Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Bu protokolün genel amacı, çözünmeyen ve kristal olmayan süper moleküler protein düzeneklerinin yapılarını sihirli açılı dönen katı hal NMR spektroskopisi ile atomik çözünürlükte incelemektir. Katı hal NMR ile biyomoleküler protein düzeneklerinin atomik yapılarını incelemek için temel metodolojik adımları sunacağız. Bu düzeneklerin atomik yapılarını incelemek son derece zordur çünkü doğal olarak çözünmezler ve kristal değildirler.

Katı hal NMR, monte edilmiş nesnenin boyutu veya çözünürlüğü ile sınırlı olmaksızın atomik çözünürlükte moleküler yapı ve dinamikleri inceleyebilen yeni bir tekniktir. Burada, izotopik olarak etiketlenmiş numunelerin hazırlanması, katı hal NMR'den yapısal verilerin toplanması ve analizi dahil olmak üzere, satılan durum NMR'ye göre biyomoleküler protein düzeneklerinin atomik yapılarını görselleştirmek için temel adımları gösteriyoruz. Katı hal NMR iş akışındaki ilk adım, C13 N15 etiketli protein alt birimlerinin üretimi ve bunların in vitro montajıdır.

Önceden ısıtılmış LB ortamının 15 mil ön kültürünü bir dönüştürülmüş E.coli hücresi kolonisi ile aşılayın. Gece boyunca 200 RPM çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Ana kültürü aşılamak için, tüm ön kültürü, gerekli izotopik olarak etiketlenmiş karbon ve nitrojen kaynaklarını içeren bir litre önceden ısıtılmış N9 ortamına aktarın.

Bunlar, N15 etiketli amonyum klorür, düzgün C13 etiketli glikoz, seçici olarak C13 etiketli glikoz veya seçici olarak C13 etiketli gliserol İnkübatını 37 derecede içerebilir ve kültür bulanıklaşır bulanıklaşmaz 600 nanometrede optik yoğunluğu ölçebilir. OD 0.8 değerine ulaştığında, dört saat boyunca 0.75 mini molar IPTG ile protein ekspresyonunu indükleyin. Optimal indüksiyon koşullarının bir proteinden diğerine değişebileceğini unutmayın.

Hücreleri 6.000 G ve dört derecede 30 dakika santrifüjleyerek geri kazanın. Protein alt birimlerinin saflaştırılmasından sonra, in vitro olarak birleştirilirler. Proteini bir santrifüj filtre ünitesinde yaklaşık bir mini azı dişine konsantre edin.

Bunu yapmak için, numuneyi filtre ünitesine yerleştirin ve 30 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme adımları arasında, filtre membranında protein birikmesini önlemek için filtre ünitesindeki çözeltiyi bir pipetle nazikçe karıştırın. İstenilen konsantrasyona ulaşılana kadar işlemi tekrarlayın.

Numuneyi bir şahin tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında bir hafta boyunca çalkalama altında inkübe edin. Genellikle, alt birimlerin filamentler halinde polimerizasyonuna, çözeltinin bulanık hale gelmesi eşlik eder. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için hacim başına% 0.02 ağırlık sodyum azid ekleyin.

Protein düzeneğini hasat etmek için, numuneyi 20.000 G ve dört derecede bir saat santrifüjleyin. Süpernatantın çoğunu aspire edin, numunenin kurumasını önlemek için yüzeyi kaplayacak kadar sıvı bırakın ve numuneyi ölçüme kadar dört derecede saklayın. Katı hal NMR ile yapısal bir analiz için gerekli deneyleri sunacağız.

C13 çekirdekleri üzerinde tespit edilen tek boyutlu çapraz polarizasyon veya CP ve beceriksiz deneyler, montajdaki katı ve esnek protein segmentlerini tespit etmek için kullanılır. Ve yapısal homojenlik ve yerel polimorfizmin derecesini tahmin etmek. Burada standart deneysel değerler kullanıyoruz.

Tipik parametre aralıkları protokolde belirtilmiştir. Rotayı NMR mıknatısına yerleştirin ve protokolde açıklandığı gibi sihirli açı döndürmeye başlayın. İstenen eğirme frekansını ayarlayın ve artı veya eksi 10 hertz içinde stabilizasyonu sağlayın.

16 tarama kullanarak tek darbeli, tek boyutlu proton spektrumunu kaydedin. Bir 1D proton karbon CP ayarlayın. CP deneyleri, rijit bir konformasyondaki kalıntılardan ortaya çıkan sinyalleri gösterir. İlk deney parametreleri, bir referans bileşik üzerinde standart bir optimizasyon prosedüründen alınır.

Darbe kalibrasyonu ve ayırma parametreleri, hassasiyet yeterince yüksek olduğunda numunede optimize edilebilir. Burada 16 tarama ile bir CP kaydediyoruz. CP temas süresi ve güç seviyeleri, CP temas süresinin optimizasyonu için burada gösterildiği gibi maksimum sinyal yoğunluğuna göre seçilir.

Bu örnekteki maksimum yoğunluğa 800 milisaniyede ulaşılır. Ayırma parametreleri, referans bileşik kalibrasyonundan orijinal olarak ayarlananlardan da yeniden ayarlanmalıdır. Son olarak, sinyalle örtüşmeyi önlemek için, burada 18 kilohertz olarak gösterilen verilen sihirli açılı eğirme frekansında dönen yan bantların lokalizasyonunu dikkatlice gözlemleyin.

Tek boyutlu spektral parmak izi görevi gören bir referans 1D proton karbon CP spektrumu kaydedin. Burada, 800 milisaniye CP temas süresi, 100 kilohertz ayırma gücü, üç saniyelik bir geri dönüşüm gecikmesi ve 20 milisaniyelik bir edinme süresi ile 128 tarama biriktiriyoruz. CP deneyini ilgisizlik olmadan işleyin.

Yapısal düzen ve homojenliğin göstergesi olan numune içindeki C39'u tahmin etmek için izole edilmiş bir tepe noktası seçin. Burada, yarım yükseklikte tam genişlik olarak ölçülen çizgi genişliği, 60 ila 70 hertz civarındadır, bu da düzenekte iyi düzenlenmiş bir protein yapısının göstergesidir. Protein düzeneğinin son derece hareketli parçalarını araştırmak için tek boyutlu bir proton karbon beceriksiz deneyi kurun.

Mobil protein segmentleri için parmak izi görevi görmesi için bir referans beceriksiz deney kaydedin. Tipik parametreler 128 tarama ve 25 milisaniyelik bir alım süresidir. Proton karbon beceriksiz deneyini işleyin.

Sinyallerin sayısı ve konumları, sırasıyla kalıntı hareketliliğinin derecesinin ve amino asit bileşiminin göstergesidir. Burada, tüm protein montaj yapısında katı bir rejimde olduğu için sadece büküm tamponu CH2 liyakatinden gelen sinyal gözlenir. Protein yapısının konformasyonel analizi, düzeneğin tüm rijit kalıntıları için katı hal NMR rezonans atamalarına dayanır.

Bu, kimyasal kaymaların yerel kimyasal ortam için oldukça hassas problar olması ve proteinin ikincil yapısını tahmin etmek için kullanılabilmesi nedeniyle mümkün olmaktadır. Daha sonra eksiksiz bir 3D yapı belirlemesi, dokuz angstrom'a kadar hem molekül içi hem de moleküller arası atom yakınlıklarını kodlayan mesafe kısıtlamaları gibi yapısal verilerin toplanmasına dayanır. Burada, temel iki boyutlu deneylerin nasıl kaydedildiğini göstereceğiz ve sıralı bir atama örneği vereceğiz.

Daha sonra, seçici olarak C13 etiketli numuneler üzerinde kaydedilen deneylerden mesafe kısıtlamalarının nasıl toplanacağına dair kısa bir gösteri yapacağız. Kalıntı içi karbon karbon korelasyonunu tespit etmek için kısa karıştırma süresi iki boyutlu karbon karbon PDSD deneyini ayarlayın. Tek boyutlu CP deneyinden ilk proton karbon çapraz polarizasyon adımının değerlerini kopyalayın.

Karıştırma, tek tip C13 etiketli numuneler için 50 milisaniyeye ayarlanabilir. Burada, dolaylı ve doğrudan boyutlarda sırasıyla 15 ve 20 milisaniye çekim süresi seçtik. PDSD spektrumunu işlemek için, 3.5 sinüs zili kayması olan bir QSINE pencere fonksiyonu kullanıyoruz.

Kalıntıya özel atamayı etkinleştirmek için, 100 ila 200 milisaniye karıştırma süresine sahip bir ara karıştırma süresi PDSD'si kaydetmek için kısa karıştırma süresi PDSD'nin ayarlarını kullanın. Nitrojen tarafından tespit edilen deneyler de dahil olmak üzere ek spektrumların genellikle tam bir rezonans ataması için gerekli olduğunu ve protokolde ayrıntılı olarak açıklandığını unutmayın. CCPNMR Analizi gibi bir NMR analiz programı seçin.

2D spektrumları yazılıma yükleyin ve birincil protein dizisi ile moleküler bir nesne oluşturun. Kısa karıştırma süresi PDSD spektrumunda görülebilen amino asit tiplerinin tanımlanması ile başlayın. Spin sistemlerinin karbon atomlarının bağlanması, kalıntı tipine özel atamaya izin verir.

Burada, bir tenyum kalıntısının spin sistemini atıyoruz. C-alfa, C-beta ve C-gama çekirdekleri arasındaki polarizasyon transferleri, PDSD spektrumunda fiziksel çapraz zirvelere yol açar. Bu prosedürle mümkün olduğunca çok kalıntıyı tanımlamaya çalışın.

Hem kısa hem de ara karıştırma süresi PDSD spektrumunu kaplayın. Ara karıştırma süresi PDSD'de görülebilen ek pikler, genellikle sıralı kalıntılar arasındaki temastan kaynaklanır. Bir spin sisteminin rezonans tepe noktalarını işaretleyin ve diğer spin sistemlerinin rezonans frekansları ile ara karıştırma süresi PDSD'deki korelasyonları bulun.

Filamentli protein düzeneğimizde tenyum 33 ile isololan 32 arasındaki sıralı atamayı gösteriyoruz. Thenium spin sisteminin rezonans frekansları, 32'deki çözünenlerin karbon frekansında görülebilir ve bunun tersi de geçerlidir. Azot tespit edilen spektrumlarla atama ve atamalardan protein ikincil yapısını elde etme prosedürleri protokolde açıklanmıştır.

Kapsamlı rezonans atamasının ardından, uzun menzilli kısıtlamaların tanımlanmasına devam edebiliriz. Uzun menzilli kısıtlamalar, hem monomerik alt birimlerin üçüncül kıvrımını hem de montaj içindeki alt birimlerin düzenini tanımlayan uzak kalıntılar arasındaki molekül içi veya moleküller arası karbon karbon yakınlıklarıdır. Burada, seçici olarak C13 etiketli numuneler özellikle önemlidir.

Seçici olarak C13 etiketli bir numune üzerinde 400 milisaniye ile bir saniye arasında bir karıştırma süresiyle kaydedilen uzun bir karıştırma süresi karbon karbon PDSD ile bir ara karıştırma süresi PDSD'yi kaplayın. Mümkünse, her iki PDSD de seçici olarak etiketlenmiş aynı numuneye kaydedilmiş olmalıdır. Ek zirveler, daha uzak C13 atomları arasındaki korelasyonlardan kaynaklanır.

Rezonans ataması sırasında, seçici etiketleme şemasını dikkate alın. Bu durumda, 1-3-gliserol. Burada, her iki boyuta da uzun menzilli bir temas zirvesi ve açık bir atama örneğini vurguladık ve örnekledik.

Protein 45 C-alfa ile Thenium 33 C-beta. Uzun menzilli mesafe tanımlaması tamamlandıktan sonra, kısıtlamalar belirsiz veya belirsiz ve ayrıca molekül içi veya moleküller arası olarak sınıflandırılır. Yapısal modelleme için hazırlanacak kısıt listeleri protokolde listelenmiştir.

Farklı programlar kullanarak yapısal modelleme ile ilgili eğitimler çevrimiçi olarak bulunabilir. Katı hal NMR verileri, kendi başına veya tamamlayıcı verilerle birlikte, süper moleküler düzeneklerin atomik düzeyde yapı belirlemesine izin verebilir. Katı hal NMR'nin avantajları, bir yandan, modelleme sürecine entegre edilebilen molekül içi arayüzlerden hem ikincil yapı bilgisi hem de atomik mesafe kısıtlamaları sağlama yeteneğidir.

Bununla birlikte, öte yandan, katı hal NMR spektroskopisinin benzersiz özelliği, bozulmamış süper moleküler montajın moleküller arası arayüzlerinde atomik mesafe kısıtlamalarını toplama yeteneğinde yatmaktadır. Bununla birlikte, moleküller arası ve moleküller arası kısıtlama atamaları arasındaki tespit ve ayrım sıkıcı bir süreç olabilir ve tipik olarak seçici olarak C13 etiketli numunelerin hazırlanmasını gerektirir. Bununla birlikte, seçici etiketleme stratejileri, spektrometre donanım tasarımı ve katı hal NMR metodolojilerindeki yeni gelişmelerle birlikte, teknik, nesne boyutu, uzun menzilli düzen veya kristallik sınırlamaları olmaksızın atomik düzeyde moleküler bilgi sağlama teorik potansiyelini giderek daha fazla yerine getirmektedir.

Bu yöntem, biyomoleküler düzeneklerin atomik yapısını incelememizi sağlar. Yüksek çözünürlüklü veriler elde etmek için NMR durumunu optimize etmek için numuneyi dikkatli bir şekilde hazırlamak çok önemlidir. Bu protokol ile protein düzeneklerinin bilgisi olan atomik çözünürlükleri elde edebiliriz.

Ve bu teknik, üç boyutlu modeller elde etmek için yapısal biyolojideki diğer tekniklerle birleştirilebilir.