diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış
7 Nisan 2016
Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, herhangi bir yönde sürüklendikten sonra yeniden hizalama için basit stratejilerle bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak çeşitli gelişimsel süreçlerin hızlandırılmış analizini mümkün kılmaktır. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü canlı embriyolarda doku ve organ gelişiminin birkaç saat boyunca doğrudan gözlemlenmesine izin verir. Bu yöntemin ana avantajı, normalde lazer tarama veya ışıklı mikroskopi gibi gelişmekte olan doku ve organların hızlandırılmış kaydı için kullanılan daha karmaşık tekniklere alternatif olarak uygun fiyatlı ve kullanımı kolay olmasıdır.
Bu yöntem, süpürücü balık embriyosu ve larvalarının gelişimi sırasında meydana gelen uzaysal ve zamansal değişiklikler hakkında bilgi sağlayabilse de, erken gelişim süreçlerini ve diğer model organizmaları araştırmak için de uygulanabilir. Ayrıca, yetişkin organizmalarda kök iyileşmesi ve yenilenmesi gibi dinamik süreçleri gözlemlemek uygundur. Hazırlık aşamasında, transgenik GFP eksprese etme hattından yüksek üreme derecesine sahip yetişkin balıkları tanımlayın.
Bitki mikro enjeksiyonundan önceki öğleden sonra, beş üreme kabına beş erkek-dişi üreme balığı çifti yerleştirin. Kaplarda, erkek ve dişiyi gece boyunca çıkarılabilir bir elek ile ayrı tutun. Ertesi sabah, ışıklar yandıktan hemen sonra, yumurtalarını yemelerini önleyecek şekilde bir erkek ve dişiyi elek üzerine koyun.
Şimdi, balıkları yumurtlarken gözlemleyin. Çift yaklaşık 50 yumurta ürettiğinde, onları ayırın. Ardından, ilk enjeksiyon turu için bir Pasteur pipeti kullanarak yumurtaları embriyo suyuyla doldurulmuş bir Petrie kabına aktarın.
Eşleşen her çift için bu işlemi tekrarlayın. Ek yumurtalara ihtiyaç duyulursa, aynı çiftleşme çiftleri bir araya getirilebilir ve birkaç kez ayrılabilir. Mikro enjeksiyon için, bulaşıkların ve enjeksiyon iğnelerinin ileri düzeyde hazırlanması oldukça standart bir şekilde yapılır.
Ayrıntılar metin protokolünde bulunabilir. Hazırlanmış bir enjeksiyon iğnesi yüklemekle başlayın. Bir mikro yükleyici ucu kullanarak, iğneyi iki mikrolitre MO çalışma solüsyonu ile doldurun ve ardından iğneyi bir mikro manipülatöre takın.
Daha sonra iğne ucu açılabilir. Diseksiyon mikroskobu ile görüntülerken, ucunu sıkıştırmak için cımbız kullanın veya ucu sert bir yüzeye doğru itin. Ardından, MO çözeltisini bir gratikül üzerinde bir damla mineral yağa enjekte ederek enjeksiyon hacmini kalibre edin.
Enjeksiyonu, yaklaşık 200 pikolitre çözeltiye karşılık gelecek şekilde 75 mikron damla yapacak şekilde ayarlayın. Ardından, enjekte edilecek embriyoları hazırlayın. Yaklaşık 21 hücre aşaması embriyosunu, bitkisel kutup, oluktan 45 derecelik bir açıyla mikro enjeksiyon iğnesinin yaklaşımına doğru yönlendirilecek şekilde mikro enjeksiyon kabının oluğu boyunca düzenleyin.
Şimdi, embriyoları enjekte edin. İğne ile koryonu ve yumurta sarısını delin, ardından yüklü Morpholino çözeltisini yumurta sarısına enjekte edin. Bu, bir veya iki hücre aşamasındaki embriyolar için işe yarar.
Tüm embriyoları enjekte ettikten sonra, onları toplamak için geniş delikli bir Pasteur kullanın. Enjekte edilen embriyoları embriyo suyu ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın ve 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Öğleden sonra daha sonra ölü embriyoları sifonlayın ve embriyo suyunu değiştirin.
Ertesi sabah, embriyolar gastrulasyondan geçtikten sonra, sularını eser miktarda PTU içeren embriyo suyu ile değiştirerek melanizasyonlarını inhibe edin. Dikkatli olun, PTU gastrulasyondan önce uygun gelişimi bozacaktır. Daha sonra, istenen gelişim aşamasında, embriyoları keskin cımbızla dekoryonlayın.
Mikroskobu kullanarak, bir cımbızla koryonu tutun ve ikinci bir cımbızla koryonun diğer tarafını tutmaya çalışın. Ardından, embriyoyu bozmadan cımbızı dikkatlice ayırın. Daha sonra, embriyoları Trikain ile uyuşturun ve embriyoları ve agarozu, cam tabanlı bir mikro tabağa yerleştirilmiş 15 mikronluk bir yer değiştirme ızgarasına gömmeye devam edin.
Daha sonra, 1.5 mililitrelik reaksiyon tüplerine bir mililitre erimiş agaroz alikotu yükleyin. Tüpleri 36 santigrat dereceye ayarlanmış ısı bloklarına koyun ve soğumalarını bekleyin. Daha sonra, geniş delikli bir pipet kullanarak, bir embriyoyu mikro tabağa aktarın.
Fazla embriyo suyunu sifonlayın ve embriyoyu agaroz ile kaplayın. Agaroz hala sıvı iken, embriyoları yönlendirmek için iki küçük pipet ucu kullanın. İlgilenilen yapıyı, bu durumda pronephros'u, cam tabana mümkün olduğunca yakın ve ızgaraya yakın bir yere yerleştirin.
Izgara, ilgilenilen yapıyı kaplamamalıdır. Farklı mikro tabaklara dört adede kadar embriyo gömmek ve en iyisini görüntülemeyi planlamak avantajlıdır. Doğru gömme biraz pratik gerektirir.
Agaroz hala sıvı iken, embriyonun istenen pozisyonda yönlendirilmesi gerekir. Cam tabana yakın bir pronephros ise ve yer değiştirme ızgarasına uygun bir mesafede. Agarozu rutin olarak kontrol edin.
Embriyoları tutacak kadar sertleştiğinde, iki ila üç dakika daha oturmasına izin verin. Daha sonra, gömülü embriyoyu eser miktarda PTU ve trikat içeren embriyo suyu ile kaplayın. Fazla embriyo suyunu boşaltın veya sifonlayın ve buharlaşmayı önlemek için kapağı kilitleyin.
Sonuçta herhangi bir hava kabarcığı olmamalıdır. Embriyo artık cam alt kısım objektif merceğe bakacak şekilde görüntülenebilir. Atlamalı görüntüler oluşturmak için hazırlığı kullanarak, örneğin, birkaç saat boyunca periyodik olarak Z-yığını görüntüleri çekerek, odak kaymasını düzeltmek gerekir.
Mümkünse, bir otomatik odaklama stratejisi uygulayın. Yazılım kontrolündeki otomatik odaklama seçeneğini değiştirin. Referans kanalı için, foto toksisiteyi en aza indirmek için iletilen ışık parlak alan kanalını seçin.
Otomatik odaklamanın düzgün çalışması için yeterince büyük bir örneğe bağlı arama aralığı seçmek de önemlidir. Görüntüleri toplamadan önce, basılı ızgaranın belirli bir noktasını yazılımın artı işaretlerinde ilgilenilen yapıya yakın konumlandırın, ardından bu konumu bir ekran görüntüsü kullanarak kaydedin. Ardından, her görüntüleme zaman aralığı sona ermeden hemen önce, ekran görüntüsüne bakın ve otomatik odaklama kullanımda değilse sahnenin konumunu ve odağı yeniden ayarlayın.
Sunulan yöntem, bir transgenik zebra balığı hattının WT1A morfize embriyolarında böbrek gelişimini analiz etmek için kullanıldı. Erken nefrojen sırasında, bu çizgi, böbrek progenitörlerinin ortaya çıktığı ara mezodermde ve daha sonra oluşturan tübüllerde ve nefron primordia'da gelişme sırasında yeşil floresan seçti. Hızlandırılmış görüntüleme, kontrol Morpholino enjekte edilen embriyolarda normal nefrogenezi ortaya çıkardı.
Döllenmeden 20 saat sonra, gelişmekte olan pronefrik tübüller görüldü. Ön uçlarında, oluşan nefron primordia'yı temsil eden küresel bir hücre birikimi tespit edilebilir. Sonraki saatlerde, tübüller ve nefron primordia büyüdü ve primodia orta hatta kaynaşmaya başladı.
Buna karşılık, mutantlarda nefrogenez ciddi şekilde bozulmuştur. GFP pozitif tübüler yapılar döllenmeden 20 saat sonra görünür olmasına rağmen, dağınık ve az gelişmişti. Hızlandırılmış görüntüleme, nefron primorgia'nın hiç oluşmadığını ve gelişmekte olan pronefronların dışında bulunan çarpıcı sayıda floresan hücrenin ventral olarak göç ettiğini ve pronefrik alanı terk ettiğini gösterdi.
Bu protokolü denerken, sıcaklık kontrolü veya buharlaşma önleyici tablolar gibi ek ekipmanların olmamasının, sapmalar ve yeniden ayarlamalar için düzenli kontroller gerektirdiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, görüntü embriyoları, hücrelerin, dokuların belirli bileşenlerini tanımlamak veya gen ekspresyonunu değerlendirmek için immünohistokimya, incetrohipertizasyon veya gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemleri gerçekleştirmek için işlenebilir.
Genel Bakış
Bu yöntem, zebra balığı embriyolarında organ gelişiminin zaman süreci analizini bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak sağlar. Dokular ve organ gelişiminin birkaç saat boyunca doğrudan gözlemlenmesini sağlayarak gelişim biyolojisi hakkında bilgiler verir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Zebra Balığı Embriyolojisi
- Mikroskop Teknikleri
Arka Plan
- Zaman süreci görüntüleme, gelişim süreçlerinin incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler karmaşık ve pahalı olabilir.
- Bu yöntem daha basit ve uygun maliyetli bir alternatif sunar.
- Çeşitli model organizmalara uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Canlı embriyolardaki organ gelişiminin gözlemlenmesini kolaylaştırmak.
- Kolay kullanımlı ve uygun maliyetli bir yöntem sağlamak.
- Araştırmacıların dinamik gelişim süreçlerini araştırmasına olanak tanımak.
Kullanılan Yöntemler
- Üreme için yetişkin zebra balıklarının hazırlanması.
- Embriyolara Morpholino çözeltilerinin mikro enjeksiyonu.
- Görüntüleme için embriyoların agarose'a gömülmes.
- Floresan diseksiyon mikroskobu ile zaman süreci görüntüleme.
Ana Sonuçlar
- Zebra balığı embriyolarında organ gelişiminin başarılı bir şekilde gözlemlenmesi.
- Yöntemin zaman süreci görüntüleme için etkinliğinin gösterilmesi.
- Gelişimin mekânsal ve zamansal değişimleri hakkında bilgiler sağlanması.
- Diğer gelişim süreçlerine ve organizmalara uygulanabilirliğin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Bu yöntem, gelişim biyolojisi araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Zaman içinde canlı embriyoları gözlemlemeyi basitleştirir.
- Çeşitli gelişimsel fenomenleri incelemek için yeni yollar açar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method provides an accessible approach for time-lapse imaging of organogenesis in zebrafish embryos, enabling direct observation of developmental processes without requiring complex or expensive microscopy infrastructure. By supporting longitudinal imaging of tissue dynamics in a vertebrate model, it facilitates early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique offers a cost-effective alternative for generating quantitative, reproducible data on morphogenetic events relevant to disease modeling and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in kidney development by visualizing spatial and temporal alterations in nephrogenesis upon wt1a knockdown.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through direct visualization of pronephric tubule formation and nephron primordia fusion in live embryos.
- Predictive Value: Facilitates assessment of phenotypic severity in morphant models, aiding in target confidence evaluation for renal disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative z-stack and time-lapse readouts of fluorescently labeled kidney structures for comparative analysis between control and perturbed conditions.
- Operational Value: Utilizes a fluorescence dissecting microscope with autofocus and relocation grids to minimize drift, enhancing reproducibility across imaging sessions.
- Assay Readiness: Produces standardized imaging outputs that can be used to establish baseline phenotypes for compound screening or genetic modifier studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables observation of conserved developmental processes in zebrafish, a disease-relevant system for modeling human kidney disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows tracking of cellular migration and tubule morphogenesis defects, providing insight into off-target or pathway-specific effects of genetic perturbations.
- Preclinical Alignment: Supports progression from discovery to preclinical validation by establishing dose- or time-dependent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for renal pathways where dynamic tissue imaging informs mechanism of action and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports functional validation of targets like wt1a by enabling real-time observation of downstream developmental consequences in a living system.
- Screening: Generates reproducible fluorescence-based readouts suitable for assessing compound effects on kidney morphogenesis in a vertebrate context.
- Analytics: Provides quantitative measurements of tubule length, primordia formation, and cellular localization over time, enabling objective comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects early developmental phenotypes to later-stage organ dysfunction, supporting biomarker-aligned assessment of renal toxicity or repair.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable imaging capability that can be applied across multiple developmental models and organ systems with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking genetic perturbation to observable developmental defects in a physiological context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through hardware-based drift correction (autofocus, relocation grids) and standardized embryo preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, visual confirmation of pathway modulation in a whole-organism assay.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on severity and specificity of developmental phenotypes observed in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and embryo staging for successful application.
- Dependent on fluorescence dissecting microscope with z-stack capability and software supporting autofocus and stage repositioning.
- Necessitates standardization of agarose embedding and embryo orientation to ensure consistent imaging quality across users and sessions.
- Adaptation to other organs or models may require changes in transgenic reporters, injection timing, or developmental staging.
- Practical limitations include lower throughput compared to automated systems and manual effort required for drift monitoring when autofocus is not used.
