Name: Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Öğrenin, katı hal NMR spektroskopisi ile çözünmez ve kristalize olmayan süpramoleküler protein meclislerinin atomik yapılarını nasıl inceleyebilirsiniz. Bu yöntem, yapısal biyoloji araştırmalarında yüksek çözünürlüklü analizler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. ve ANR-14-CE09-0020-01 al için) tarafından finanse edilen, "Geleceğe yatırım" programı IDEX Bordeaux/CNRS (B.H. için PEPS 2016) başvuru ANR-10-IDEX-03 / 02 için B.H., Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-al için AJE20140630090), FP7 programı (FP7-insanlar-2013-çiğ al için) ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC başlayan Grant için al, Sözleşme No 639020) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) ve proje " WEAKINTERACT."

Yazarlar ifşa gerek yok.

Solid-State NMR (SSNMR) makromoleküllerin protein derlemeler bir atomik düzeyde karakterize için bir seçim yöntemidir. Genellikle (ikincil içeren düşük çözünürlüklü modellerinden arasında değişen çeşitli duyarlıkla 3D Yapısal modeller oluşturma sağlayan incelenen sistem, spektral kalitesini SSNMR tabanlı yapı belirlenmesi temel konular biridir yapı elemanları ve küçük 3B bilgileri) sözde atom 3D yapılar. Miktar ve kalitesi çok boyutlu SSNMR deneylerden çıkarılan yapısal bilgi derleme bir yüksek çözünürlüklü NMR yapısını hesaplamak için anahtar.
13C -13C ve çeşitli 2D (ve bazen 3D) spectra yüksek sinyal gürültü ile kayıt gerektiren 15N -13C yapısal bağlar tespiti açıklanan protokol kullanır. Orta MAS frekanslarda (&#60; 25 kHz), örnek bırakmak ilâ ~ 50 mg, örnek hidrasyon üzerinde bağımlı protein miktarları için 3.2-4 mm çap boyutları ile rotor içine giriliyor. Rotor içinde örnek miktarı SSNMR spectra içinde sinyal-gürültü oranı, uzun menzilli mesafe kısıtlamaları tespiti ve onların kesin atama için bir belirleyici faktör için doğrudan orantılıdır.
Sıralı rezonans atama ve bağlar koleksiyon sırasında spektral çözünürlük çok önemli bir parametredir. En iyi sonuçları elde etmek için örnek hazırlama parametrelerinin, özellikle alt birim ve montaj koşulları (pH, tampon, sallayarak, sıcaklık, vb) arıtma içinde en iyi duruma getirilmiş gerekir. Örnek optimizasyonu için etiketlenmemiş örnekleri kendisi için birkaç farklı koşulları için derleme gözlenmiştir hazırlamak ve (2.1. adımda açıklanan) bir 1 D 1H -13C CP spektrumda her hazırlanmış örnek kaydetmek için önerilir. Spectra spektral çözünürlüklü ve dağılım optimal koşullar belirlenebilir üzerine dayalı farklı ürünleri arasında karşılaştırmak için hizmet vermektedir.
SSNMR verilerin kalitesini kesinlikle NMR satın alma parametrelerini, özellikle polarizasyon aktarma adımları seçimi bağlıdır. Yüksek manyetik alan güçlü (≥600 MHz 1H frekans) kullanımı yüksek hassasiyet ve spektral çözünürlük, makromoleküllerin protein derlemeler gibi karmaşık hedefleri Yüzleşirken gerekir gereklidir.
Spektrometre birçok durumda kısıtlayıcı bir faktör olduğunu. Bu nedenle, hazırlanacak akıllıca bir seçim örneklerin Spektrometre oturum önce gelmesi. Her durumda, aynı şekilde 13C, 15N etiketli sıralı ve intra kalan rezonans atama gerçekleştirmek için bir önkoşul örneğidir. Solid-state NMR tarafından atanan proteinler için bkz: teknikleri,71. Orta MAS frekanslarda makromoleküllerin derlemeleri yapı tayini seçmeli olarak 13C harfiyle örnekleri gerektirir; uzun menzilli 13C -13C ve 13C -15N tespiti 1,3 üzerinde tabanlı örnekleri kişiler için13C - ve 2 -13C-gylcerol ve/veya 1 -13C - ve 2 -13C-glikoz etiketleme vardır yaygın olarak kullanılan, yukarıda açıklandığı gibi. İki etiketleme düzeni arasında seçim spektral sinyal-gürültü oranı ve çözünürlük dayanmaktadır. Intra - ve cins uzun menzilli kişiler arasında ayrım yapmak için karışık örnekleri etiketli ve seyreltilmiş verimli koymuştur.
Kısacası, bir atom SSNMR yapısal çalışma için kritik adımlar şunlardır: mükemmel örnek miktar ve kalite elde etmek için (i) hazırlanması alt birimleri ve derleme optimize edilmiş olması gerek, (ii) Spektrometre alan gücü ve satın alma parametrelerini olmak zorunda özenle seçilmiş; (iii) seçmeli etiketleme stratejileri bir 3D yapı belirlenmesi için gerekli olan ve veri kalitesi ve tamamlayıcı verilerin kullanılabilirliğini gerekli veri miktarına bağlıdır.
Membran proteinlerinin homomultimeric nano-nesnelere kadar supramolecular sistemleri geniş bir yelpazesi için onun uygulanabilirliği rağmen SSNMR kez mg-miktarları isotopically etiketli malzeme ihtiyacını ile sınırlıdır. Ultra-Hızlı MAS (≥100 kHz) SSNMR 1H tespit NMR avenue aç son teknolojik gelişmeler ve itme en az örnek miktar sınırı için alt-mg 72,73,74. Yine de, detaylı yapısal çalışmaları için 13C harfiyle SSNMR uygulama örnekleri monte vitro veya üzerinde en az orta yerde hücre içi hayatta organizmalarda ifade sistemlerine sınırlar vazgeçilmez olduğu ( 75,76,77,78değerlendirmeleri görmek için) SSNMR ortaya çıkan bir yöntemdir.
Spektral çözünürlüğü yüksek çözünürlüklü 3D yapılar elde etmek için SSNMR uygulama önemli bir faktör olduğunu: derleme içinde içsel konformasyon heterojenite spektral analiz çözünürlük ve spectra sınırlandırmak. Kalıntı belirli 13C etiketleme bazı durumlarda Yapısal modeller (için bir son örnekler bkz: 79,80) elde etmek için stratejik artıkları üzerinde belirli mesafe bilgilerini elde etmek için bir alternatif sağlar.
SSNMR 3D yapı tayini için hala sofistike aletleri, yaklaşım ve sistem birkaç gün ile hafta 600-1000 MHz (1H frekans) üzerinde bağlı olarak sık sık uzun veri toplama günleri ile çeşitli veri toplama gerektirir Spektrometre. Bu nedenle, Spektrometre zamanına erişimi derinlemesine bir SSNMR çalışma içinde kısıtlayıcı bir faktör olabilir.
Homomultimeric protein derlemeler için yeterli kalitede SSNMR veri 3,57,64,70, SSNMR gibi yapısal bağlı çok sayıda tanımlamak için önde gelen söz konusu olduğunda, hala mikroskobik boyutlara erişimi verir. Bu nedenle, bir de novo SSNMR yapı tayini homomultimeric derleme içinde EM veya kütle başına uzunluğu (MPL) veri ideal simetri parametreleri türetmek için SSNMR veri tamamlıyor. SSNMR veri yalnız atomik Intra - ve cins arabirimleri sağlar
SSNMR son derece EM veya MPL ölçümleri gibi yapısal teknikleri ile tamamlayıcı ama verileri de mükemmel x-ışını kristalografisi veya çözüm NMR mutasyona uğramış veya kesilmiş alt birimleri üzerinde elde edilen atomik yapıları ile kombine edilebilir. Çalışmalar giderek artan sayıda nerede farklı yapısal veri birlikte makromoleküllerin derlemeler (temsilcisi örnek için bkz: şekil 6 ) atom 3D modelleri belirlemek için izin verdi edebiyat bulunabilir.
Yapısal Biyoloji alanında, SSNMR eğitim için umut verici tekniği ortaya çıkıyoratomik düzeyde, Yani sağlayan yapısal veri atomik ölçekli, çözünmez ve kristal olmayan derlemeler. Bu bağlamda, SSNMR çözüm NMR ve x-ışını kristalografisi membran proteinlerinin viral zarf, bakteriyel filamentler veya amyloids gibi RNA gibi kendi yerel çevre ve protein meclisleri dahil olmak üzere moleküler derlemeler için kolyesi ve RNA-protein kompleksleri (örneğin bkz:81). Onun çok yönlü uygulamalar vitro ve ikincil, üçüncül ve Kuvaterner yapısal değişiklikleri izleme gibi hücresel bağlamında ortak molekülleri atom ölçeğinde (örneğin 82) ile etkileşim yüzeyler belirlenmesi ve Moleküler dinamiği bağlamında monte kompleksleri, eşleme, SSNMR önemli potansiyel karmaşık biyomoleküler derlemeler gelecekteki yapısal çalışmalarında gösterir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>M9 orta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 MİKRON</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 MİKRON</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin karışımı 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glikoz</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Çok az ifade orta rekombinant protein bileşimi üretim E. coli BL21 hücreleri.

Büyü-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (SSNMR) iplik gelişmeler makromoleküllerin protein derlemeler bir atomik çözünürlükte yapısal karakterizasyonu için verimli bir araç sunar. Bu protein derlemeler birçok biyolojik süreçlerinde önemli rol oynarlar her yerde sistemlerdir. Moleküler yapıları, etkileşimleri ve dinamikleri için gösterildiği gibi SSNMR çalışmaları tarafından erişilebilir viral (capsids1) ve bakteriyel enfeksiyon mekanizmaları (salgı sistemleri2,3, pili4), membran protein kompleksleri5,6,7,8 ve fonksiyonel amyloids 9,10,11. Bu moleküler derleme türünü de nerede proteinler misfolded, amiloid Devletleri'nde birleştirin ve anormal hücre davranış veya hücre ölüm 12,13neden nörodejeneratif hastalıklarda gibi patolojiler sebep olabilir. Protein derlemeler kez büyük supramolecular nesneler liflerinde, filamentler, gözenekleri, tüpler veya nano tanecikleri gibi çeşitli şekiller içine protein alt katları kopyasını simetrik Oligomerizasyonda tarafından inşa edilir. Kuvaterner mimari protein alt uzamsal ve geçici derleme düzenlemek ve sofistike biyolojik fonksiyonlar için izin için arasındaki zayıf etkileşimler tarafından tanımlanır. Bu derlemeler atomik bir ölçekte, yapısal araştırmalar yüksek çözünürlüklü teknikleri için bir meydan okuma kendi içsel insolubility beri vardır ve çok sık olmayan kendi crystallinity geleneksel x-ışını kristalografisi veya çözüm NMR kullanımını sınırlar yaklaşıyor. Büyü-açı (MAS) SSNMR iplik çözünmez makromoleküllerin derlemeler üzerinde atomik çözünürlük verileri elde etmek için ortaya çıkan bir tekniği ve giderek artan sayıda dahil olmak üzere karmaşık biyomoleküler sistemleri için 3D atom modelleri gidermek için verimlilik kanıtlamıştır Bakteriyel filamentler, amiloid derlemeler ve viral parçacıkların 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Yüksek manyetik alanlar, metodolojik gelişmeler ve numune hazırlama teknik gelişmeler onların biyolojik ilgili başta olmak üzere çeşitli ortamlarda çözünmez proteinler makromoleküllerin araştırmak için sağlam bir yönteme MAS SSNMR kurmuştur devlet veya hücresel membranlarda, bu teknik son derece cryo-elektron mikroskobu tamamlayıcı yapım toplandı. Çoğu durumda, bu tür protein derlemeler çok yüksek bir simetri belirtir. MAS SSNMR yararlanan bu özellik, tüm protein alt homomolecular derlemesi içinde aynı yerel yapıya olurdu gibi ve bu nedenle büyük ölçüde analizi karmaşıklığını azaltarak hemen hemen aynı SSNMR imza,.
Makromoleküllerin protein meclisleri tarafından orta MAS yapısal çalışmaları için verimli bir iletişim kuralı (&#60; 25 kHz) SSNMR Bu videoda sunulur ve içine farklı adımlar (şekil 1) bölünmüştür. Biz iş akışı örneği için her protein farklı bir ipliksi protein derleme ( şekil 1' deki vurgulanır bkz: adım), protein alt birimi arıtma dışında bir SSNMR yapısal çalışmanın kritik aşamalarında gösterecektir derleme ama kritik öneme sahip yapısal Etütler ve SSNMR spektroskopisi ve yapısı hesaplama ne özel öğreticiler için teknik/metodolojik ayrıntılarını girmeden olmadan online olarak mevcuttur. Mevcut iletişim kuralı öncelikle MAS koşullar altında gerçekleştirilen solid-state NMR deneyler ele alınacak iken, biyolojik ortamlar 23,24,25,26 kullanımını hizalı , 27, hizalanmış bicelles gibi protein uyum ve dinamik protein-protein etkileşim MAS teknoloji olmadan membran benzeri ortamda incelenmesi için izin verir. Biz çok önemli SSNMR spectra ve onların analizi ve yorumu kayıt yanı sıra protein ifade ve derleme adımları gösterir. Amacımız SSNMR tekniklerle makromoleküllerin derleme bir atomik çözünürlüklü yapısal çalışma gerçekleştirmek için okuyucu etkinleştirme yapısal analiz boru hattı anlayışlar sağlamaktır.
İletişim kuralı 3 bölümleri kapsar:
1. solid-state NMR örnek üretim
Bir solid-state NMR analizi için bir ön koşul, protein bileşenleri ifade edilecek makromoleküllerin derleme gereksiniminin, izotop etiketli, saflaştırılmış ve monte vitro yerli gibi karmaşık duruma (için bir örnek bkz: Şekil 2) . Yüksek NMR hassasiyet sağlamak için izotop zenginleştirme 13C ve 15N etiketleme 13C ve düzgün 13 gibi 15N kaynakları ile takıma en az bakteriyel ifade medya aracılığıyla gereklidir C harfiyle glikoz/gliserol ve 15NH4Cl anılan sıraya göre. İletişim kuralı daha sonraki aşamada, 13C harfiyle örnekleri seçerek C harfiyle kaynakları gibi seçmeli olarak 13ile üretilen (1,3 -13C)- ve (2 -13C)-gliserol (veya (1 -13C)- ve (2 -13C)- glikoz) NMR analizi kolaylaştırmak için kullanılır. Karışık etiketli örnek ekimolar karışımı %50 15N - ve C harfiyle veya %50 %50 13için karşılık gelen (1,3 -13C)- ve % 50 (2 -13C)-glikoz cins tespiti açıklamak için sunulmaktadır etkileşimler. Protein saflık yanı sıra derleme adımı sırasında sıkı koşullar büyük ölçüde son örnek homojen bir yapı sırasını sigortalamak için anahtar faktörler vardır.
2. ön yapısal karakterizasyon tek boyutlu (1 D) solid-state NMR üzerinde dayalı
Biz SSNMR göre yapısal analiz için gerekli deneyleri mevcut. Tek boyutlu (1D) çapraz-polarizasyon (CP) ve INEPT / RINEPT28 deneyler, 13C çekirdeği üzerinde tespit katı ve esnek protein parçaları derlemede, sırasıyla algılamak ve yapısal derecesini tahmin etmek için kullanılır homojenliği ve yerel polimorfizmi (için bir örnek bkz. şekil 3).
<st></st>Rong > 3. Konformasyon analizi ve 3D belirlenmesi yapısı
Alt bölüm 1 ve 2 olarak kimyasal vardiya yerel çevre için çok hassas probları ve phi/psişik tahmin etmek için kullanılan tüm katı artıkları protein derleme SSNMR rezonans göreve dayalı konformasyon analizi, endişe dihedral açılar ve böylece ikincil yapı belirlemek. Şekil 4 katı çekirdek bir sıralı rezonans atama bir protein derleme. örneği gösterilmiştir Kodlama mesafe kısıtlamaları proximities kapatmak gibi 3D yapı belirlenmesi yapısal veri toplama dayanarak (&#60; 7-9 Å), içi - hem cins bilgi içeren. Alt bölüm 3 ve 4 uzun menzilli uzak tutma toplama ve yorumlama açıklar. Uzun menzilli kişiler doğan kalıntı ben j için ile intramolecular 13C -13C proximities olarak tanımlanır | i-j | ≥4, böylece Tersiyer protein kat bir monomeric alt birimi veya cins 13C -13C proximities olarak tanımlama, protein alt montaj arasında cins arabirimler tanımlama. Intra - ve cins arabirimleri şekil 5' te gösterilmiştir. SSNMR bağlar tespit 13-C -13C ve 15N -13C recoupling deneyler genellikle kodlamak için internuclear mesafeler &#60; 1 nm. Alt bölüm 4 cins mesafe kısıtlamaları tespiti açıklar. Simetrik protein meclisleri, homojen etiketli örnekleri (Yani düzgün veya seçmeli olarak etiketli % 100) kullanımı cins alt birim-alt birim etkileşimleri tanımlayan sınırlı olduğu için her iki Intra - ve arası - molecular olarak kişiler neden algılanabilir sinyalleri. Cins proximities kesin tespiti toplama önce kombine iki farklı etiketli örnek ekimolar bir karışımı içeren karma etiketli örnekleri kullanılarak elde edilir. Alt 5 yapı modelleme kısaca tanıtır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Resim 1 : İş akışı solid-state NMR tarafından bir atomik çözünürlüklü yapısal çalışmanın. 13 C, 15N izotop etiketli protein üretim, alt birim arıtma, alt birim derleme, derleme oluşumu, SSNMR deneyleri, SSNMR deney analizi ve mesafe kısıtlamaları çıkarımı kontrol ve yapı modelleme gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td><güçlü>Aletler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR Spektrometre (> 11.7 Tesla)</td><td>Bruker-üçlü</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rezonans MAS SSNMR prob başı&nbsp;</td><td>Bruker-SSNMR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rotorları 4mm</td><td>Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5804 R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300 spektrometre</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 KULUÇKA MAKINESI HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 tezgah üstü orbital çalkalayıcı</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>Tüp Tabanca Karıştırıcı</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser elektroporatör</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mini-PROTEAN tetra hücre sistemi</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA saf sistem</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>kılcal mikro adam M25 pipet</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Katalog Numarası<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>kılcal damarlar ve pistonlar</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F148112</tr><tr><td>spatula</td><td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İsim</güçlü></td><td><güçlü>Şirket</güçlü></td><td>güçlü><Katalog Numarası<güçlü></td>güçlü<td>><Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td><güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz 13<>C<alt>6</alt></td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum-15N-klorür</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C 2 gliserol</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C gliserol</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Demir Klorür</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Çinko klorür</td><td>Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Çözeltisi (100 kez;)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trisin</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>sodyum azid</td><td>sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>4,4-dimetil-4-silapentan-1-sülfonik asit ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>strong<>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta sistemleri</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>Spektrometre Sistemleri</td></tr></tbody></table>

atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein derlemeler biyolojik süreçlerin ana bilgisayar-patojen etkileşim, nörodejeneratif hastalıkların yayılması için viral enfeksiyon arasında değişen temel rol oynar. Bu tür derlemeleri çeşitli hücresel işlevler yürütmek veya zararlı sonuçlara neden büyük makromoleküllerin nesneleri oluşturmak için kovalent olmayan şekilde organize birden fazla protein alt oluşur. Atomik yorumlara derleme mekanizmaları ve makromoleküllerin bu derlemelerinin çalıştığını kez onların doğasında insolubility beri kıt kalır ve sigara crystallinity kez büyük ölçüde çoğu teknikleri elde edilen verilerin kalitesini azaltır x-ışını kristalografisi ve çözüm Nükleer manyetik rezonans (NMR) gibi Yapısal Biyoloji kullanılır. Burada atomik çözünürlükte makromoleküllerin derlemeler yapılarının araştırmak için güçlü bir yöntem olarak magic-açı iplik solid-state NMR spektroskopisi (SSNMR) mevcut. SSNMR boyut ve çözünürlük sınırlamalar olmadan montajı karmaşık atomik detayları ortaya çıkarabilir. Burada sunulan protokolü 13C üretiminden önemli adımları açıklar /15N makromoleküllerin protein izotop etiketli derlemeler standart SSNMR spectra ve onların analizi ve yorumu edinimi için. Örnek olarak, boru hattının SSNMR yapısal çözümleme ipliksi protein derleme gösteriyoruz.

Normal SSNMR iş akışı şekil 1' de gösterildiği birkaç adım içerir. Genellikle protein alt E. coli vitro Contegra ifade tarafından üretilen, saf ve sallayarak altında ama bazen de statik koşullarda toplandı. İfade ve arıtma bir protein alt birimi SDS jel Kromatografi (şekil 2A) tarafından takip edilmektedir. Makromoleküllerin derlemeler oluşumu sonra elektron mikroskobu (EM) analiz tarafından teyit edilmesi (ipliksi derleme bir örneği için bkz: şekil 2B ).
Sonra SSNMR rotor protein derlemesini getirilmesi, rotor Spektrometre eklenir, MAS frekans ve sıcaklık düzenlenmektedir ve spectra kaydedilir. İlk anlayışlar 1 D SSNMR teknikleri ile elde edilebilir. Şekil 3 gösterir bir yapısal olarak homojen protein örneği, katı çekirdek bir protein alt birimi mevcut13C rezonanslar açığa bir 1H13C CP spektrumlu, 13C kanalında tespit tipik bir SSNMR FID derleme ve mobil artıkları temsil eden bir 2D 1H -13C BECERİKSİZ spektrum. Derleme yapı katı çekirdek atom anlayışlar için çok boyutlu SSNMR deneyler üzerinde kaydedilmek üzere düzgün ve seçmeli olarak ilk SSNMR rezonanslar atamak ve uzun menzilli proximities (bkz: şekil 4 algılamak için örnekleri etiketli gerekir ).
Tüm spectra işlenir ve SSNMR rezonanslar atamak ve içi ve cins mesafe kısıtlamaları (şekil 5) ayıklamak için yeterli yazılım ile analiz. SSNMR mesafe kısıtlamaları da tek başına kullanılan veya tamamlayıcı teknikleri verileri ile birlikte, hangi modelleme programa entegre edilebilir.
Atomik yapıları SSNMR teknikleri tarafından çözüldü makromoleküllerin derlemeler için şekil 6 bakteriyel ekleri ve amiloid liflerinde birkaç ipliksi derlemelerden göstermektedir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Şekil 6:ipliksi makromoleküllerin yapılarının bir solid-state NMR yaklaşım tarafından belirlenir: bakteriyel filamentler ve amiloid protein liflerinde. A) tip 1 pilus, uropathogenic E. coli, PDB kod 2N7H 4; B) ASC filament, PDB kod 2N1F 63; C) Tip III salgı sistemi iğneler, PDB kodları 2MME, 2LPZ ve 2MEX 2,3,64; D) Amiloid beta AB42 liflerinde, PDB kodu 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 ve Osaka mutant PDB kod 2MVX 57, Iowa mutant PDB kod 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein liflerinde, PDB kod 2N0A 68; F) HET-s deli dana etki alanı, PDB kodu 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Bu protokolün genel amacı, çözünmeyen ve kristalize olmayan süper moleküler protein düzeneklerinin yapılarını, sihirli açılı dönme katı hal NMR spektroskopisi ile atomik çözünürlükte incelemektir. Biyomoleküler protein düzeneklerinin atomik yapılarının katı hal NMR ile incelenmesi için temel metodolojik adımları sunacağız. Bu düzeneklerin atomik yapılarını incelemek, doğaları gereği çözünmeyen ve kristalize olmayan yapılar oldukları için son derece zordur.Katı hal NMR, birleştirilmiş nesnenin boyutu veya çözünürlüğü ile sınırlanmadan, moleküler yapıyı ve dinamikleri atomik çözünürlükte inceleyebilen gelişmekte olan bir tekniktir. Burada, izotopik olarak etiketlenmiş örneklerin hazırlanması, katı hal NMR'dan yapısal verilerin toplanması ve analizi dahil olmak üzere, biyomoleküler protein komplekslerinin atomik yapılarının katı hal NMR ile görselleştirilmesindeki temel adımları örneklendiriyoruz. Katı hal NMR iş akışındaki ilk adım, C13 N15 etiketli protein alt birimlerinin üretimi ve bunların in vitro birleştirilmesidir.Önceden ısıtılmış LB besiyerinden oluşan 15 ml'lik bir ön kültüre, transforme edilmiş E.coli hücrelerinden tek bir koloni ekleyin. 37 °C sıcaklıkta, 200 RPM çalkalama ile gece boyunca inkübe edin. Ana kültürü inoküle etmek için, ön kültürün tamamını, gerekli izotopik olarak işaretlenmiş karbon ve azot kaynaklarını içeren bir litre önceden ısıtılmış N9 besiyerine aktarın.Bunlar arasında N15 işaretli amonyum klorür, tekdüze C13 işaretli glukoz, seçici C13 işaretli glukoz veya seçici C13 işaretli gliserol yer alabilir. 37 °C'de inkübe edin ve kültür bulanıklaşır bulanıklaşmaz 600 nm'de optik yoğunluğu ölçün. OD değeri 0,8'e ulaştığında, protein ekspresyonunu 0,75 mM IPTG ile dört saat boyunca indükleyin. Optimal indüksiyon koşullarının proteinden proteine göre farklılık gösterebileceğini unutmayın.Hücreleri 6,000 G'de ve dört derecede 30 dakika boyunca santrifüj ederek geri kazanın. Protein alt birimlerinin saflaştırılmasının ardından, bunlar in vitro olarak birleştirilir. Proteini bir santrifüj filtre ünitesinde yaklaşık bir mini molar derişime kadar konsantre edin.Bunun için, örneği filtre ünitesine aktarın ve 4,000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj adımları arasında, filtre membranında protein çökelmesini önlemek için filtre ünitesindeki çözeltiyi bir pipet yardımıyla nazikçe karıştırın. İstenen konsantrasyona ulaşılana kadar prosedürü tekrarlayın.Numuneyi bir falcon tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında, ajitasyon altında bir hafta boyunca inkübe edin. Genellikle, alt birimlerin filamentler halinde polimerizasyonuna çözeltinin bulanıklaşması eşlik eder. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ağırlıkça hacimce %0,02 sodyum azid ekleyin.Protein kompleksini toplamak için örneği 20, 000 G'de ve dört derecede bir saat boyunca santrifüjleyin. Örneğin kurumasını önlemek için sadece yüzeyi kaplayacak kadar sıvı bırakarak süpernatantın büyük kısmını aspire edin ve örneği ölçüme kadar dört derecede saklayın. Katı hal NMR ile yapısal analiz için gerekli olan temel deneyleri sunacağız.Bir boyutlu çapraz polarizasyon (CP) ve C13 çekirdeklerinde saptanan inept deneyleri, sırasıyla kompleks içindeki katı ve esnek protein segmentlerini belirlemek için kullanılır. Ayrıca yapısal homojenlik derecesini ve yerel polimorfizmi tahmin etmek amacıyla da kullanılırlar. Burada, standart deneysel değerler kullanılmıştır.Tipik parametre aralıkları protokolde belirtilmiştir. Rotayı NMR mıknatısına yerleştirin ve protokolde açıklandığı şekilde sihirli açı döndürmesini başlatın. İstenen döndürme frekansını ayarlayın ve artı veya eksi 10 hertz dahilinde stabilizasyon sağlandığından emin olun.16 tarama kullanarak tek darbeli, tek boyutlu bir proton spektrumu kaydedin. Bir 1D proton karbon CP düzeneği kurun. CP deneyleri, rijit konformasyondaki kalıntılardan kaynaklanan sinyalleri gösterir. Başlangıç deney parametreleri, referans bir bileşik üzerindeki standart bir optimizasyon prosedüründen alınmıştır.Hassasiyet yeterince yüksek olduğunda, pals kalibrasyonu ve ayrıştırma parametreleri numune üzerinde optimize edilebilir. Burada, 16 tarama ile bir CP kaydediyoruz. CP temas süresi ve güç seviyeleri, burada CP temas süresinin optimizasyonu için gösterildiği üzere, maksimum sinyal şiddetine göre seçilir.Bu örnekteki maksimum yoğunluğa 800 milisaniyede ulaşılmaktadır. Dekuplaj parametreleri, referans bileşik kalibrasyonu için başlangıçta ayarlanan değerlere göre yeniden düzenlenmelidir. Son olarak, sinyalle örtüşmeyi önlemek için, burada 18 kilohertz olarak gösterilen verilen sihirli açı dönme frekansındaki dönme yan bantlarının konumunu dikkatlice gözlemleyin.Tek boyutlu spektral parmak izi görevi gören referans bir 1D proton karbon CP spektrumu kaydedin. Burada, 800 milisaniye CP temas süresi, 100 kilohertz dekupaj gücü, üç saniyelik bir geri dönüş gecikmesi ve 20 milisaniyelik bir kazanım süresi ile 128 tarama biriktiriyoruz. CP deneyini apatiyasyon yapmadan işleyin.Örnek içindeki yapısal düzen ve homojenliğin göstergesi olan C39 değerini tahmin etmek için izole bir pik seçin. Burada, yarım yükseklikteki tam genişlik olarak ölçülen çizgi genişliği yaklaşık 60 ila 70 hertz civarındadır ve bu durum, kompleks içindeki iyi düzenlenmiş bir protein yapısına işaret eder. Protein kompleksinin yüksek mobiliteye sahip kısımlarını incelemek için tek boyutlu bir proton karbon inept deneyi kurun.Mobil protein segmentleri için bir parmak izi görevi görecek referans bir inept deneyi kaydedin. Tipik parametreler 128 tarama ve 25 milisaniyelik bir kazanım süresidir. Proton karbon inept deneyini işleyin.Sinyal sayısı ve konumlari, sırasıyla kalıntı hareketliliğinin derecesini ve amino asit kompozisyonunu göstermektedir. Burada, tüm protein montaj yapısında rijit bir rejimde olduğu için yalnızca twist buffer CH2 merit-y'den gelen sinyal gözlemlenmektedir. Protein yapısının konformasyonel analizi, montajdaki tüm rijit kalıntılar için katı hal NMR rezonans atamalarına dayanmaktadır.Bu durum, kimyasal kaymaların yerel kimyasal ortam için oldukça hassas problar olması ve proteinin ikincil yapısını öngörmek için kullanılabilmesi sayesinde mümkün olmaktadır. Tam bir 3D yapı tayini ise, dokuz angstroma kadar olan hem molekül içi hem de moleküller arası atom yakınlıklarını kodlayan mesafe kısıtlamaları gibi yapısal verilerin toplanmasına dayanır. Burada, temel iki boyutlu deneylerin nasıl kaydedildiğini göstereceğiz ve ardışık bir atama örneği vereceğiz.Ardından, seçici olarak C13 işaretli numunelerle kaydedilen deneylerden mesafe kısıtlamalarının nasıl toplanacağına dair kısa bir gösterim yapacağız. Kalıntı içi karbon-karbon korelasyonunu tespit etmek için kısa karıştırma süreli iki boyutlu karbon-karbon PDSD deneyi kurun. İlk proton-karbon çapraz polarizasyon adımı için değerleri tek boyutlu CP deneyinden kopyalayın.Tekdüze C13 etiketli örnekler için karıştırma süresi 50 milisaniyeye ayarlanabilir. Burada, dolaylı ve doğrudan boyutlarda sırasıyla 15 ve 20 milisaniyelik veri toplama süresi seçilmiştir. PDSD spektrumunu işlemek için, 3.5 sinüs-çan kaydırmalı bir QSINE pencere fonksiyonu kullanıyoruz.Kalıntıya özgü atama yapabilmek için, 100 ila 200 milisaniye arasında bir karıştırma süresine sahip orta süreli karıştırma PDSD kaydetmek amacıyla kısa karıştırma süreli PDSD ayarlarını kullanın. Tam bir rezonans ataması için azot saptama deneyleri dahil ek spektrumların sıklıkla gerekli olduğunu unutmayın; bunlar protokolde detaylandırılmıştır. CCPNMR Analysis gibi bir NMR analiz programı seçin.2D spektrumları yazılıma yükleyin ve birincil protein dizisiyle bir moleküler nesne oluşturun. Kısa karıştırma süreli PDSD spektrumunda görünen amino asit tiplerinin tanımlanmasıyla başlayın. Spin sistemlerinin karbon atomlarının birbirine bağlanması, kalıntı tipine özgü atamanın yapılmasına olanak tanır.Burada, bir treonin kalıntısının spin sistemini atıyoruz. C-alfa, C-beta ve C-gamma çekirdekleri arasındaki polarizasyon transferleri, PDSD spektrumunda fiziksel çapraz piklerin oluşmasına yol açar. Bu prosedürle mümkün olduğunca çok kalıntıyı tanımlamaya çalışın.Hem kısa hem de orta süreli karıştırma zamanı PDSD spektrumlarını üst üste getirin. Orta süreli karıştırma zamanı PDSD'sinde görülen ek pikler genellikle ardışık kalıntılar arasındaki temastan kaynaklanır. Bir spin sisteminin rezonans piklerini işaretleyin ve orta süreli karıştırma zamanı PDSD'sinde diğer spin sistemlerinin rezonans frekanslarıyla olan korelasyonları bulun.Filamanlı protein kompleksimizde thenium 33'ten isolutane 32'ye ardışık atamayı gösteriyoruz. Thenium spin sisteminin rezonans frekansları, 32'deki isolutların karbon frekansında ve tersi durumda görünür durumdadır. Azot tespitli spektrumlarla atama prosedürleri ve atamalardan protein ikincil yapısının elde edilmesi protokolde açıklanmıştır.Kapsamlı rezonans atamalarının ardından, uzun menzilli kısıtlamaların belirlenmesine geçebiliriz. Uzun menzilli kısıtlamalar, hem monomerik alt birimlerin tersiyer katlanmasını hem de alt birimlerin kompleks içindeki düzenini tanımlayan, uzak kalıntular arasındaki intramoleküler veya intermoleküler karbon-karbon yakınlıklarıdır. Bu noktada, seçici olarak C13 işaretli örnekler özel bir öneme sahiptir.Seçici olarak C13 işaretli bir örnekte 400 milisaniye ile bir saniye arasındaki bir karıştırma süresiyle kaydedilmiş uzun karıştırma süreli karbon karbon PDSD ile orta seviye karıştırma süreli bir PDSD'yi üst üste bindirin. Mümkünse, her iki PDSD de aynı seçici işaretli örnek üzerinde kaydedilmiş olmalıdır. Ek pikler, daha uzak C13 atomları arasındaki korelasyonlardan kaynaklanır.Rezonans ataması sırasında, seçici etiketleme şemasını dikkate alın. Bu durumda, 1-3-gliserol kullanılmıştır. Burada, her iki boyutta da kesin bir atamaya sahip olan uzun menzilli bir temas pikine örnek vurgulanmıştır.Protein 45 C-alfa ile Thenium 33 C-beta. Uzun menzilli mesafe tanımlaması tamamlandıktan sonra kısıtlamalar, tek anlamlı veya çok anlamlı olmalarının yanı sıra molekül içi veya moleküller arası olarak sınıflandırılır. Yapısal modelleme için hazırlanacak kısıtlama listeleri protokolde belirtilmiştir.Farklı programlar kullanılarak gerçekleştirilen yapısal modelleme üzerine eğitimlere çevrim içi olarak ulaşılabilir. Katı hal NMR verileri, tek başına veya tamamlayıcı verilerle birlikte, süpermoleküler düzeneklerin atomik düzeyde yapı tayininin yapılmasına olanak tanıyabilir. Katı hal NMR'ın avantajları, bir yandan hem ikincil yapı bilgisi hem de molekül içi arayüzlerden elde edilen atomik mesafe kısıtlamaları sağlayabilmesi ve bunların modelleme sürecine entegre edilebilmesidir.Öte yandan, katı hal NMR spektroskopisinin benzersiz özelliği, bozulmamış süpermoleküler düzeneklerin moleküller arası arayüzlerinde atomik mesafe kısıtlamaları toplama yeteneğinde yatmaktadır. Bununla birlikte, molekül içi ve moleküller arası kısıtlama atamalarının tespiti ve birbirinden ayırt edilmesi zahmetli bir süreç olabilir ve tipik olarak seçici olarak C13 işaretli örneklerin hazırlanmasını gerektirir. Ancak, seçici işaretleme stratejileri, spektrometre donanım tasarımı ve katı hal NMR metodolojilerindeki yeni gelişmelerle birlikte bu teknik; nesne boyutu, uzun menzilli düzen veya kristalinite sınırlamaları olmaksızın atomik düzeyde moleküler bilgi sağlama yönündeki teorik potansiyelini giderek daha fazla gerçekleştirmektedir.Bu yöntem, biyomoleküler komplekslerin atomik yapısını incelememize olanak tanır. Yüksek çözünürlüklü veriler elde etmek amacıyla, NMR koşullarını optimize etmek için örneğin dikkatle hazırlanması oldukça önemlidir. Bu protokol ile protein komplekslerine dair bilgi sağlayan atomik çözünürlükler elde edebiliriz.Ve bu teknik, üç boyutlu modeller elde etmek için yapısal biyolojideki diğer tekniklerle birleştirilebilir.

atomic-scale-structural-studies-macromolecular-assemblies-solid-state

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, 15N etiketli vahşi tip ve mutant envoplakin proteini ile etiketlenmemiş vimentin proteini arasındaki protein-protein etkileşimlerini incelemek için nükleer manyetik rezonans spektroskopisi tekniğini açıklar. Yabani tip envoplakin ve vimentin arasındaki başarılı etkileşim, NMR spektrumlarında geniş çizgi genişlemesine ve tepe kaybolmasına yol açarken, mutasyona uğramış envoplakin ve vimentin arasında bir etkileşimin olmaması, NMR spektrumlarında iyi çözülmüş zirvelere neden olur.

Atomik Düzeyde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Nükleer Manyetik Rezonans

Cu (I) içeren bir metalokoperon model peptidin NMR çözelti yapısı belirlendi ve numune hazırlama ve 1D ve 2D veri toplamadan üç boyutlu bir yapıya kadar ayrıntılı bir protokol açıklandı.

Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak

Burada, ex situ ve in situ incelemeler metalik bardaklarda yapısal dönüşümleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Hyperfine etkileşimleri denetlemek nükleer tabanlı analitik yöntemleri çalıştırmaya başladık. Biz Mössbauer spektrometresi uygulanabilirliği ve sinkrotron radyasyon nükleer ileri saçılma sıcaklık uygulamalı deneyler sırasında göstermek.

Ex Situ ve yapısal dönüşümleri in Situ soruşturma yöntemleri: Metalik gözlük kristalleşme olgusu

Burada, nasıl küçük açı X-Ray saçılma (SAXS) düşük çözünürlüklü zarflar makromoleküllerin yapıları temsil eden hakkında bilgi edinmek için kullanılması gereken mevcut. X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikleri ile birlikte kullanıldığında, SAXS detaylı yorumlara çok etki alanlı proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri çözüm sağlayabilir.

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Katıların, sıvıların, gazların ve karışımların moleküler yapıları ve dinamikleri çeşitli bilimsel alanlar için kritik öneme sahiptir. Yüksek sıcaklık, yüksek basınçlı yerinde MAS NMR, sıkı kontrol edilen kimyasal ortamlarda karışık fazlı sistemlerde bileşenlerin kimyasal ortamının tespitini sağlar.

Yüksek Sıcaklık ve Yüksek Basınç Yerinde Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, yapısal protein dinamiklerini kalıntıya özgü bir şekilde karakterize edebilir. NMR 15N R1 ve R2 gevşeme ve {1H}-15N heteronükleer Overhauser etkisi (hetNOE) deneylerini kaydetmek için pikosaniye ila nanosaniye zaman ölçeğine duyarlı uygulamalı bir protokol sunuyoruz.

NMR 15N Proteinlerin Pikosaniye ve Nanosaniye Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Gevşeme Deneyleri

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Öğrenin, katı hal NMR spektroskopisi ile çözünmez ve kristalize olmayan süpramoleküler protein meclislerinin atomik yapılarını nasıl inceleyebilirsiniz. Bu yöntem, yapısal biyoloji araştırmalarında yüksek çözünürlüklü analizler sağlar.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Daha fazla video keşfet