In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA'nın Değiştirilmiş

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerde protein ekspresyonunun indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA'nın in vitro sentezidir. Bu, önce plazmit ekinin veya kodlayan DNA dizisinin amplifiye edilmesi ve polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak 120 timidinin bir poli T kuyruğunun eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, üretilen DNA'nın poli adenin kuyrukları ile mRNA'ya in vitro transkripsiyonudur.

Daha sonra, şablon DNA, in vitro transkripsiyon reaksiyon karışımının D'S işlemi ile çıkarılır. Son adım, beş ana fosfatı uzaklaştırmak için üretilen mRNA'nın Antarktika fosfataz muamelesidir. Sonuçta, hücreler üretilen mRNA, lipit kompleksleri tarafından transfekte edilir.

Floresan mikroskobu ve akış sitometrisi analizi, hücrelerde gelişmiş GFP sentezini göstermek için kullanılır. Bu tekniğin viral transfect gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, onkogenez riskini önleyen konak hücre genomuna entegrasyon eksikliğidir. Bu yöntem, hücrelerde eksik veya kusurlu proteinlerin üretilmesine yardımcı olabilir ve genetik bozuklukların aşılama tedavisi için kullanılabilir.

Ve rejeneratif tıp alanında, prosedürü göstermek laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu prosedürün başlamasından önce, gerekli kodlama DNA dizilerini veya CDS'yi içeren plazmitler, e coli'de amplifiye edildi ve protokol metninde tarif edildiği gibi izole edildi. Bu örnekte, ilgilenilen CDS, EGFP'nin CDS'sini aynı anda yükseltmek ve bir poli detay eklemek için geliştirilmiş yeşil floresan proteini veya EGFP'dir.

Protokol metninde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir PCR karışımı hazırlayın. PCR tüpünü bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve protokol metninde açıklanan PCR döngü protokolünü çalıştırın. PCR reaksiyonu tamamlandığında, piyasada bulunan bir PCR saflaştırma kiti kullanarak PCR reaksiyonunu temizleyin ve DNA'yı 20 mikrolitre nükleaz içermeyen su kullanarak seyreltin.

PCR ürününün kalitesini kontrol etmek için DNA jel elektroforezi gerçekleştirin ve DNA bantlarını bir görüntüleme sisteminde görselleştirin. İn vitro transkripsiyon veya IVT sırasında yaklaşık 1.100 baz çifti uzunluğunda berrak bir DNA bandı tespit edilmelidir. Daha önce üretilen DNA, mRNA'ya kopyalanacaktır.

NTP kapağı analog karışımını burada gösterildiği gibi hazırlayın. NTP kapağı analog karışımını girdap yaparak iyice karıştırın. Ardından aşağı çevirin IVT reaksiyon karışımını bu tabloda açıklandığı gibi kısaca birleştirin.

IVT reaksiyon karışımını hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, karışımı tüpün dibinde toplamak için PCR tüpünü kısa bir süre santrifüjleyin. IVT reaksiyon karışımını bir termo karıştırıcıda üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Üç saat sonra, IVT reaksiyon karışımına bir mikrolitre DNA ekleyerek şablon DNA'yı çıkarın. İyice karıştırın ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Reaksiyon karışımını bir RNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve modifiye edilmiş MR NA'yı spin kolon zarından iki kez 40 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile seyreltin, IVT tarafından üretilen modifiye mRNA, bağışıklık aktivasyonuna yol açabilen beş asal tri fosfatı uzaklaştırmak için fosfataz ile muamele edilmelidir.

Bu prosedüre başlamak için, 79 mikrolitre saflaştırılmış mRNA çözeltisine dokuz mikrolitre 10 x Antarktika fosfataz reaksiyon tamponu ekleyin. Daha sonra, iki mikrolitre Antarktika fosfataz ekleyin ve numuneyi yavaşça karıştırın. Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, reaksiyon karışımını bir RNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve modifiye edilmiş mRNA'yı spin kolon zarından iki kez 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile seyreltin. Modifiye edilmiş mRNA'nın konsantrasyonunu ölçtükten sonra, nükleaz içermeyen su ekleyerek konsantrasyonu mikrolitre başına 100 nanograma ayarlayın. RNA jel elektroforezi ile sentezlenen modifiye mRNA'nın kalitesini kontrol edin ve bir UV trans aydınlatıcı üzerindeki merdiveni ve mRNA yasaklarını görselleştirin.

Yaklaşık 1.100 baz çifti uzunluğunda berrak bir mRNA bandı tespit edilmelidir. HEC 2 9 3 hücrelerini, iki kez kaplayarak sentezlenmiş modifiye mRNA ile transfeksiyon için hazırlayın. 12 Kuyulu bir plakanın oyuğu başına beş hücreyi ortalayın, hücreleri bir hücre inkübatöründe gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin Ertesi gün, hücrenin% 80 ila 90 birleşmeye ulaşmış olması gerekir.

Transfeksiyon için lipo pleksus oluşturun. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun transfekte edilmesi için tüm kuyucuklar için yeterli transfeksiyon karışımı hazırlayın, 2.5 mikrogram modifiye mRNA, iki mikrolitre lipid transfeksiyon reaktifi ve 473 mikrolitre opt one gerektirir. Serum ortamını azaltın.

Negatif kontrol olarak pipetleme yaparak bileşenleri nazikçe karıştırın. Mr.NA içermeyen bir transfeksiyon karışımı hazırlayın, lipo pleksler oluşturmak için transfeksiyon karışımlarını oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Transfeksiyon için.

Hücreleri başına 500 mikrolitre DPBS ile yıkayın. 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre transfeksiyon karışımı ekleyin, hücreleri 37 santigrat derecede dört saat ve dört saat sonra% 5 karbondioksitte inkübe edin, transfeksiyon karışımını aspire edin ve bir mililitre tam hücre kültürü ekleyin. Her kuyucuktaki hücrelere orta.

Hücreleri hücre inkübatöründe 24 saat inkübe edin. Daha sonra, hücreleri akış sitometrisine hazırlamak için bir floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin floresan mikroskobik analizini gerçekleştirin. Hücre kültürü ortamını kuyucuklardan çıkarın ve her bir kuyuyu kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'lerden biriyle yıkayın.

Hücreleri hücre kültürü plakalarının yüzeyinden ayırmak için oyuk başına 500 mikrolitre TRIPSIN EDTA ekleyin. Daha sonra, ayrılan hücreleri 300 kez G oda sıcaklığında beş dakika boyunca tryin santrifüjünü inaktive etmek için kuyu başına 500 mikrolitre tripsin nötralize edici solüsyon ekleyin. Supinat Reese'i çıkardıktan sonra, hücre damağını 150 mikrolitre hücre fiksasyon solüsyonunda askıya alın ve hücre süspansiyonunu bir akış sitometri tüpüne aktarın.

Floresan yoğunluğunun geometrik ortalamasını kullanarak EGFP eksprese eden hücrelerin yüzdesini ve floresan yoğunluğunu analiz edin. Zaman içinde protein ekspresyonu, protokol metninde açıklandığı gibi, transfeksiyondan bir, iki ve üç gün sonra EGFP eksprese eden hücrelerin akış sitometrisi analizi ile de değerlendirilir, üretilen EGFP mRNA'nın işlevselliği HEC 2 9 3 hücrelerinin transfeksiyonu ile test edildi. Hücrelerde EGFP üretimi, floresan mikroskobu kullanılarak transfeksiyondan 24 saat sonra tespit edildi.

Burada, hücrelerin bir floresan görüntüsünün yanında hücrelerin bir yüz kontrast görüntüsü gösterilir. Hücrelerdeki EGFP ekspresyonu, transfeksiyondan 24 saat sonra akış sitometrisi ile de tespit edildi. Pembe çizgi, mRNA, transfeksiyon içermeyen hücreleri temsil eder ve mavi çizgi, EGFP pozitif hücreleri temsil eder.

EGFP mRNA transfeksiyonundan sonra, ölçülen tüm hücrelerin% 93.91'i pozitifti ve floresan yoğunluğunun geometrik ortalaması 720.16 idi. HC 2 93 hücrelerinde protein ekspresyonunun süresi, mRNA'dan bir, iki ve üç gün sonra EGFP ekspresyonu ölçülerek değerlendirildi. Transfeksiyon protein ekspresyonu, transfeksiyondan 24 saat sonra hücrelerde en yüksekti.

Miktar, ertesi gün her gün 1.6 kat azaltıldı, ancak üç gün sonra bile, hücreler bir kez ustalaştıktan sonra EGFP içeriyordu. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde iki günde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerde istenen protein ekspresyonunun indüksiyonu için stabilize modifiye MRNA'nın nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.