Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

Bu prosedürün genel amacı, tek nükleotid çözünürlüğü ile RNA ikincil yapısının tahmin edilmesidir. Bu, ilk olarak katlanmış RNA'nın, RNA'nın tek sarmallı veya esnek bölgelerini izole eden bir elektrofilik reaktif ile kimyasal olarak modifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, RNA'nın kimyasal olarak modifiye edilmiş bölgelerini tespit etmek için ters transkripsiyon kullanmaktır.

Daha sonra, ters transkripsiyonun CD NA ürünleri kapiler elektroforez ile fraksiyonlanır. Son adım, veri işleme ve normalleştirmedir. Sonuç olarak, RNA yapısı yazılımı, şekil analizinden türetilen sözde serbest enerji kısıtlamalarını kullanarak RNA ikincil yapısını tahmin etmek için kullanılır.

Bu yöntem, RNA yapısının katalitik ve güncel olmayan RNA'ların işlevlerini nasıl yönettiği ve viral RNA genomlarının genomlarının çok işlevliliğini nasıl düzenlediği gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin sonuçları, viral hastalıkların veya kanserin tedavisine ve teşhisine kadar uzanır, çünkü RNA ikincil yapısı hakkında bilgi edinmek, yapı bazlı ilaçların tasarımına yardımcı olabilir. Bu yöntem, in vitro transkripsiyon ile üretilen RNA'ların yapısı hakkında bilgi sağlasa da, şekil reaktifleri hücre geçirgen olduğu için in vivo olarak da uygulanabilir.

Bu işleme başlamadan önce, in vitro transkripsiyon ile RNA'yı hazırlayın. Ticari bir transkripsiyon kiti kullanma. RNA'lar, 0.5 mikrolitrelik bir mikro santrifüj tüpünde eksi 20 ila eksi 80 santigrat derece arasındaki TE tamponunda saklanmalıdır.

12 piko mol RNA'yı 18 mikrolitreye su ile seyreltin ve tüpe hafifçe vurarak iki mikrolitre 10 x yeniden olgunlaşma tamponu karışımı ekleyin, ardından tüpteki karışımı kısa bir süre döndürerek bir dakika boyunca 85 santigrat dereceye ısıtın, ardından saniyede 0.1 santigrat derece oranında dört santigrat dereceye soğutun. Mikro santrifüj tüpüne 100 mikrolitre su ve 30 mikrolitre beş x katlanır tampon ekleyin. Bunu takiben, tüpün içeriğini katlanan RNA'ya bağlı olarak 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Genel olarak, daha uzun ve daha yapılandırılmış RNA'ların magnezyuma bağlı katlanması daha uzun inkübasyon süreleri gerektirir 72 mikrolitrelik bir alikotu iki adet 0.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün her birine aktarın, bunlar sırasıyla modifiye ve kontrol olarak etiketlenmelidir. Bir sonraki adım, kontrol karışımına sekiz mikrolitre susuz dimetil sülfoksit eklemek ve bir kenara koymaktır. Ardından, modifiye edilmiş karışıma sekiz mikrolitre 10 x ve MIA ekleyin.

Modifiye edilmiş ve kontrol karışımını 37 santigrat derecede 50 dakika inkübe edin. Sekiz mikrolitre üç sodyum asetat pH, 5.28 mikrolitre 100 milimolar EDTA, 240 mikrolitre soğuk etanol ve mililitre başına 10 miligram bir mikrolitre ekleyin. Modifiye edilmiş RNA'yı çökeltmek için modifiye edilmiş karışık tüpe glikojen, tüpün içeriğini eksi 20 santigrat derecede iki saat boyunca soğutun ve daha sonra dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüjleyin.

Daha sonra peleti iki kez soğuk, %70 etanol santrifüj ile beş dakika yıkayın. Her yıkamadan sonra, süpernatanı mikro pipetle çıkarın ve peleti beş dakika havayla kurutun. Oda sıcaklığında, modifiye edilmiş ve kontrol numunelerini 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde ters transkripsiyon için hazırlayın.

Modifiye reaksiyon için, beş mikrolitre modifiye RNA, altı mikrolitre su ve bir mikrolitre 10 mikromolar sci beş etiketli primer çözeltisini karıştırın. Kontrol reaksiyonu için beş mikrolitre kontrol RNA'sı, altı mikrolitre su ve bir mikrolitre 10 mikromolar sci 5.5 etiketli primer solüsyonu karıştırın. Tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve astarı RNA'ya diz çökün.

Diz çökme sırasında 2,5 x RT karışımı hazırlayın. Her RT reaksiyonu için iyice karıştırın ve diz çökme reaksiyonlarına eklemeden önce beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Diz çökme reaksiyonlarının sıcaklığı 50 santigrat dereceye ulaştığında, sekiz mikrolitre 2.5 XRT ekleyin.

Karıştırın ve 50 santigrat derecede 50 dakika inkübe edin. Daha sonra, bir mikrolitre dört molar sodyum hidroksit ekleyerek ve üç dakika boyunca 90 santigrat dereceye ısıtarak RNA'yı hidrolize edin. Reaksiyonları buz üzerinde soğutun ve ardından iki mikrolitre iki molar hidroklorik asit ekleyerek nötralize edin.

Şimdi modifiye edilmiş ve kontrol reaksiyonlarını birleştirin ve üç molar sodyum asetat ve 100 milimolar EDTA, 1.5 hacim soğuk etanol ve mililitre başına 10 miligram bir mikrolitre toplam reaksiyon hacminin 0.1 hacmini veya 10'da birini ekleyin. Glikojen. Bu, CDNA'nın çözeltiden çökelmesine neden olur. Çözeltiyi iki saat soğutun, ardından dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüjleyin.

Peleti iki kez soğuk,% 70 etanol yeniden süspansiyon ile yıkayın, peletlenmiş CD NA'yı 40 mikrolitre deiyonize form amid içinde 10 dakika boyunca 65 santigrat dereceye ısıtarak yıkayın, ardından 0.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde sıralama reaksiyonunun hazırlanması için en az 30 dakika kuvvetli girdaplama yapın 40 mikrolitre DDA sonlandırma karışımı. DNA şablonunun beş PICA molü, 4.6 mikrolitre 10 x sease tamponu ve 10 mikrolitre iyi okunmuş D iki etiketli astar. Bu karışıma 4.6 mikrolitre QUIN A ekleyin ve toplam hacmi 82 mikrolitreye çıkarmak için suyla seyreltin.

Bunun yerine DDT ve lycor IR 800 etiketli astar kullanarak aynı şekilde ikinci bir sıralama reaksiyonu hazırlayın. Ardından, verilen USB önerilen koşulları kullanarak PCR amplifikasyonuna geçin. DNA'yı çökeltmek için 16 mikrolitre üç molar sodyum asetat pH 5.2, 16 mikrolitre 100 milimolar EDTA, mililitre başına 10 miligram bir mikrolitre ve 480 mikrolitre% 95 etanol ekleyin, daha sonra 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüjleyin.

Peletlenmiş CD NA'yı 100 mikrolitre deiyonize form amid içinde 10 dakika boyunca 65 santigrat dereceye ısıtarak ve ardından en az 30 dakika kuvvetli girdap yaparak yeniden süspanse edin. Daha sonra, havuzlanmış şekil numunelerinin 40 mikrolitresini 10 mikrolitre havuzlanmış sıralama merdivenleri ile karıştırın ve numunenin toplam hacmini 96 kuyulu numune plakası programına pipetleyin ve kapiler elektroforez cihazını hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre bir çalışma başlatın. Örtüşen dört renk kodlu iz, dört reaksiyon ürünü setinin kılcal damar boyunca aşağıdaki gibi migrasyonu ile üretilir, Mavi iz, NMIA modifiye RNA'ların ters transkripsiyonundan üretilen ters transkripsiyon ürünlerini gösterir.

Yeşil İz, katlanmış ancak başka türlü değiştirilmemiş RNA'lardan ters transkripsiyon ürünlerini gösterir. Siyah İz, D-N-A-D-D-G sıralama merdivenini ve Kırmızı İz, DDT sıralama merdivenini gösterir. Ham kılcal elektroforez izleri, şekil bulucu yazılımı kullanılarak ayrılır, işlenir, hizalanır ve entegre edilir.

Veri analizi, elektroferogramların kılcal elektroforez sisteminden şekil bulucuya aktarılmasıyla başlar. Merkezi veri görünümü penceresi, her veri işleme adımında grafiksel geri bildirim sağlar. Ekranın sol alt kısmında bulunan araç denetçisi penceresi, komut dosyası denetçisinde seçilen araçların parametrelerini gösterir.

Ekranın üst kısmındaki komut dosyası denetçisi, verilere uygulanan araçları görüntüler, floresan arka planı düzeltmek için elektroferogramları ayarlar, floresan arka planı düzeltmek için elektroferogramları ayarlayın, floresan kanallar arasındaki spektral örtüşmeyi, hareketlilik kaymalarını, farklı etiketlenmiş primerlerin verdiği sinyal bozulmasını, ters transkripsiyonun erken sonlandırılmasından ve şekil bulucularda farklı floroforlarla etiketlenmiş yaygın ürünlerin floresan yoğunluğundaki farklılıkları, aracı hizalar ve entegre eder. Kimlikleri tek tek tepe noktalarına otomatik olarak atamak ve bu bilgileri, nükleotid reaktivite profillerini RNA yapısı 5.3 yazılımı tarafından kullanılan ikincil yapı algoritmasına dahil etmek ve veya yakından ilişkili RNA'ların profillerini karşılaştırmak için kullanıcı girişi ve iki sıralama merdiveni tarafından tanımlanan RNA dizisiyle ilişkilendirmek için kurulum işlevini kullanın. Şekil verilerini standart bir şekilde normalleştirin.

Bunu yapmak için, aykırı değerleri sonraki hesaplamalardan hariç tutun. Etkili maksimum reaktiviteyi belirleyin ve tüm reaktivite değerlerini etkili maksimuma bölerek normalleştirin. RNA yapısı yazılımı, şekil analizinden elde edilen sözde serbest enerji kısıtlamalarını kullanarak deneysel olarak desteklenen RNA ikincil yapılarını tahmin etmek için kullanılır.

Yazılım, DRNA yapılarına en düşük enerjinin grafiksel temsillerini ve bu yapıların metinsel temsilini sağlar. Nokta parantez notasyonunda, dizi ve nokta parantez ek açıklaması, burada gösterilen RNA yapısı görüntüleyicisine içe aktarılmalıdır, şekil türetilmiş reaktivite profilleri kullanılarak RNA yapısı 5.3'te oluşturulan HIV rev yanıt elemanı kök döngü iki bölgesinin 2B yapısı ve bir Java hafif uygulaması kullanılarak görselleştirilmiştir. Mavi renkli nükleotidler düşük reaktiviteye sahipken, kırmızı renkli nükleotidler daha yüksek reaktiviteye sahiptir Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa teknik iki gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben RNA ikincil yapısı hakkında nihai sonuçlara varmadan önce ortaya çıkan RNA modelinin dikkatli bir şekilde yorumlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Karmaşık üçüncül etkileşimleri aydınlatmak ve nihayetinde araştırmacıların bu RNA'ların yapılarını üç boyutta belirlemelerine izin vermek için uzay bölünme yöntemleri yoluyla hidroksi radikal sondalamanın kullanılması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.