Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yetişkin zebra balığı böbreğindeki nefron segment bileşimini ve işlevselliğini değerlendirmektir. Bu, önce floresan etiketli dekstrinin zebra balıklarını bağlayan bir yuvaya enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, sonraki etiketleme yöntemlerine doku hazırlamak için böbreğin çıkarılması ve sabitlenmesidir.

Daha sonra, pigmentasyonu gidermek için böbrek ağartılır ve daha sonra istenen nefron segmentlerini floresan olarak etiketlemek için boyanır. Sonuçlar, seçilen leke veya lekelere dayalı olarak böbrek anatomisinin görselleştirilmesini sağlayan immünofloresan, mikroskopi ve/veya parlak alan görüntüleme kullanılarak elde edilir. Aşağıdaki etiketleme yöntemleri, organ anatomisi ile ilgili böbrek alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve nefron bileşimini incelemek ve bir yaralanma olayından önce ve sonra böbrek işlevselliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu tekniklerin etkileri, yetişkin böbrek oluşumundaki genetik anomalilerin incelenmesine kadar uzanır ve ayrıca kronik hastalık modellemesi sırasında böbrek durumunu değerlendirmek için de uygulanabilir. Başlamak için, çözeltiyi anestezi uygulanmış bir balıktan boşaltın ve hayvanı dikkatlice ıslak bir sünger kalıbın ventral tarafına yerleştirin. Daha sonra, bir insülin şırıngasını 20 mikrolitre çözülme dekstrin stok çözeltisi ile doldurun.

İğneyi, yerleştirme karnın ventral orta hattında sığ bir açıyla gerçekleşecek şekilde yerleştirin. Organları hafifçe enjekte etmekten kaçınmak için, vücut duvarını kaldırmak ve çözeltiyi enjekte etmek için bir alan oluşturmak için enjeksiyondan hemen sonra iğneyi kaldırın. Enjeksiyondan sonra, anesteziden kurtulmak için balığı yavaşça tanka geri koyun.

Başlamak için, anestezi uygulanmış bir balıktan herhangi bir fazla solüsyonu boşaltın ve bir kağıt mendil veya kağıt havlu üzerine koyun. Baş ve iç organları çıkardıktan sonra, vücut duvarlarını açmak için süper ince diseksiyon iğneleri kullanın. Hayvanın sırt duvarına yapışık olan böbrek organını bulun.

Böbreği sırt duvarından ayırmak için ince forseps kullanın. Böbreği nazikçe bir XPBS içeren beş mililitrelik bir cam şişeye yerleştirin ve her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Böbreği bir transfer pipeti ile çıkarın ve temiz bir cam üzerine yerleştirin Bir ila iki damla bir XPBS ile kaydırın.

Böbreği slayt üzerinde düzleştirmek için ince forseps kullanın, hiçbir dokunun kıvrılmadığından veya başka bir şekilde kendi üzerine devrilmediğinden emin olun. Böbreğin düz konumlandırılmasını kolaylaştırmak için bağ dokusunda küçük kesiler yapmak için bir tungsten tel aleti kullanılabilir. Ardından, 18 x 18 milimetrelik bir cam kapak kaymasının her bir köşesine küçük modelleme kili parçaları yerleştirin.

Kapak kızağını hafif bir açı tutarak yavaşça böbreğin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıklarının sıkışmasını en aza indirmek için, gerekirse kapak kayma ve sürgü arasındaki boşluğu doldurmak için bir XPBS daha ekleyin. Ayrı bir zebra balığı grubu ötenazi yapılır ve gece boyunca fiksatif içine batırılır.

Hazır olduğunda, böbreği sırt vücut duvarından dikkatlice ayırmak için ince forseps kullanın ve organı bir cam şişeye yerleştirin. Diseke edilmiş böbreği üç ila beş mililitre bir XPBS ile her biri beş dakika boyunca% 0.05 ile üç kez yıkayın. Daha sonra, PBS solüsyonunu çıkarın ve böbreği 30 dakika boyunca üç mililitre% 5 sükroz solüsyonu ile durulayın.

Bu süreden sonra, çözeltiyi üç mililitre% 30 sükroz ile değiştirin ve ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Solüsyonu çıkarın ve üç ila beş mililitre ağartma solüsyonu eklemeden önce böbreği iki kez yıkayın. Böbrek organında bulunan melanosit pigmentasyonunu gidermek için, cam şişeyi bir döndürücüye yerleştirin ve pigmentasyonun kaybolmasını dikkatlice izleyin.

Depigmentasyon tipik olarak yaklaşık 20 dakika sürer, ancak bazen 60 dakika kadar sürebilir. Ağartma solüsyonu çok uzun süre açık bırakılırsa, parçalanma meydana gelebilir ve bu nedenle, pigmentasyon böbrek yıkamasından iki kez çıkarıldığında bütünlüğü kontrol etmek için numunenin her 10 ila 15 dakikada bir izlenmesi ve oda sıcaklığında bir saat boyunca %4 PFA solüsyonu ile inkübe edilmesi önerilir. Daha sonra,% 4 PFA çözeltisini çıkarın ve son yıkamadan sonra böbreği üç ila beş mililitre bloke edici solüsyonda üç kez yıkayın ve böbreği oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Engelleme tamamlandığında, doğrudan seçilen boyama protokolüne geçin. Bloke edici solüsyonu çıkarın ve böbreğin en az 10 dakika boyunca bir XPBS'de ıslanmasına izin vermeden önce böbreği üç kez yıkayın. Bu süre zarfında, böbreği 12 kuyulu veya 24 oyuklu bir kültür kabına aktarın.

Numuneyi kaplamak için bir XPBS'yi yeterli çalışan alkalin fosfataz substrat çözeltisi ile değiştirin ve numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin. Bu süreden sonra, böbreği alkalin fosfataz yıkama tampon çözeltisinde yıkayarak reaksiyonu durdurun. Böbreği 10 ila 15 dakika boyunca üç kez yıkama tamponu çözeltisi ile durulayın.

Ardından, yıkama tamponu solüsyonunu çıkarın ve böbreği temiz bir bardağa monte edin. Etiketleme kitinde bulunan fosfataz montaj ortamını kaydırın. Alkalen fosfataz lekeli böbreği bir stereo mikroskop veya Debbie filtre setine bağlı bileşik mikroskop kullanarak görselleştirin.

İlk olarak, DBA'yı bir XPBS'de seyrelterek 200 mikrolitrelik bir çalışma DBA çözeltisi hazırlayın. PBS çözeltisini 200 mikrolitre DBA çözeltisi ile değiştirin ve numuneyi oda sıcaklığında bir saat boyunca bir döndürücüye yerleştirin. Bu süreden sonra, DBA çözeltisini çıkarın ve böbreği her biri beş dakika boyunca üç ila beş mililitre bir XPBS ile üç kez yıkayın.

Bir XPBS'yi çıkarın ve böbreği temiz bir cam kızak üzerine monte edin. Daha önce gösterildiği gibi, bir floresan stereo mikroskop veya bileşik mikroskop üzerinde standart bir Trixie veya Texas kırmızı filtre seti kullanarak böbreğin DBA lekeli distal segmentlerini görselleştirin. Ağartılmamış bir böbreğin bu parlak alan görüntüsünde, siyah pigmentasyon dağınık melanosit popülasyonuna karşılık gelir.

Burada nefron PCT segmentleri dekstrin enjeksiyonundan üç gün sonra görüntülendi. İç kısım, melanositli tek bir nefronun görüntüsünü içerir. Bu görüntü, melanosit pigmentasyonunun çıkarılmasından sonra yetişkin bir böbreği göstermektedir.

Bu temsili görüntüler, PCT segmentleri arasındaki hafif morfolojik varyasyonları gösterirken, birçok nefron PCT sıkıca sarılmıştır. Diğer nefronlar, minimum sarmal dekstrin kaskad mavisi dekstrin, Lucifer sarısı ve Dekstrin floro Yakut'a sahip PCT bölgelerini içerir, hem dekstrin Cascade Blue hem de Lucifer Yellow, Lucifer sarı ile tedavi edilen böbreklerde gözlenen çok daha yüksek arka plana sahip bazı spesifik olmayan etiketleme gösterir. Buna karşılık, dekstrin floro Ruby, yoğun PCT etiketlemesi ile önemli ölçüde azaltılmış arka plan gösterdi.

PCT taşıyıcı hücre tipinin spesifik bir belirtecini tespit etmek isteyerek boyanan yetişkin bir böbrek, çeşitli sıkıca sarılmış ilmekli PCT alanlarının bir dağılımı ile dekstrin alımının karakteristik bir ekspresyon paterni ve ayrıca tutarlı bir geniş çap gösteren daha uzun PCT uzantıları gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, yetişkin zebra balığı böbreğindeki nefron segmentlerini, örneğin alkalin fosfatazlı proksimal tübül ve DBA'lı tıbbi distal tübül gibi nasıl başarılı bir şekilde etiketleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. %4 paraldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman mont, eldiven ve gözlük gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.