diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

Bu prosedürün genel amacı, herhangi bir yöne doğru kayma meydana geldikten sonra yeniden hizalama için basit stratejiler kullanan floresan bir diseksiyon mikroskobu ile çeşitli gelişimsel süreçlerin zaman ayarlı (time-lapse) analizini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, yaşayan embriyolardaki doku ve organ gelişiminin birkaç saat boyunca doğrudan gözlemlenmesine olanak tanıdığı için gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, gelişmekte olan doku ve organların zaman ayarlı kaydı için normalde kullanılan lazer tarama veya aydınlatmalı mikroskopi gibi daha karmaşık tekniklere kıyasla uygun maliyetli ve kullanımı kolay bir alternatif olmasıdır.

Bu yöntem, sweeper balığı embriyosu ve larvalarının gelişimi sırasında meydana gelen mekansal ve zamansal değişimlere dair bilgiler sağlayabilse de, erken gelişim süreçlerini ve diğer model organizmaları incelemek için de uygulanabilir. Ayrıca, kök iyileşmesi ve rejenerasyonu gibi yetişkin organizmalardaki dinamik süreçleri gözlemlemek için uygundur. Hazırlık aşamasında, transgenik GFP eksprese eden hattan yüksek reprodüktif kapasiteye sahip yetişkin balıkları belirleyin.

Bitki mikro-enjeksiyonundan önceki gün öğleden sonra, beş adet üretme kabına beş çift erkek-dişi üreme balığı yerleştirin. Kaplarda, erkek ve dişiyi gece boyunca çıkarılabilir bir süzgeç ile ayrı tutun. Ertesi sabah, ışıklar yanar yanmaz, yumurtalarını yemelerini önleyecek olan süzgecin üzerinde bir erkek ve bir dişiyi bir araya getirin.

Şimdi, balıklar yumurtlarken gözlemleyin. Çift yaklaşık 50 yumurta ürettiğinde, onları ayırın. Ardından, ilk enjeksiyon aşaması için yumurtaları bir Pasteur pipeti kullanarak embriyo suyuyla dolu bir Petri kabına aktarın.

Bu işlemi her çiftleşmiş çift için tekrarlayın. Ek yumurtalara ihtiyaç duyulursa, aynı çiftleşme çiftleri birkaç kez bir araya getirilebilir ve ayrılabilir. Mikroenjeksiyon için kapların ve enjeksiyon iğnelerinin ön hazırlığı oldukça standart bir şekilde yapılır.

Detaylar metin protokolünde bulunabilir. Hazırlanmış bir enjeksiyon iğnesinin doldurulmasıyla başlayın. Bir mikro-yükleyici uç kullanarak iğneyi 2 µL MO çalışma çözeltisi ile geri doldurun ve ardından iğneyi bir mikro-manipülatöre takın.

Ardından, iğne ucu açılabilir. Diseksiyon mikroskobu ile izlerken, ucun açılması için cımbızla sıkıştırın veya ucu sert bir yüzeye bastırın. Daha sonra, MO çözeltisini bir gratikül üzerindeki mineral yağı damlasına enjekte ederek enjeksiyon hacmini kalibre edin.

Yaklaşık 200 picoliter çözeltiye karşılık gelecek 75 mikronluk damlalar oluşturacak şekilde enjeksiyonu ayarlayın. Ardından, enjekte edilecek embriyoları hazırlayın. Yaklaşık 21 hücre aşamasındaki embriyoları, vegetal kutup mikroenjeksiyon iğnesinin yaklaştığı yöne bakacak şekilde mikroenjeksiyon kabının oluğu boyunca düzenleyin; iğne, olukla 45 derecelik bir açı yapmalıdır.

Şimdi embriyoları enjekte edin. İğne ile koriyonu ve vitellusu delin, ardından yüklü Morpholino çözeltisini vitellusa enjekte edin. Bu işlem, tek veya iki hücreli aşamadaki embriyolar için uygundur.

Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, bunları toplamak için geniş ağızlı bir Pasteur pipeti kullanın. Enjekte edilen embriyoları embriyo suyu ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın ve 28.5 °C'de inkübe edin. Öğleden sonra geç saatlerde, ölü embriyoları sifonla çekerek uzaklaştırın ve embriyo suyunu yenileyin.

Ertesi sabah, embriyolar gastrulasyon sürecini tamamladıktan sonra, sularını eser miktarda PTU içeren embriyo suyu ile değiştirerek melanizasyonlarını inhibe edin. Dikkatli olun, PTU gastrulasyon öncesinde normal gelişimi bozar. Daha sonra, istenen gelişim aşamasında, embriyoları sivri uçlu penslerle dekoryone edin.

Mikroskop kullanarak, koriyonu bir cımbızla tutun ve koriyonun diğer tarafını ikinci bir cımbızla tutmaya çalışın. Ardından, embriyoya zarar vermeden cımbızları dikkatlice birbirinden ayırın. Daha sonra, embriyoları Tricaine ile anestezi edin ve ardından embriyoları ve agarozu, lamel cam tabanlı bir mikro kap içerisine yerleştirilmiş 15 mikronluk bir yer değiştirme ızgarasına gömme işlemine geçin.

Ardından, eritilmiş agarozun bir mililitrelik alikotlarını 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine yükleyin. Tüpleri 36 °C'ye ayarlanmış ısıtma bloklarına yerleştirin ve soğumalarını bekleyin. Sonra, geniş ağızlı bir pipet kullanarak bir embriyoyu mikro kaba aktarın.

Fazla embriyo suyunu sifonla çekin ve embriyonun üzerini agaroz ile kaplayın. Agaroz henüz sıvı haldeyken, embriyoları yönlendirmek için iki küçük pipet ucu kullanın. İlgilenilen yapıyı, bu durumda pronefrosu, mümkün olduğunca cam tabana yakın ve ızgaranın hemen yanına konumlandırın.

Izgara, ilgilenilen yapının üzerine gelmemelidir. Farklı mikro kaplara dört adede kadar embriyo gömmek ve bunlar arasından en iyisini görüntülemeyi planlamak avantajlıdır. Doğru gömme işlemi biraz pratik gerektirir.

Agaroz henüz sıvı haldeyken, embriyo istenen konuma getirilmelidir. Pronefrozun cam tabana yakın ve yeniden konumlandırma ızgarasına uygun bir mesafede olduğundan emin olun. Agarozu düzenli olarak kontrol edin.

Embriyoları tutabilecek kadar sertleştiğinde, iki ila üç dakika daha dinlenmeye bırakın. Ardından, gömülü embriyonun üzerini eser miktarda PTU ve trikayn içeren embriyo suyu ile kaplayın. Fazla embriyo suyunu dökün veya sifonla çekin ve buharlaşmayı önlemek için kapağı kilitleyin.

Sonuçta hiç hava kabarcığı olmamalıdır. Embriyo artık cam taban objektif lensine bakacak şekilde görüntülenebilir. Hazırlığı timelapse görüntüler oluşturmak için kullanırken (örneğin, birkaç saat boyunca periyodik olarak Z-yığını görüntüleri alarak), odak kaymasının düzeltilmesi gereklidir.

Mümkünse, bir otomatik odaklama stratejisi uygulayın. Yazılım kontrolündeki otomatik odaklama seçeneğini etkinleştirin. Fototoksisiteyi en aza indirmek için referans kanal olarak iletim ışığı parlak alan kanalını seçin.

Otomatik odaklamanın düzgün çalışması için numuneye bağlı olarak yeterince geniş bir arama aralığı seçmek de esastır. Görüntüleri toplamadan önce, basılı ızgaranın belirli bir noktasını, yazılımdaki artı göstergenin merkezinde yer alacak şekilde ilgilenilen yapının yakınına konumlandırın ve ardından bu konumu bir ekran görüntüsü alarak kaydedin. Daha sonra, her görüntüleme zaman aralığı bitmeden hemen önce, eğer otomatik odaklama kullanılmıyorsa ekran görüntüsünü referans alın ve sahnenin konumunu ve odağı yeniden ayarlayın.

Sunulan yöntem, transgenik bir zebra balığı hattının WT1A morfenli embriyolarında böbrek gelişimini analiz etmek için kullanılmıştır. Erken nefrojenez sırasında bu hat, böbrek öncüllerinin ortaya çıktığı ara mezodermde ve daha sonra gelişim sürecinde oluşan tübüllerde ve nefron primordiyumlarında yeşil floresans göstermiştir. Time-lapse görüntüleme, kontrol Morfolino enjekte edilen embriyolarda normal nefrojenez olduğunu ortaya çıkarmıştır.

Döllenmeden 20 saat sonra, gelişmekte olan pronefrik tübüller görünür hale geldi. Bunların ön uçlarında, oluşan nefron primordiyumlarını temsil eden küresel bir hücre birikimi tespit edilebildi. Sonraki saatlerde, tübüller ve nefron primordiyumları büyüdü ve primordiyumlar orta hatta birleşmeye başladı.

Buna karşılık, mutantlarda nefrojenez ciddi şekilde bozulmuştur. Döllenmeden 20 saat sonra GFP pozitif tübüler yapılar görülse de, bunlar yayılmış ve gelişmemişti. Zaman ayarlı görüntüleme, nefron primordiyumlarının hiçbir zaman oluşmadığını ve gelişmekte olan pronefronların dışında yer alan dikkat çekici sayıda floresan hücrenin ventral yönde göç ederek pronefrik alanı terk ettiğini göstermiştir.

Bu protokol uygulanırken, sıcaklık kontrolü veya buharlaşma önleyici tablalar gibi ek ekipmanların yokluğunda, sapmaların düzenli olarak kontrol edilmesi ve yeniden ayarlamalar yapılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, hücrelerin veya dokuların spesifik bileşenlerini belirlemek ya da gen ekspresyonunu değerlendirmek amacıyla, görüntülenen embriyolar immünohistokimya, in situ hibridizasyon veya gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemlerle işlenebilir.