3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi
27 Mart 2017
Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.
DIŞ SES: Bu yöntemin genel amacı, çeşitli hücre bazlı tahlillerde kullanılmak üzere hücre toplama yoluyla büyük miktarlarda sağlam hücre sferoidlerini verimli bir şekilde üretmektir. Bu tekniğin ana avantajı, hücre agregasyonu ve sferoid oluşumu için proteinli olmayan suda çözünür bir matris kullanmasıdır, bu da sferoidlerin kolay ve hızlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Bu yöntem, hücre-hücre ve hücre/matris etkileşimlerinin üç boyutlu bir mikro ortamda doku büyümesi üzerindeki etkileri hakkında hücre biyolojisinde yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir.
ANLATICI Agregaları hazırlamadan önce 50 mililitre ultra saf suyu 80 santigrat dereceye ısıtın ve 10 gram metilselüloz tozu ekleyin. Parçacıklar eşit şekilde dağılana kadar süspansiyonu çalkalayın. Daha sonra 100 mililitrelik son hacme soğuk ultra saf su ekleyin ve parçacıkları, çözelti berraklaşana ve görünür katı madde olmadan saman rengine dönene kadar gece boyunca 4 santigrat derecede saklayın.
Çözünmemiş parçaları çıkarmak için çözeltiyi 0.45 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve uygun kültür ortamında filtrelenmiş çözeltinin mililitresi başına 1: 5 miligram seyreltin. Daha sonra metilselüloz takviyeli ortamı 0.22 mikrometrelik bir süzgeçten süzün. Daha sonra, bir biyo güvenlik kabininde,% 70 birleşik bir alt kültürü PBS ile yıkayın ve hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe üç mililitre Tripsin-EDTA ilişkilendirme tamponu ile tutturun.
Birkaç dakika sonra, hücreleri 10x büyütmede ışık mikroskobu altında inceleyin. Hücreler plakadan kaldırıldığında, reaksiyonu yedi mililitre serum takviyeli kültür ortamı ile nötralize edin. Hücre çözeltisini 15 mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve ardından serbest kalan hücreleri santrifüjleme ile toplayın.
Başarısız bir sferoid oluşumunun en yaygın nedeni, kirletici partiküllerin yanı sıra, spesifik hücre hattınızın toplanması ve büyümesi için optimal olmayan konsantrasyonlarda metilselüloz veya serum kullanılmasıdır. DIŞ SESİ-Filtre uçlu bir P1000 mikropipet kullanarak, pipet ucunu tüpün dibine hafif bir açıyla bastırırken, peleti sarmak için tüm uç içeriğini dışarı atmadan yavaşça pipetleyerek, bir mililitre küresel oluşum ortamıyla paleti üç ila beş kez tritüre edin. Saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin ve toz ve lifleri gidermek için steril bir çok kanallı pipet haznesini filtrelenmiş ultra saf suyla durulayın.
Hücreleri rezervuara dağıtın ve 100 mikrolitre hücreyi 96 kuyulu U-tabanlı hücre itici plakanın her bir oyuğuna aktarmak için filtre uçlarını kullanın, hücrelerin rezervuarın dibine çökmesini önlemek için hücre süspansiyonunu periyodik olarak karıştırın. Tüm hücreler oturduğunda, plakayı bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve kuyucukları küresel oluşum açısından günlük olarak inceleyin. Hücreler altı saat içinde her bir oyuğun dibine yerleşmeli ve genellikle 24 ila 48 saat içinde bir küre halinde toplanmalıdır.
Başarılı bir sferoidin oluşumunu doğrulamak için, ortamı sferoidin üzerine nazikçe pipetlemek için ışık mikroskobu altında bir P10 ucu kullanın. Düzgün şekillendirilmiş sferoidler plakadan gevşeyecek ve yuvarlanarak 3 boyutlu yapılarını doğrulayacaktır. Sferoidleri kollajen içine gömmek için, sekiz oyuklu bir doku kültürü odası slaytının her bir oyuğunun tabanını, oyuk başına en az 50 mikrolitre nötralize kollajen ile eşit şekilde kaplamak için ters pipetleme kullanın.
Tüm kuyucuklar kapatıldığında, ultra saf su ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına hazne kızağını 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin ve 10 santimetrelik doku kültürü kabını 37 santigrat derecede yaklaşık bir saat inkübe edin. Kollajen polimerize olduğunda, önceden oluşturulmuş sferoidleri dikkatlice 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için bir P1000 filtre ucu kullanın. Sferoidleri veya ortamı eklerken kollajeni rahatsız etmemek için kollajen baz katmanlarının tamamen polimerize olana kadar inkübe edilmesi çok önemlidir.
Ekran Okuyucusu Hasat edilen sferoidleri bir masa üstü mikro santrifüjde toplayın ve süpernatanları çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın, gerektiğinde temiz bir kağıt havlu üzerinde tüp ters çevirme yoluyla fazla süpernatanı uzaklaştırın. Geniş delikli bir P200 pipet ucu kullanarak, sferoidleri hemen 50 mikrolitre nötralize kollajen içinde yeniden süspanse edin ve sferoid kollajen karışımlarını sekiz kuyulu doku kültürü odası slaytının her bir oyuğuna dikkatlice aktarın. Kollajen polimerize olana kadar slaydı inkübatöre geri koyun.
Yaklaşık bir saat sonra, başka bir inkübasyon için her bir oyuğa uygun ilgi tedavisini içeren en az 100 mikrolitre ısıtılmış kültür ortamını yavaşça ekleyin. Ardından, istilacı sferoidler aracılığıyla optik görüntüleme kesitleri elde etmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu protokolü kullanarak, çeşitli hücre hatlarından sferoidler üretilebilir.
Uygun metilselüloz ve serum muamele koşulları altında, tek tek hücreler, kuyu dibine minimum yapışma ile sferoidler oluşturmak için kuyu merkezine yerleşir ve birbirine yapışır. Bazı hücre hatları, metilselülozun yokluğunda veya düşük konsantrasyonlarında hücre itici plakalara yapışabilir, bu da bir hücre tek tabakası ile çevrili bir sferoid oluşumuna neden olur. Genel olarak, daha yüksek konsantrasyonlarda metilselüloz, hücrelerin kuyuya yapışmasını engeller.
Ancak çok yüksek bir metilselüloz konsantrasyonu, hücreden hücreye yapışmayı azaltır ve hücrelerin kuyu dibine yerleşmesini önler, bu da gevşek agregaların ve çok sayıda uydu sferoidinin oluşmasına neden olur. Kollajen gömülü sferoidler, tek tek hücrelerin sferoidden dışarıya doğru çevreleyen matrise istilasını indüklemek için bir kemoatraktan ile tedavi edilebilir. Sabit kollajen gömülü sferoidler, istilacı hücrelerin mesafesini ve sayısını ölçmek için parlak alan mikroskobu ile veya göç eden hücreler tarafından oluşturulan istilacı yapıları görselleştirmek için immünofloresan mikroskobu ile görüntülenebilir.
Hücrelerin, parçalanmadan manipülasyonları için yeterince sağlam olan ve sonraki tahlillerde kullanılmak üzere kolayca toplanabilen yapısal olarak sağlam sferoidler halinde toplanması için yeterli zaman tanımak önemlidir. Hücre büyüme protokolümüz, çoklu hücre biyolojisi testleri için daha fazla uyarlanabilir. Örneğin, hücrelerin yüksek konsantrasyonlarda metilselüloz ile takviye edilmiş ortamlara oturtulması, selanoikos direnci değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, birçok hücre biyolojisi uygulaması için değerli bir araç olacak olan toplama yoluyla üç boyutlu hücre sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hücre agregasyonu yoluyla 3D hücre sferoidlerinin oluşturulması için hızlı ve esnek bir protokol sunmaktadır. Yöntem, çeşitli hücre tiplerine uyarlanabilir ve hücre göçü, invazyon ve hücre-matris etkileşimleri ile ilgili analizlerde uygulanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- 3D Hücre Kültürü
- Hücre Agregasyon Teknikleri
Arka Plan
- Hücre-hücre ve hücre/matris etkileşimlerinin anlaşılması doku büyümesi için kritik öneme sahiptir.
- 3D hücre sferoidleri, 2D kültürlere kıyasla daha fizyolojik olarak alakalı bir model sağlar.
- Protein içermeyen bir matrisin kullanılması kolay sferoid oluşumunu sağlar.
- Bu yöntem, çeşitli analizler için sferoidlerin hızlı izolasyonunu sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Güçlü hücre sferoidlerinin verimli bir şekilde üretilmesi için bir protokol geliştirmek.
- Mikroçevrenin hücre davranışı üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Doku büyüme dinamikleri hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre agregasyonu için metilselüloz çözeltisinin hazırlanması.
- Ultra saf su ve metilselüloz tozunun ısıtılması ve çalkalanması.
- Çözeltinin kullanımdan önce berraklığı sağlamak üzere depolanması.
- Yöntemin çeşitli hücre tabanlı analizlerde uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Farklı hücre tiplerinden 3D hücre sferoidlerinin başarılı şekilde oluşturulması.
- Protein içermeyen matris kullanılarak sferoid izolasyonunun kolaylığını göstermek.
- 3D ortamda hücre-matris etkileşimlerine ilişkin kazanılmış görüşler.
- Göç, invazyon ve anoksis analizlerinde potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Protokol, 3D hücre kültürü için çok yönlü bir yaklaşım sağlar.
- Hücre biyolojisi alanındaki çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
- Bu yöntem, karmaşık hücresel etkileşimlerin anlaşılmasını artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Robust 3D spheroid models are essential for bridging the gap between traditional 2D cell culture and the complex in vivo tumor microenvironment, enabling more predictive preclinical evaluation. This flexible aggregation protocol supports high-throughput, reproducible generation of spheroids from diverse cell lines, directly impacting early discovery, target validation, and translational research. Its adaptability and scalability position it as a reusable platform for mechanistic de-risking and quantitative phenotypic screening in oncology and tissue biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-cell and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D context.
- Supports functional validation of targets by modeling anchorage-independent growth and anoikis resistance.
- Facilitates mechanistic de-risking by recapitulating tumor-like microenvironments.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies of invasion and migration pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, size-consistent spheroids suitable for quantitative drug screening assays.
- Improves assay reproducibility and scalability across multiple cell types and conditions.
- Enables preparation of validated 3D systems for downstream imaging and molecular analyses.
- Supports reliable evaluation of compound effects on invasion, migration, and viability endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant 3D biology for translational biomarker studies.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by supporting invasion and migration assays in a 3D matrix.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing predictive data on tumor-like behaviors.
- Supports mechanistic studies of resistance and metastatic potential in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting both mechanistic and phenotypic workflows.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of cell behavior in 3D, clarifying pathway dependencies and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in standardized 3D systems.
- Analytics: Enables measurement of invasion, migration, and viability with imaging and molecular readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by modeling tumor microenvironments and resistance mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable protocol adaptable across cell lines and assay formats for portfolio-wide application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and pathway studies.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows, improving reproducibility and scalability for screening and mechanistic assays.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, disease-relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated 3D phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and handling of methylcellulose-based matrices.
- Needs access to cell-repellent plates, imaging platforms, and standard tissue culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of spheroid size, matrix composition, and assay timing for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of tumor and normal cell lines with optimization of serum and methylcellulose concentrations.
- Limitations include cell line-specific aggregation behaviors and the need for careful matrix optimization to avoid loose aggregates or monolayer formation.
