Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Bu protokolün genel amacı, çözünmeyen ve kristalize olmayan süper moleküler protein düzeneklerinin yapılarını, sihirli açılı dönme katı hal NMR spektroskopisi ile atomik çözünürlükte incelemektir. Biyomoleküler protein düzeneklerinin atomik yapılarının katı hal NMR ile incelenmesi için temel metodolojik adımları sunacağız. Bu düzeneklerin atomik yapılarını incelemek, doğaları gereği çözünmeyen ve kristalize olmayan yapılar oldukları için son derece zordur.

Katı hal NMR, birleştirilmiş nesnenin boyutu veya çözünürlüğü ile sınırlanmadan, moleküler yapıyı ve dinamikleri atomik çözünürlükte inceleyebilen gelişmekte olan bir tekniktir. Burada, izotopik olarak etiketlenmiş örneklerin hazırlanması, katı hal NMR'dan yapısal verilerin toplanması ve analizi dahil olmak üzere, biyomoleküler protein komplekslerinin atomik yapılarının katı hal NMR ile görselleştirilmesindeki temel adımları örneklendiriyoruz. Katı hal NMR iş akışındaki ilk adım, C13 N15 etiketli protein alt birimlerinin üretimi ve bunların in vitro birleştirilmesidir.

Önceden ısıtılmış LB besiyerinden oluşan 15 ml'lik bir ön kültüre, transforme edilmiş E.coli hücrelerinden tek bir koloni ekleyin. 37 °C sıcaklıkta, 200 RPM çalkalama ile gece boyunca inkübe edin. Ana kültürü inoküle etmek için, ön kültürün tamamını, gerekli izotopik olarak işaretlenmiş karbon ve azot kaynaklarını içeren bir litre önceden ısıtılmış N9 besiyerine aktarın.

Bunlar arasında N15 işaretli amonyum klorür, tekdüze C13 işaretli glukoz, seçici C13 işaretli glukoz veya seçici C13 işaretli gliserol yer alabilir. 37 °C'de inkübe edin ve kültür bulanıklaşır bulanıklaşmaz 600 nm'de optik yoğunluğu ölçün. OD değeri 0,8'e ulaştığında, protein ekspresyonunu 0,75 mM IPTG ile dört saat boyunca indükleyin. Optimal indüksiyon koşullarının proteinden proteine göre farklılık gösterebileceğini unutmayın.

Hücreleri 6,000 G'de ve dört derecede 30 dakika boyunca santrifüj ederek geri kazanın. Protein alt birimlerinin saflaştırılmasının ardından, bunlar in vitro olarak birleştirilir. Proteini bir santrifüj filtre ünitesinde yaklaşık bir mini molar derişime kadar konsantre edin.

Bunun için, örneği filtre ünitesine aktarın ve 4,000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj adımları arasında, filtre membranında protein çökelmesini önlemek için filtre ünitesindeki çözeltiyi bir pipet yardımıyla nazikçe karıştırın. İstenen konsantrasyona ulaşılana kadar prosedürü tekrarlayın.

Numuneyi bir falcon tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında, ajitasyon altında bir hafta boyunca inkübe edin. Genellikle, alt birimlerin filamentler halinde polimerizasyonuna çözeltinin bulanıklaşması eşlik eder. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ağırlıkça hacimce %0,02 sodyum azid ekleyin.

Protein kompleksini toplamak için örneği 20, 000 G'de ve dört derecede bir saat boyunca santrifüjleyin. Örneğin kurumasını önlemek için sadece yüzeyi kaplayacak kadar sıvı bırakarak süpernatantın büyük kısmını aspire edin ve örneği ölçüme kadar dört derecede saklayın. Katı hal NMR ile yapısal analiz için gerekli olan temel deneyleri sunacağız.

Bir boyutlu çapraz polarizasyon (CP) ve C13 çekirdeklerinde saptanan inept deneyleri, sırasıyla kompleks içindeki katı ve esnek protein segmentlerini belirlemek için kullanılır. Ayrıca yapısal homojenlik derecesini ve yerel polimorfizmi tahmin etmek amacıyla da kullanılırlar. Burada, standart deneysel değerler kullanılmıştır.

Tipik parametre aralıkları protokolde belirtilmiştir. Rotayı NMR mıknatısına yerleştirin ve protokolde açıklandığı şekilde sihirli açı döndürmesini başlatın. İstenen döndürme frekansını ayarlayın ve artı veya eksi 10 hertz dahilinde stabilizasyon sağlandığından emin olun.

16 tarama kullanarak tek darbeli, tek boyutlu bir proton spektrumu kaydedin. Bir 1D proton karbon CP düzeneği kurun. CP deneyleri, rijit konformasyondaki kalıntılardan kaynaklanan sinyalleri gösterir. Başlangıç deney parametreleri, referans bir bileşik üzerindeki standart bir optimizasyon prosedüründen alınmıştır.

Hassasiyet yeterince yüksek olduğunda, pals kalibrasyonu ve ayrıştırma parametreleri numune üzerinde optimize edilebilir. Burada, 16 tarama ile bir CP kaydediyoruz. CP temas süresi ve güç seviyeleri, burada CP temas süresinin optimizasyonu için gösterildiği üzere, maksimum sinyal şiddetine göre seçilir.

Bu örnekteki maksimum yoğunluğa 800 milisaniyede ulaşılmaktadır. Dekuplaj parametreleri, referans bileşik kalibrasyonu için başlangıçta ayarlanan değerlere göre yeniden düzenlenmelidir. Son olarak, sinyalle örtüşmeyi önlemek için, burada 18 kilohertz olarak gösterilen verilen sihirli açı dönme frekansındaki dönme yan bantlarının konumunu dikkatlice gözlemleyin.

Tek boyutlu spektral parmak izi görevi gören referans bir 1D proton karbon CP spektrumu kaydedin. Burada, 800 milisaniye CP temas süresi, 100 kilohertz dekupaj gücü, üç saniyelik bir geri dönüş gecikmesi ve 20 milisaniyelik bir kazanım süresi ile 128 tarama biriktiriyoruz. CP deneyini apatiyasyon yapmadan işleyin.

Örnek içindeki yapısal düzen ve homojenliğin göstergesi olan C39 değerini tahmin etmek için izole bir pik seçin. Burada, yarım yükseklikteki tam genişlik olarak ölçülen çizgi genişliği yaklaşık 60 ila 70 hertz civarındadır ve bu durum, kompleks içindeki iyi düzenlenmiş bir protein yapısına işaret eder. Protein kompleksinin yüksek mobiliteye sahip kısımlarını incelemek için tek boyutlu bir proton karbon inept deneyi kurun.

Mobil protein segmentleri için bir parmak izi görevi görecek referans bir inept deneyi kaydedin. Tipik parametreler 128 tarama ve 25 milisaniyelik bir kazanım süresidir. Proton karbon inept deneyini işleyin.

Sinyal sayısı ve konumlari, sırasıyla kalıntı hareketliliğinin derecesini ve amino asit kompozisyonunu göstermektedir. Burada, tüm protein montaj yapısında rijit bir rejimde olduğu için yalnızca twist buffer CH2 merit-y'den gelen sinyal gözlemlenmektedir. Protein yapısının konformasyonel analizi, montajdaki tüm rijit kalıntılar için katı hal NMR rezonans atamalarına dayanmaktadır.

Bu durum, kimyasal kaymaların yerel kimyasal ortam için oldukça hassas problar olması ve proteinin ikincil yapısını öngörmek için kullanılabilmesi sayesinde mümkün olmaktadır. Tam bir 3D yapı tayini ise, dokuz angstroma kadar olan hem molekül içi hem de moleküller arası atom yakınlıklarını kodlayan mesafe kısıtlamaları gibi yapısal verilerin toplanmasına dayanır. Burada, temel iki boyutlu deneylerin nasıl kaydedildiğini göstereceğiz ve ardışık bir atama örneği vereceğiz.

Ardından, seçici olarak C13 işaretli numunelerle kaydedilen deneylerden mesafe kısıtlamalarının nasıl toplanacağına dair kısa bir gösterim yapacağız. Kalıntı içi karbon-karbon korelasyonunu tespit etmek için kısa karıştırma süreli iki boyutlu karbon-karbon PDSD deneyi kurun. İlk proton-karbon çapraz polarizasyon adımı için değerleri tek boyutlu CP deneyinden kopyalayın.

Tekdüze C13 etiketli örnekler için karıştırma süresi 50 milisaniyeye ayarlanabilir. Burada, dolaylı ve doğrudan boyutlarda sırasıyla 15 ve 20 milisaniyelik veri toplama süresi seçilmiştir. PDSD spektrumunu işlemek için, 3.5 sinüs-çan kaydırmalı bir QSINE pencere fonksiyonu kullanıyoruz.

Kalıntıya özgü atama yapabilmek için, 100 ila 200 milisaniye arasında bir karıştırma süresine sahip orta süreli karıştırma PDSD kaydetmek amacıyla kısa karıştırma süreli PDSD ayarlarını kullanın. Tam bir rezonans ataması için azot saptama deneyleri dahil ek spektrumların sıklıkla gerekli olduğunu unutmayın; bunlar protokolde detaylandırılmıştır. CCPNMR Analysis gibi bir NMR analiz programı seçin.

2D spektrumları yazılıma yükleyin ve birincil protein dizisiyle bir moleküler nesne oluşturun. Kısa karıştırma süreli PDSD spektrumunda görünen amino asit tiplerinin tanımlanmasıyla başlayın. Spin sistemlerinin karbon atomlarının birbirine bağlanması, kalıntı tipine özgü atamanın yapılmasına olanak tanır.

Burada, bir treonin kalıntısının spin sistemini atıyoruz. C-alfa, C-beta ve C-gamma çekirdekleri arasındaki polarizasyon transferleri, PDSD spektrumunda fiziksel çapraz piklerin oluşmasına yol açar. Bu prosedürle mümkün olduğunca çok kalıntıyı tanımlamaya çalışın.

Hem kısa hem de orta süreli karıştırma zamanı PDSD spektrumlarını üst üste getirin. Orta süreli karıştırma zamanı PDSD'sinde görülen ek pikler genellikle ardışık kalıntılar arasındaki temastan kaynaklanır. Bir spin sisteminin rezonans piklerini işaretleyin ve orta süreli karıştırma zamanı PDSD'sinde diğer spin sistemlerinin rezonans frekanslarıyla olan korelasyonları bulun.

Filamanlı protein kompleksimizde thenium 33'ten isolutane 32'ye ardışık atamayı gösteriyoruz. Thenium spin sisteminin rezonans frekansları, 32'deki isolutların karbon frekansında ve tersi durumda görünür durumdadır. Azot tespitli spektrumlarla atama prosedürleri ve atamalardan protein ikincil yapısının elde edilmesi protokolde açıklanmıştır.

Kapsamlı rezonans atamalarının ardından, uzun menzilli kısıtlamaların belirlenmesine geçebiliriz. Uzun menzilli kısıtlamalar, hem monomerik alt birimlerin tersiyer katlanmasını hem de alt birimlerin kompleks içindeki düzenini tanımlayan, uzak kalıntular arasındaki intramoleküler veya intermoleküler karbon-karbon yakınlıklarıdır. Bu noktada, seçici olarak C13 işaretli örnekler özel bir öneme sahiptir.

Seçici olarak C13 işaretli bir örnekte 400 milisaniye ile bir saniye arasındaki bir karıştırma süresiyle kaydedilmiş uzun karıştırma süreli karbon karbon PDSD ile orta seviye karıştırma süreli bir PDSD'yi üst üste bindirin. Mümkünse, her iki PDSD de aynı seçici işaretli örnek üzerinde kaydedilmiş olmalıdır. Ek pikler, daha uzak C13 atomları arasındaki korelasyonlardan kaynaklanır.

Rezonans ataması sırasında, seçici etiketleme şemasını dikkate alın. Bu durumda, 1-3-gliserol kullanılmıştır. Burada, her iki boyutta da kesin bir atamaya sahip olan uzun menzilli bir temas pikine örnek vurgulanmıştır.

Protein 45 C-alfa ile Thenium 33 C-beta. Uzun menzilli mesafe tanımlaması tamamlandıktan sonra kısıtlamalar, tek anlamlı veya çok anlamlı olmalarının yanı sıra molekül içi veya moleküller arası olarak sınıflandırılır. Yapısal modelleme için hazırlanacak kısıtlama listeleri protokolde belirtilmiştir.

Farklı programlar kullanılarak gerçekleştirilen yapısal modelleme üzerine eğitimlere çevrim içi olarak ulaşılabilir. Katı hal NMR verileri, tek başına veya tamamlayıcı verilerle birlikte, süpermoleküler düzeneklerin atomik düzeyde yapı tayininin yapılmasına olanak tanıyabilir. Katı hal NMR'ın avantajları, bir yandan hem ikincil yapı bilgisi hem de molekül içi arayüzlerden elde edilen atomik mesafe kısıtlamaları sağlayabilmesi ve bunların modelleme sürecine entegre edilebilmesidir.

Öte yandan, katı hal NMR spektroskopisinin benzersiz özelliği, bozulmamış süpermoleküler düzeneklerin moleküller arası arayüzlerinde atomik mesafe kısıtlamaları toplama yeteneğinde yatmaktadır. Bununla birlikte, molekül içi ve moleküller arası kısıtlama atamalarının tespiti ve birbirinden ayırt edilmesi zahmetli bir süreç olabilir ve tipik olarak seçici olarak C13 işaretli örneklerin hazırlanmasını gerektirir. Ancak, seçici işaretleme stratejileri, spektrometre donanım tasarımı ve katı hal NMR metodolojilerindeki yeni gelişmelerle birlikte bu teknik; nesne boyutu, uzun menzilli düzen veya kristalinite sınırlamaları olmaksızın atomik düzeyde moleküler bilgi sağlama yönündeki teorik potansiyelini giderek daha fazla gerçekleştirmektedir.

Bu yöntem, biyomoleküler komplekslerin atomik yapısını incelememize olanak tanır. Yüksek çözünürlüklü veriler elde etmek amacıyla, NMR koşullarını optimize etmek için örneğin dikkatle hazırlanması oldukça önemlidir. Bu protokol ile protein komplekslerine dair bilgi sağlayan atomik çözünürlükler elde edebiliriz.

Ve bu teknik, üç boyutlu modeller elde etmek için yapısal biyolojideki diğer tekniklerle birleştirilebilir.