Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, zebra balıklarında kantitatif bir böbrek fonksiyon testi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle 72 HPF'deki zebra balığı embriyolarının anestezi edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, embriyolar bir enjeksiyon kalıbına aktarılır ve kalpleri görüş alanının soluna gelecek şekilde yönlendirilir.

Ardından perikardiyal boşluğa rumine dextra floresan boya enjekte edilir ve bir epi-floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak kalp bölgesinin floresan görüntüleri alınır. Son olarak, bir floresan boyanın böbrek klirensi epi-floresan mikroskopi ile değerlendirilir. Bu tekniğin temel avantajı, zebra balıklarında mümkün olmayan kan veya idrar testlerine gerek duymadan zebra balığı böbrek fonksiyonunun kantitatif bir okumasını sağlamasıdır.

Bu yöntem, zebra balığı hastalık modellerinde böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi için güçlü bir araç sunar. İğneleri çıkardıktan ve metin protokolüne uygun olarak bir kalıp hazırladıktan sonra, önce balık suyu ile hazırlanmış %2'lik agar çözeltisini 90 milimetrelik bir petri kabına dökerek kalıbı dökün. Üst üste dizilmiş lam kenarlarının agar yüzeyinin altına açılı bir şekilde gömülmesini sağlayarak kalıbı petri kabının üzerine yerleştirin.

30 dakika boyunca donmaya bırakın. Slayt kalıbını çıkarın ve bir ila 25 oranında trika anestezik içeren taze balık suyu kullanın. Floresan boya ile zebra balığı enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için slayt üzerine basılmış arosları kapatın.

1,0 dış çaplı kapilerlerle kullanılmak üzere, bir basınç regülatör sistemine bağlı ve düz bir pipet tutucuya besleme yapan bir hava kompresöründen oluşan standart bir mikroenjeksiyon düzeneği kullanın. Pipet tutucusu, bir MN 33 compact içerisine yerleştirilmelidir. Metin protokolünde belirtilen standart koşullar altında zebra balıklarını muhafaza ederken; embriyoları görselleştirmek, manipüle etmek ve enjekte etmek için çelik bir taban plakasına manyetik bir standla sabitlenmiş üç eksenli kontrol mikromanipülatörü ve diseksiyon mikroskobu kullanın.

Deneye uygun şekilde yabanıl tip veya transgenik zebra balığı hatları kullanın. Balıkları rahatsız etmeden maksimum sayıda yumurta toplamak için sekiz litrelik tank başına 15 erkek ve 15 dişi şeklinde bir stok yoğunluğu sağlayın. Üreme tanklarını, toplama işleminden önceki akşam yabanıl tip stok tanklarının içine daldırın.

Toplama gününde, balıkların yumurtlaması için 30 ila 40 dakika süre tanıyın. Ardından yumurtaları toplamak ve durulamak için ince gözenekli bir süzgeç ve taze akvaryum suyu kullanın. Temizlenen yumurtaları, embriyo besiyeri içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve miyogenezi önlemek için 28,5 °C'de inkübe edin.

Döllenmeden sekiz saat sonra (HPF), canlı embriyoları minimum sıvı ile, embriyo besiyerine 1 ila 100 PTU eklenmiş taze Petri kaplarına aktarın ve 28,5 °C'de inkübasyona devam edin.

İğnenin ucunu kırmak için ince uçlu pens kullanın. Ardından, puls süresini dakika ayarına getirerek maksimuma çıkarın ve RD'yi iğnenin ucuna taşıyın. Solüsyon uca ulaştığında, tekrar milisaniye ayarına geri dönün.

Bir mikrometreyi mikroskop tablasına yerleştirin ve enjeksiyon öncesinde, basınç regülatörü ve iğne ucu ince ayarlarıyla püskürtme damlacığının boyutunu 100 mikron çapında veya 0,5 nanolitre hacminde olacak şekilde ayarlayın. Her biri beş mililitre embriyo medyumu içeren 2 adet 35 milimetrelik Petri kabı hazırlayın; bunlardan birini "trika", diğerini ise "recovery" olarak etiketleyin.

Trica olarak etiketlenmiş kaba 200 µL stok trica ekleyin. Enjeksiyona hazır olduğunda, 72 HPF'lik tek bir embriyo seçin. Trica kabına minimum miktarda sıvı aktarın ve embriyonun aktivitesini izleyin.

Embriyo anestezi edildikten sonra, onu enjeksiyon kalıbına aktarın ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde oluğa yerleştirin. Kalbi görüş alanının sol tarafına konumlandırın. RD'yi kalbe enjekte etmek için, iğne ile perikardı delin ve perikardiyal boşluğa bir nanolitre RD enjekte edin.

İğneyi geri çektikten sonra, enjekte edilen embriyoyu minimum miktarda sıvı ile toplama kabına aktarın ve bir dakika boyunca gözlemleyin. Ardından, her bir embriyoyu, PTU içeren bir mililitre taze embriyo ortamının bulunduğu 24 kuyucuklu plakaya aktarın ve uygun şekilde etiketleyin. Her deney grubu için en az 10 embriyo enjekte ettikten sonra, 28.5 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Enjeksiyondan üç saat sonra (HPI), embriyolar daha önce açıklandığı şekilde anestezi altına alınır. Ardından %3 metil selüloz içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarılır. Embriyolar nazikçe metil selülozun içine itilir ve lateral yanlarının görüntülenmesini sağlayacak şekilde yönlendirilir.

UV ışığı için 570 nanometre emisyon filtresi kullanarak embriyonun bir görüntüsünü elde edin. Embriyonun toparlanmasına izin verdikten sonra onu belirlenen kuyucuğa geri yerleştirin; tüm enjekte edilmiş embriyolar için görüntüler elde edin ve ardından 28.5 degrees Celsius sıcaklıkta inkübasyona devam edin. 24 HP'de ikinci bir görüntüleme turu gerçekleştirdikten sonra, bir görüntü açıp ilgi alanı veya ROI belirleyerek her bir enjekte edilmiş embriyonun floresan yoğunluğunu nicelleştirmek için image J yazılımını kullanırım.

Düzenleme seçimi (edit selection) ile alanı belirleyip değerini 100 kare piksel olarak ayarlayın. Kalbi ROI'nin merkezine konumlandırın ve analiz (analyze) seçeneğini seçin; ölçümleri ayarlayarak ortalama gri tonlama (mean gray scale) ve alanı (area) dahil edin. Ardından ölçümü gerçekleştirin, embriyo başına 3 HPI ve 24 HPI'daki her görüntü seti için floresan miktarını belirleyin ve ortalama gri tonlama değerlerini daha sonraki işlemler için bir hesap tablosuna aktarın.

İstatistiksel analizleri gerçekleştirmek ve grupları istatistiksel anlamlılık açısından karşılaştırmak için burada gösterildiği gibi student T-testi kullanarak uygun bir yazılım kullanın. Dokuz Morpho enjeksiyonlu balığa RD enjekte edilmesi, embriyoların %40'ında döllenmeden sonraki beşinci güne kadar prone fric kistlerinin gelişmesiyle sonuçlanmıştır. Ayrıca, morphin balıkları, kontrollere kıyasla 24 HPI sonrasında floresan boyayı temizleme yeteneğinde bir azalma göstermiştir.

10 balıktan oluşan bir grup, 15 dakika içinde enjekte edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı böbrek fonksiyonunun etkili bir göstergesi olarak, mikroenjekte edilmiş floresan bir boyanın zamansal klirensini kantitatif olarak izlemek için zebra balıklarının optik şeffaflığından nasıl yararlanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.