Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çok sayıda tek tip boyut kontrollü tümör sferoidi üretmektir. Bu, önce steroidlere dönüştürülecek hücreleri kümelemek için mikrokuyu plakalarının hazırlanmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, OID'lerin boyutunu ve bileşimini belirleyen hücre süspansiyonunu sağlayan istenen hücre tipinde bir kültür hasat edilir.

Hücre süspansiyonu daha sonra mikro kuyucuklara santrifüjlenir ve inkübasyondan sonra steroidin oluşmasına izin vermek için inkübe edilir. Elde edilen steroid oldukça homojendir ve oluşturuldukları mikro kuyucuklarda toplanabilir veya kültürlenebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, aynı anda çok sayıda tek tip agreganın yapılabilmesidir.

Bu yönteme yeni başlayan kişiler, yakıtlarının çok büyük olduğunu görebilirler. Hücre süspansiyonunun plaka boyunca eşit olarak dağıtılmasını ve merkezi Fuge'deki sallanan plaka taşıyıcılarının, kuvvetin yüzeye dik olması için serbestçe hareket etmesini sağlamak önemlidir. Başlamak için, her bir oyuğa 0,5 mililitre yüzey aktif madde içeren durulama çözeltisi ekleyerek steril bir agro kuyu 400 plakası hazırlayın.

Yüzey aktif madde kullanılması, hücrelerin mikro kuyu yüzeyi ile etkileşime girmemesini sağlar. Mikro kuyucuklarda hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için, bir tarafa sıvı ekleyin ve yüzeye dikey olarak bırakmak yerine yüzeye yayılmasına izin verin. Çözeltiyi kuyucuklara ekledikten sonra kapağı değiştirin.

Plakaları 2000 kez iki dakika santrifüjlemeden önce rotorun uygun şekilde dengelendiğinden emin olun G.To düşük büyütmeli ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak kabarcıkları çıkarın, kabarcıkların mikro kuyulardan çıkarıldığını doğrulayın. Plakayı, kapağı kapalı olarak oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin. Durulama solüsyonunu kuyulardan aspire edin ve plakayı kullanmadan hemen önce steril su veya PBS ile yıkayın.

Kodlamadan sonra plakaların kurumasına izin vermeyin. Hücre hazırlığının ayrıntıları, çalışılan spesifik hücre tipine göre değişecektir. Bununla birlikte, bu durumun, burada tartıştığımız çizgilerin yanı sıra insan ve nöron embriyonik kök hücreleri, insan kaynaklı pluripotent kök hücre, fibroblastlar, varsayılan, ilkel endon ve stromal hücreler de dahil olmak üzere geniş bir hücre yelpazesi için etkili olduğunu gözlemledik Hücreleri hazırlamak için, HT 29 hücrelerinin T 75 şişesi ile başlayın.

Şişeden büyüme ortamını aspire edin ve üç mililitre tripsin ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Üç mililitre büyüme ortamı ekleyerek tripsin sindirimini durdurun.

Kalanını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra 15 mililitrelik bir tüpten hücre sayımı için bir alikot alın. Santrifüjleme devam ederken hücreleri 200 kez G'de beş dakika

Hücreleri sayın. Daha sonra, deneme ortamı karışımını aspire edin ve taze büyüme ile değiştirin. İsteğe bağlı bir adım olarak metin protokolünde açıklandığı gibi daha önce hesaplanan gerekli hücre yoğunluğu tarafından belirlenen bir hacimde ortam.

Herhangi bir topaklanmayı gidermek için hücre süspansiyonunu bir süzgeçten geçirin. Sferoidler çeşitli besiyeri formülasyonlarında üretilebilir, ancak ilk denemeler hücrelerin kültürlendiği besiyeri kullanılarak yapılmalıdır. Üç boyutlu bir kültür sistemine geçişin sonuçlarını, ortam bileşimini değiştirmenin sonuçlarından ayırt etmek için, her bir kuyu santrifüjüne 2000 kez iki dakika boyunca 0.4 mililitre büyüme ortamı ekleyerek başlayın G.To düşük büyütmeli ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak kabarcıkları çıkarın, kabarcıkların mikro kuyucuklardan çıkarıldığını doğrulayın.

Daha sonra, mikro kuyucuklara gerekli yoğunlukta 0.4 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, mikro kuyucuklara hava kabarcıkları sokmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın, hücrelerin kuyu boyunca eşit olarak dağıldığından emin olun. Tutarlı steroidler elde etmek için.

Plakayı 200 kez beş dakika santrifüjleyin. G, plaka, ağırlığın plaka taşıyıcının her iki tarafına eşit olarak dağıtılması için plakanın hem dahili olarak hem de diğer plakaya karşı dengelenmesi gerekir. Bu, santrifüjleme sırasında plakanın kendi kendine düzleşmesini sağlar, böylece konveksiyon akımları ortaya çıkmaz ve hücrelerin mikro kuyular boyunca eşit olmayan dağılımına neden olmaz.

Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce hücrelerin mikro kuyucuklar içinde kümelendiğini ve kuyu boyunca eşit olarak dağıldıklarını doğrulayın. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak sferoid oluşum sürecini gözlemleyin. Bazı hücre hatları 24 saat içinde kompakt steroid oluşturacaktır.

Diğerleri daha uzun sürebilir. HT 29 hücrelerinde kümeden agregaya ilerleme burada gösterilmiştir. Bu prosedürün en zor kısmı, yapıları rahatsız etmeden intex steroidlerini çıkarmaktır: Steroidleri mikro kuyulardan çıkarmak için, sferoidlerin mikro kuyulardan çıkmasına izin vermek için çok nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha sonra orta steroid karışımını aspire etmek için plakayı eğin. Steroidin parçalanmasını önlemek için daha büyük boyutlu steroidler için geniş delikli pipet uçları kullanın. Steroidi mikro kuyucuklardan geri kazandıktan sonra, bir pipetle nazikçe püskürterek süspansiyon kültürüne aktarın.

Alternatif olarak, şiddetli gül, orta bir replasman ile nöbet sırasında korunabilir. Süre, başlangıç boyutuna ve mikro kuyulardan çıkmaya kadar geçen süreyi tanımlayan büyüme hızına bağlıdır. Eh, onlar kuruldu Steroid kaybetmeden ortamı değiştirmek için.

Kuyu kenarındaki ortamı aspire edin. Bir mera pipeti kullanarak, menisküsten sıvı çekmeye başlayana kadar ucu yavaşça aşağı indirin ve menisküsü düşerken aşağı doğru takip edin. Sonra aynı yerde kuyu duvarına karşı taze ortam ekleyin.

Taze ortamı eklerken, mikro kuyucuklardaki PHE'nin bozulmasını önlemek için pipetleyiciyi hafifçe itmeyi ve ucunu duvara karşı tutmayı unutmayın. Birkaç steroid kaybolabilir. Bununla birlikte, ortam her zaman aynı pozisyonda aspire edilir ve değiştirilirse, bu sayı küçük kalacaktır.

Kuyudaki büyük sayılarla karşılaştırıldığında, farklı anatomik kökenlere sahip çoklu tümör hatlarından elde edilen steroidler kolayca süspansiyona çıkarılabilir. Bu yöntemle elde edilebilen tutarlı boyut kontrolü, burada yüksek derecede homojen steroid popülasyonları ile gösterilmiştir. Her koşulda 700 veya 1.500 hücreden oluşur.

Davranıştaki açık satır arası farklılıklar, HT 29 kolon kanseri hücreleri ve keskin tanımlanmış sınırlara sahip yoğun paketlenmiş steroidler oluşturan TE altı özofagus kanseri hücresi ile de görülebilir. Tersine, lin cap prostat kanseri hücreleri, düzensiz sınırları olan daha az tutarlı steroidlere yol açar. Daha tutarlı agregalardaki daha güçlü iç kuvvetler, hala oluşturuldukları mikro kuyularda bile daha simetrik bir forma çökmeye neden oldu.

Bununla birlikte, lin kapağı agregaları, özellikle daha büyük boyutta, mikro kuyuların kare parametal geometrisini gözle görülür şekilde korur Bir kez ustalaştıktan sonra, bu işlem yaklaşık bir saat artı hücrelerin yapışması ve sıvı yapması için gereken inkübasyon süresi içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, hücreleri eklemeden önce mikro kuyucukları dolaşarak başka bir kabarcık çıkardığından emin olmayı unutmamak önemlidir.