3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

ANLATICI Bu yöntemin genel amacı, çeşitli hücre tabanlı analizlerde kullanılmak üzere, hücre agregasyonu yoluyla büyük miktarlarda dayanıklı hücre sferoidlerini verimli bir şekilde üretmektir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre agregasyonu ve sferoid oluşumu için protein içermeyen, suda çözünür bir matris kullanmasıdır; bu da sferoidlerin kolay ve hızlı bir şekilde izole edilmesine olanak tanır. Bu yöntem, üç boyutlu bir mikroçevrede hücre-hücre ve hücre/matris etkileşimlerinin doku büyümesi üzerindeki etkileri hakkında hücre biyolojisinde yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir.

ANLATICI Agregatları hazırlamadan önce, 50 mililitre ultrapure suyu 80 derece santigrat dereceye kadar ısıtın ve 10 gram metilselüloz tozu ekleyin. Partiküller eşit şekilde dağılana kadar süspansiyonu karıştırın. Ardından, nihai hacim 100 mililitre olana kadar soğuk ultrapure su ekleyin ve çözelti berraklaşıp, görünür katı madde içermeyen saman rengini alana kadar partikülleri 4 derece santigrat derecede gece boyunca saklayın.

Çözünmemiş parçacıkları uzaklaştırmak için çözeltiyi 0.45 mikrometre filtreden geçirin ve filtrelenmiş çözeltiyi uygun kültür ortamında 1:5 mg/mL oranında seyreltin. Ardından, metilselüloz takviyeli ortamı 0.22 mikrometre süzgeçten filtreleyin. Sonrasında, bir biyogüvenlik kabininde, %70 konfluen bir subkültürü PBS ile yıkayın ve hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe üç mililitre Trypsin-EDTA birliktirme tamponu ile ayırın.

Birkaç dakika sonra, hücreleri ışık mikroskobunda 10x büyütmede inceleyin. Hücreler plakadan ayrıldığında, reaksiyonu yedi mililitre serum takviyeli kültür ortamı ile nötralize edin. Hücre solüsyonunu yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve ardından serbest kalan hücreleri santrifüjle toplayın.

Kontamine edici partiküller dışında, başarısız sferoid oluşumunun en yaygın nedeni, kullandığınız hücre hattının agregasyonu ve büyümesi için suboptimal metilselüloz veya serum konsantrasyonlarının kullanılmasıdır. ANLATICI-Filtreli uçlu bir P1000 mikropipet kullanarak, pipet ucunu tüpün tabanına hafif bir açıyla bastırarak ve pellet'i parçalamak için uç içeriğinin tamamını boşaltmadan yavaşça pipetleme yaparak, pellet'i bir mililitre sferoid oluşum medyumu ile üç ila beş kez tritüre edin. Sayım yaptıktan sonra, hücre süspansiyonunu 1 × 10⁴ hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin ve toz ile lifleri temizlemek için steril bir çok kanallı pipet rezervuarını filtrelenmiş ultra saf su ile durulayın.

Hücreleri rezervuara aktarın ve hücrelerin rezervuarın dibine çökmesini önlemek için hücre süspansiyonunu periyodik olarak karıştırarak, 96 kuyucuklu U-tabanlı hücre itici plakanın her bir kuyucuğuna filtreli uçlar yardımıyla 100 microliters hücre transfer edin. Tüm hücreler yerleştirildiğinde, plakayı bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve sferoid oluşumunu gözlemlemek için kuyucukları günlük olarak kontrol edin. Hücreler altı saat içinde her bir kuyucuğun dibine çökmeli ve genellikle 24 ila 48 saat içinde bir sferoid şeklinde kümelenmelidir.

Başarılı bir sferoid oluşumunu doğrulamak için, ışık mikroskobu altında bir P10 uç kullanarak sferoidin üzerine nazikçe besiyeri pipetleyin. Doğru şekilde oluşmuş sferoidler plakadan ayrılıp yuvarlanacak ve böylece 3-B yapıları doğrulanmış olacaktır. Sferoidleri kolajene gömmek için, sekiz kuyucuklu bir doku kültürü oda slaytının her bir kuyucuğunun tabanını, kuyucuk başına minimum 50 µL nötralize kolajen ile eşit şekilde kaplamak amacıyla ters pipetleme yöntemini kullanın.

Tüm kuyucuklar kapatıldıktan sonra, oda slaytını ultrapure su ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir doku kültürü kabının içine, ardından bunu da 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin ve 10 santimetrelik doku kültürü kabını yaklaşık bir saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kolajen polimerize olduğunda, önceden oluşturulmuş sferoidleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine dikkatlice aktarmak için P1000 filtreli uç kullanın. Sferoidler veya besiyeri eklenirken kolajenin bozulmasını önlemek için kolajen taban katmanlarının tamamen polimerize olana kadar inkübe edilmesi kritik önem taşımaktadır.

Anlatıcı Hasat edilen sferoidleri masaüstü bir mikro santrifüjde toplayın ve süpernatantları uzaklaştırmak için bir P200 pipet kullanın; gerekiyorsa tüpü temiz bir kağıt havlu üzerine ters çevirerek fazla süpernatantı emdirin. Geniş ağızlı bir P200 pipet ucu kullanarak sferoidleri derhal 50 µL nötralize kolajen içinde yeniden süspanse edin ve sferoid-kolajen karışımlarını sekiz kuyucuklu doku kültürü oda slide'ının her bir kuyucuğuna dikkatlice aktarın. Kolajen polimerleşene kadar slide'ı inkübatöre geri yerleştirin.

Yaklaşık bir saat sonra, başka bir inkübasyon için her bir kuyucuğa, ilgilenilen uygun işlemi içeren ısıtılmış kültür ortamından en az 100 microliters yavaşça ekleyin. Ardından, istila eden sferoidlerin optik görüntüleme kesitlerini elde etmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu protokol kullanılarak, çeşitli hücre hatlarından sferoidler üretilebilir.

Uygun metilselüloz ve serum uygulama koşulları altında, münferit hücreler çöker ve kuyucuğun merkezinde birbirine tutunarak, kuyucuk tabanına minimum düzeyde yapışan sferoidler oluşturur. Bazı hücre hatları, metilselülozun yokluğunda veya düşük konsantrasyonlarında hücre itici plakalara tutunabilmekte ve bu durum, etrafı hücre monotabakasıyla çevrili bir sferoid oluşumuyla sonuçlanmaktadır. Genel olarak, daha yüksek metilselüloz konsantrasyonları hücrelerin kuyucuğa tutunmasını engeller.

Ancak çok yüksek metilselüloz konsantrasyonu hücre-hücre adezyonunu azaltır ve hücrelerin kuyucuğun dibine çökmesini engelleyerek, gevşek agregatların ve çok sayıda uydu sferoidin oluşmasına neden olur. Kollajen gömülü sferoidler, bireysel hücrelerin sferoidden dışarıya, çevredeki matrikse doğru invazyonunu indüklemek için bir kemoatraktan ile işlenebilir. Fikse edilmiş kollajen gömülü sferoidler, invaze olan hücrelerin sayısını ve mesafesini belirlemek için parlak alan mikroskopisiyle veya göç eden hücreler tarafından oluşturulan invaziv yapıları görselleştirmek için immünofloresan mikroskopisiyle görüntülenebilir.

Hücrelerin, fragmanlara ayrılmadan manipüle edilebilecek kadar sağlam ve sonraki analizlerde kullanılmak üzere kolayca toplanabilecek yapısal bütünlüğe sahip sferoidler oluşturacak kadar yeterli süreye sahip olmaları önemlidir. Hücre büyüme protokolümüz, birden fazla hücre biyolojisi analizi için daha da uyarlanabilir. Örneğin, hücrelerin yüksek konsantrasyonlarda metilselüloz ile desteklenmiş ortamlara yerleştirilmesi, hücrelerin kanonik direncini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, birçok hücre biyolojisi uygulaması için değerli bir araç olacak olan agregasyon yoluyla üç boyutlu hücre sferoidlerinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.