklaşık dört kez bölünecek ve hasarlı komşu hücrelerden kalan kalıntıların çoğunu dökecektir. 20 saat sonra, küçük sağlam hücre topları oluştururlar. Kardeşler istenen gelişim aşamasına ulaştığında, exlan'ı hasat edin.

Bu ekslantasyonlar, hücrelerin bir kısmı parçalansa bile oldukça iyi hayatta kalır. Bu nedenle, kültürde bulanık bir kitle varsa, içinde sağlıklı bir explan'ın gömülü olup olmadığını belirlemek için bir saç halkası veya forseps ile iyi araştırın. Explan'ı, pipetinizden geçen bir bardakla küçük hacimli bir kültür çözeltisinde alın ve nazikçe yapılacak test için uygun bir fiksatif veya lizis tamponuna boşaltın.

İki dorsal küfür veya iki ventral küfür, 16 hücre aşamasında diseke edildi ve kardeş embriyolar erken nöral plaka aşamalarına ulaşana kadar 14 santigrat derecede bir XMBS'de kültürlendi. Her örnek, zigotik bir nöral plakanın ekspresyonu için test edildi. Gene Sox, mavi reaksiyon ürünü olarak görülen in situ hibridizasyon ile iki tane.

Bu testin sonuçları, nöral plakanın öncüleri olan dorsal hayvan küfürlerinin çoğunun, SOX iki'yi otonom olarak eksprese edebildiğini göstermektedir. Bu, embriyonun diğer bölgelerinden ek bir sinyal olmadan. SOX iki eksprese etmeyen ekslansiyonlar, diseksiyon sırasında yanlış tanımlanmış olabilir.

Buna karşılık, ventral epidermisin öncüsü olan ventral hayvan küfürlerinin hiçbiri SOX iki eksprese etmez. Bu veriler, dorsal hayvan küfürlerinin nöral doku oluşturma konusunda içsel bir yeteneğe sahip olduğunu, oysa ventral hayvan küfürlerinin not etmediğini göstermektedir. Dorsal ekplanın bir kısmı ayrıca dorsal mezoderm oluşumunu gösteren bir morfolojiyi

Bu blastomerler ayrıca bozulmamış embriyoda Noor'u oluşturmak için soluklaştırılır ve bir eksplan kültürü, maternal eksprese edilen bir nöral genin endojen seviyelerini değiştirmenin etkisini test etmek için bir Noor işaretleyici proteini eksprese eder. Fox D'ye beş mRNA, sekiz hücreli ventral öncü küfürlere enjekte edildi. Burada gösterildiği gibi, ventral implantların çoğu SOX iki eksprese etti.

Tersine, Fox D beşinin endojen seviyesi, sekiz hücreli dorsal öncü blasterlere antisens morf oligonükleotidlerin enjeksiyonu ile azaltıldığında, sadece birkaç dorsal ekplan SOX ikiyi eksprese etti. Bu deneyler, Fox D beşinin maternal ifadesinin, bu prosedürden önce dorsal küfürlerin sinirsel bir kader edinme içsel yeteneğinde rol oynadığını göstermektedir. Ek soruları yanıtlamak için diseke edilmek üzere Blairs'e ya fonksiyon kazanımı için mRNA'lar ya da fonksiyon kaybı için antisens morfo oligonükleotidler gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Örneğin, hücrelerin belirli bir gelişimsel kadere yol açma içsel yeteneğinde hangi genler yer alır? Ek olarak, kültür ortamına saflaştırılmış faktörler eklenerek bilinen sinyal faktörleri test edilebilir. Bu yaklaşım, bireysel küfürleri bozulmamış embriyodaki yeni yerlere nakletmek için de kullanılabilir.

Bu, nakledilen hücrenin orijinal gelişimsel kaderine bağlı olup olmadığını test eder, bu bilgi, pluripotent bir embriyonik hücrenin tanımlanmış bir dokunun öncüsü olmaya kendini adadığı hücresel mekanizmaları tanımlamak için kritik öneme sahiptir.