Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, zebra balıklarında kantitatif bir böbrek fonksiyon testi oluşturmaktır. Bu, ilk olarak zebra balığı embriyolarının 72 HPF'de anestezi altına alınmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, embriyolar bir enjeksiyon kalıbına aktarılır ve kalpleri görüş alanının solunda olacak şekilde yönlendirilir.

Daha sonra perikard boşluğuna rumine dextra floresan boya enjekte edilir ve epi floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak kardiyak bölgenin floresan görüntüleri istenir. Sonuç olarak, bir floresan boyanın böbrek klerensi, epi floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirilir. Bu tekniğin temel avantajı, zebra balıklarında mümkün olmayan kan veya idrar testleri gerektirmeden zebra balığı böbrek fonksiyonunun kantitatif bir okumasını üretmesidir.

Bu yöntem, zebra balığı hastalık modellerinde böbrek fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araç sağlar. İğneleri çekip metin protokolüne göre bir kalıp hazırladıktan sonra, önce balık suyunda yapılan %2'lik aro solüsyonunu 90 milimetrelik bir petri kabına dökerek kalıbı döküme alın. Kalıbı Petri kabına yerleştirin ve istiflenmiş kayar kenarların agro yüzeyinin altına belirli bir açıyla daldırılmasına izin verin.

30 dakika kurumasına izin verin. Sürgü kalıbını çıkarın ve bir ila 25 oranında trica anestezik içeren taze balık suyu kullanın. Slaytı kapatmak için, floresan boya zebra balığı enjeksiyonları yapmak için aros basılmıştır.

1.0 dış çaplı kılcal damarlarla kullanım için düz bir pipet tutucuya beslenen bir basınç regülatör sistemine bağlı bir hava kompresöründen oluşan standart bir mikroenjeksiyon kurulumu kullanın. Pipet tutucu bir MN 33 compact içine yerleştirilmelidir. Metin protokolünde belirtildiği gibi standart koşulları kullanarak zebra balıklarını korurken embriyoları görselleştirmek, manipüle etmek ve enjekte etmek için manyetik bir stand kullanıcısı diseksiyon mikroskobu ile çelik bir taban plakasına sabitlenmiş üç eksenli kontrol mikro manipülatörü.

Deneye uygun olarak vahşi tip veya transgenik zebra balığı misinaları kullanın. Balıkları rahatsız etmeden maksimum yumurtaların toplanmasını sağlamak için sekiz litrelik tankta 15 erkek ila 15 dişi stoklama yoğunluğunun korunması. Yetiştirme tanklarını, toplamadan önceki akşam vahşi tip stok tanklarına daldırın.

Toplama gününde, balığın yumurtlaması için 30 ila 40 dakika bekleyin. Daha sonra yumurtaları toplamak ve durulamak için bir süzgeç ve taze akvaryum suyu kullanın. Temizlenmiş yumurtaları embriyo, orta içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına koyun ve miyogenezi inhibe etmek için 28.5 santigrat derecede inkübe edin.

Sekiz saatte. Döllenme sonrası veya HPF. Canlı embriyoları minimum sıvı içinde bir ila 100 PTU içeren taze Petri kaplarına embriyo ortamına aktarın ve ayrıca 28.5 santigrat derece inkübe edin.

İğnenin ucunu kırmak için ince uçlu forseps kullanın. Ardından, nabız süresini dakika ayarına kadar en üst düzeye çıkararak RD'yi iğnenin ucuna getirin. Çözüm uca ulaştığında, milisaniyelere geri dönün.

Mikroskop tablasına bir mikrometre yerleştirin ve basınç regülatörü ve iğne ucundaki iyileştirmelerle, enjeksiyondan önce dışarı atılan damlacığın boyutunu 100 mikron çapa veya 0,5 nanolitre hacme ayarlayın. 2 adet 35 milimetre Petri kabı kurun. Her biri beş mililitre embriyo ortamı içeren, bir trica ve diğer iyileşmeyi etiketler.

Trica etiketli tabağa 200 mikrolitre stok trica ekleyin. Enjekte etmeye hazır olduğunda, 72 HPF'de tek bir embriyo seçin. Minimum sıvıyı trica kabına aktarın ve embriyonun aktivitesini izleyin.

Embriyo uyuşturulduktan sonra, onu enjeksiyon kalıbına aktarın ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde oluğa yönlendirin. Kalbi görüş alanının sol tarafına yerleştirmek. RD'yi kalbe enjekte etmek için, perikard'ı delmek için iğneyi kullanın ve perikard boşluğuna bir nanolitre RD enjekte edin.

İğneyi geri çektikten sonra, enjekte edilen embriyoyu minimum sıvı içinde kurtarma kabına aktarın ve bir dakika boyunca izleyin. Daha sonra bireysel embriyoyu, PTU içeren bir mililitre taze embriyo ortamı içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve uygun şekilde etiketleyin. Enjekte edildikten sonra, deney grubu başına en az 10 embriyo 28.5 santigrat derecede üç saat inkübe edilir.

Enjeksiyondan üç saat sonra veya daha önce tarif edildiği gibi HPI anestezi uygulanmış embriyolar. Ve% 3 metil selüloz içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Embriyoları nazikçe metil selülozun içine itin ve yanal tarafın görüntülenebilmesi için yönlendirin.

UV ışığı için 570 nanometrelik bir emisyon filtresi kullanarak, embriyonun bir görüntüsünü elde edin. Embriyonun belirlenen kuyuya yerleştirilmeden önce iyileşmesine izin verin, enjekte edilen tüm embriyolar için görüntüler elde edin, ardından 28.5 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin. 24 HP'de ikinci bir görüntü turu elde ettikten sonra, bir görüntü açarak ve bir ilgi alanı veya yatırım getirisi belirterek enjekte edilen her embriyonun floresan yoğunluğunu ölçmek için görüntü J yazılımını kullanıyorum.

Seçimi düzenle'yi seçerek, değeri 100 kare piksel olarak belirtin ve ayarlayın. Kalbi ROI'nin merkezine yerleştirin ve analiz et'i seçin, ölçümleri ayarlayın ve ölçümleri ortalama gri ölçek ve alanı içerecek şekilde ayarlayın. Daha sonra ölçümü yapın, her bir görüntü seti için floresansı embriyo başına üç HPI ve 24 HPI'de ölçün ve daha sonraki işlemler için ortalama gri tonlama değerlerini bir elektronik tabloya aktarın.

İstatistiksel analiz yapmak için uygun yazılımı kullanın ve burada gösterildiği gibi öğrencinin T-testini kullanarak grupları istatistiksel anlamlılık açısından karşılaştırın. BBBS dokuz Morpho enjekte edilmiş balığa RD enjeksiyonu, embriyoların% 40'ının döllenmeden beş gün sonra eğilimli frik kistleri geliştirmesine neden oldu. Ek olarak, morfin balığı, kontrollere kıyasla 24 HPI'den sonra floresan boyayı temizleme yeteneğinde bir azalma sergiledi.

Bir kez 10 balıktan oluşan bir grup 15 dakika içinde enjekte edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı böbrek fonksiyonunun etkili bir okuması olarak mikro enjekte edilmiş bir floresan boyanın zamansal klerensini kantitatif olarak izlemek için zebra balığının optik şeffaflığından nasıl yararlanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.