3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

DIŞ SES: Bu yöntemin genel amacı, çeşitli hücre bazlı tahlillerde kullanılmak üzere hücre toplama yoluyla büyük miktarlarda sağlam hücre sferoidlerini verimli bir şekilde üretmektir. Bu tekniğin ana avantajı, hücre agregasyonu ve sferoid oluşumu için proteinli olmayan suda çözünür bir matris kullanmasıdır, bu da sferoidlerin kolay ve hızlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Bu yöntem, hücre-hücre ve hücre/matris etkileşimlerinin üç boyutlu bir mikro ortamda doku büyümesi üzerindeki etkileri hakkında hücre biyolojisinde yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir.

ANLATICI Agregaları hazırlamadan önce 50 mililitre ultra saf suyu 80 santigrat dereceye ısıtın ve 10 gram metilselüloz tozu ekleyin. Parçacıklar eşit şekilde dağılana kadar süspansiyonu çalkalayın. Daha sonra 100 mililitrelik son hacme soğuk ultra saf su ekleyin ve parçacıkları, çözelti berraklaşana ve görünür katı madde olmadan saman rengine dönene kadar gece boyunca 4 santigrat derecede saklayın.

Çözünmemiş parçaları çıkarmak için çözeltiyi 0.45 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve uygun kültür ortamında filtrelenmiş çözeltinin mililitresi başına 1: 5 miligram seyreltin. Daha sonra metilselüloz takviyeli ortamı 0.22 mikrometrelik bir süzgeçten süzün. Daha sonra, bir biyo güvenlik kabininde,% 70 birleşik bir alt kültürü PBS ile yıkayın ve hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe üç mililitre Tripsin-EDTA ilişkilendirme tamponu ile tutturun.

Birkaç dakika sonra, hücreleri 10x büyütmede ışık mikroskobu altında inceleyin. Hücreler plakadan kaldırıldığında, reaksiyonu yedi mililitre serum takviyeli kültür ortamı ile nötralize edin. Hücre çözeltisini 15 mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve ardından serbest kalan hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Başarısız bir sferoid oluşumunun en yaygın nedeni, kirletici partiküllerin yanı sıra, spesifik hücre hattınızın toplanması ve büyümesi için optimal olmayan konsantrasyonlarda metilselüloz veya serum kullanılmasıdır. DIŞ SESİ-Filtre uçlu bir P1000 mikropipet kullanarak, pipet ucunu tüpün dibine hafif bir açıyla bastırırken, peleti sarmak için tüm uç içeriğini dışarı atmadan yavaşça pipetleyerek, bir mililitre küresel oluşum ortamıyla paleti üç ila beş kez tritüre edin. Saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin ve toz ve lifleri gidermek için steril bir çok kanallı pipet haznesini filtrelenmiş ultra saf suyla durulayın.

Hücreleri rezervuara dağıtın ve 100 mikrolitre hücreyi 96 kuyulu U-tabanlı hücre itici plakanın her bir oyuğuna aktarmak için filtre uçlarını kullanın, hücrelerin rezervuarın dibine çökmesini önlemek için hücre süspansiyonunu periyodik olarak karıştırın. Tüm hücreler oturduğunda, plakayı bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve kuyucukları küresel oluşum açısından günlük olarak inceleyin. Hücreler altı saat içinde her bir oyuğun dibine yerleşmeli ve genellikle 24 ila 48 saat içinde bir küre halinde toplanmalıdır.

Başarılı bir sferoidin oluşumunu doğrulamak için, ortamı sferoidin üzerine nazikçe pipetlemek için ışık mikroskobu altında bir P10 ucu kullanın. Düzgün şekillendirilmiş sferoidler plakadan gevşeyecek ve yuvarlanarak 3 boyutlu yapılarını doğrulayacaktır. Sferoidleri kollajen içine gömmek için, sekiz oyuklu bir doku kültürü odası slaytının her bir oyuğunun tabanını, oyuk başına en az 50 mikrolitre nötralize kollajen ile eşit şekilde kaplamak için ters pipetleme kullanın.

Tüm kuyucuklar kapatıldığında, ultra saf su ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına hazne kızağını 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin ve 10 santimetrelik doku kültürü kabını 37 santigrat derecede yaklaşık bir saat inkübe edin. Kollajen polimerize olduğunda, önceden oluşturulmuş sferoidleri dikkatlice 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için bir P1000 filtre ucu kullanın. Sferoidleri veya ortamı eklerken kollajeni rahatsız etmemek için kollajen baz katmanlarının tamamen polimerize olana kadar inkübe edilmesi çok önemlidir.

Ekran Okuyucusu Hasat edilen sferoidleri bir masa üstü mikro santrifüjde toplayın ve süpernatanları çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın, gerektiğinde temiz bir kağıt havlu üzerinde tüp ters çevirme yoluyla fazla süpernatanı uzaklaştırın. Geniş delikli bir P200 pipet ucu kullanarak, sferoidleri hemen 50 mikrolitre nötralize kollajen içinde yeniden süspanse edin ve sferoid kollajen karışımlarını sekiz kuyulu doku kültürü odası slaytının her bir oyuğuna dikkatlice aktarın. Kollajen polimerize olana kadar slaydı inkübatöre geri koyun.

Yaklaşık bir saat sonra, başka bir inkübasyon için her bir oyuğa uygun ilgi tedavisini içeren en az 100 mikrolitre ısıtılmış kültür ortamını yavaşça ekleyin. Ardından, istilacı sferoidler aracılığıyla optik görüntüleme kesitleri elde etmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu protokolü kullanarak, çeşitli hücre hatlarından sferoidler üretilebilir.

Uygun metilselüloz ve serum muamele koşulları altında, tek tek hücreler, kuyu dibine minimum yapışma ile sferoidler oluşturmak için kuyu merkezine yerleşir ve birbirine yapışır. Bazı hücre hatları, metilselülozun yokluğunda veya düşük konsantrasyonlarında hücre itici plakalara yapışabilir, bu da bir hücre tek tabakası ile çevrili bir sferoid oluşumuna neden olur. Genel olarak, daha yüksek konsantrasyonlarda metilselüloz, hücrelerin kuyuya yapışmasını engeller.

Ancak çok yüksek bir metilselüloz konsantrasyonu, hücreden hücreye yapışmayı azaltır ve hücrelerin kuyu dibine yerleşmesini önler, bu da gevşek agregaların ve çok sayıda uydu sferoidinin oluşmasına neden olur. Kollajen gömülü sferoidler, tek tek hücrelerin sferoidden dışarıya doğru çevreleyen matrise istilasını indüklemek için bir kemoatraktan ile tedavi edilebilir. Sabit kollajen gömülü sferoidler, istilacı hücrelerin mesafesini ve sayısını ölçmek için parlak alan mikroskobu ile veya göç eden hücreler tarafından oluşturulan istilacı yapıları görselleştirmek için immünofloresan mikroskobu ile görüntülenebilir.

Hücrelerin, parçalanmadan manipülasyonları için yeterince sağlam olan ve sonraki tahlillerde kullanılmak üzere kolayca toplanabilen yapısal olarak sağlam sferoidler halinde toplanması için yeterli zaman tanımak önemlidir. Hücre büyüme protokolümüz, çoklu hücre biyolojisi testleri için daha fazla uyarlanabilir. Örneğin, hücrelerin yüksek konsantrasyonlarda metilselüloz ile takviye edilmiş ortamlara oturtulması, selanoikos direnci değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, birçok hücre biyolojisi uygulaması için değerli bir araç olacak olan toplama yoluyla üç boyutlu hücre sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.