Name: In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNAnın Değiştirilmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin insan hücrelerinde protein ifadesini uyarmak için modifiye mRNA sentezleme yöntemini. Bu teknik plazmid amplifikasyonu ve in vitro transkripsiyon adımlarını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje Baden-Württemberg, Almanya&#39;nın Avrupa Sosyal Fonları tarafından finanse edildi.

Gerekli olan DNA dizinlerini Kodlama içeren plazmidlerin 1. Büyütme (CDS) <ol><li> Ön oda sıcaklığına getirilmiş ve dönüşüm kiti dahildir SOC ortamında, 37 ° C&#39;de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB agar plakaları. 42 ° C su banyosu dengeye getirin. </li><li> Kimyasal bileşen E bir şişe çözülme buz üzerinde coli. </li><li> Kimyasal bileşen E. şişe içine CDS içeren plazmidin 1-5 ul (100 ng, 10 pg) ekleyin coli ve hafifçe karıştırın. Pipetleme hücreleri karışmaz. Plasmidlerini ekledikten sonra, yavaşça tüp dokunarak karıştırın. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı. </li><li> Isı şok E. çalkalamadan bir su banyosu içinde 42 ° C sıcaklıkta 30 sn için E. coli. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde şişe yerleştirin. </li><li> E. önceden ısıtılmış SOC ortamında 250 ul ekleyin E. coli bakteriyel bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 1 saat süre ile, 300 rpm&#39;de yatay bakteri sallayın. </li><li><html> 100 ul ve önceden ısıtılmış LB agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı 150 ul yay plakalar ters çevirin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Koloniler görünür hale sonra, 100 ug / ml ampisilin ile 5 ml LB ortamı içeren 15 ml&#39;lik bir kültür tüpü içine, her plakadan tek bir koloni inoküle. Kültür late Günlük veya durağan faz içinde yer alana kadar 300 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe. </li><li> Dönüşmüş E. coli, uzun süreli depolama için E. coli, pipeti dondurarak saklamaya uygun viallerin içine% 100 gliserol, 75 ul. Bakteri kültürüne (dondurulmuş bir stoku,% 25 gliserol içeren) 225 ul eklenir, iyice karıştırılır ve -80 ° C &#39;de cryovial saklayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti ile birlikte istenen CDS içeren plazmidler izole edin. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, plazmid konsantrasyonunun belirlenmesi. </li><li> 20 ul alikotları hazırlanması ve uzun bir süre boyunca -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol>Plazmid Ek&#39;lerin BORSASI &quot;&gt; 2. Amplifikasyon ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu Poli T-kuyruk ekleme (PCR) <ol><li> Not: PCR kullanılarak amplifiye edilir, in vitro transkripsiyon (IVT), burada söz konusu CDS EGFP için DNA şablonu elde etmek için. Aynı zamanda, 120 timidinler (T) &#39;in bir poli T-kuyruk T 120 uzantılı bir ters primer kullanılarak inserte eklenmiştir. Böylece, oluşturulan mRNA&#39;lar IVT sonra tanımlanmış bir uzunluğa sahip olan bir poli A kuyruğu elde edilir. </li><li> Tablo 1 &#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR ile bir karışım hazırlayın. </li><li> Iyice reaksiyon karışımı karıştırın. Not: PCR ürünü, 4-5 IVT reaksiyonlarında kullanılabilir. IVT için DNA şablonu miktarını artırmak için, PCR karışımı, toplam hacmi arttırılabilir. Birkaç PCR tüpleri, her biri 100 ul PCR karışımı, PCR ürünü yeterli bir verim elde etmek için kullanılabilir. </li><li> Bir PCR PCR tüpleri yerleştirin ve PCR çevrim protokolü (Tablo 2) kullanılarak PCR çalıştırın. </li><li> P temizleyin20 ul nükleaz içermeyen su kullanılarak DNA üreticinin talimatlarına ve elüte göre olan bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak CR reaksiyonu. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, DNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. Not: Saptanan DNA konsantrasyonu yaklaşık olarak 300 ug / ml&#39;dir. Böylece, beklenen toplam miktarının ~ 6 mg olmalıdır. Diğer proteinler için DNA miktarı CDS uzunluğuna bağlı olarak farklı olabilir, plazmid miktarı PCR, primer tavlama sıcaklığı ve devir sayısı için de kullanılır. </li><li> Uzun bir süre için, -20 ° C&#39;de DNA Freeze veya IVT doğrudan kullanın. </li></ol> 3. Kontrol Adım: PCR Ürünü Kalitesi <ol><li> DNA jel elektroforezi ile PCR ürününün kalitesini kontrol edin. </li><li> Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin. </li><li> Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin. </li><li> , Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat bekleyin. </li><li> Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin. </li><li> 12 ul bir toplam hacimde 2 ul, 6x yükleme tamponu ile 80-10,000 bp&#39;lik bir DNA merdiven 2 ul (200 ng) ve PCR ürünü, 200 ng her karıştırın. </li><li> Dikkatlice agaroz jel kuyu içine DNA örnekleri yükleyin. </li><li> Tampon olarak 1 x TBE kullanarak 1 saat boyunca 100 V&#39;ta agaroz jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> Bir görüntüleme sistemi (Şekil 2) DNA bantları görselleştirmek. </li></ol> 4. in vitro transkripsiyon (IVT) <ol><li> Not: PCR&#39;den sonra plasmit amplifiye edilir ve bir poli T kuyruğu eklenmiştir. IVT sırasında genetik bilgi haliyle RNA&#39;nın DNA&#39;dan transkribe edilmektedir. Oluşturulan mRNA transkript hücrelerde proteinlerin üretilmesi için kullanılır. </li><li> Bir Rnase d çalışma alanı ve pipetler temizleyinecontamination çözeltisi. Reaksiyon RNases karışır sık ​​sık kullanımı, PCR, temiz ve steril çift filtre pipet uçları ve kirlenmeyi en aza indirmek için eldiven değiştirmek. </li><li> Tablo 3&#39;te tarif edildiği gibi NTP / kap benzeri bir karışım hazırlayın. </li><li> Vorteks ile iyice NTP / kap analog karışımı karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün. </li><li> Tablo 4&#39;te tarif edildiği gibi IVT, reaksiyon karışımı bir araya getirin. </li><li> Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyice IVT reaksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra tüpün altındaki karışımın toplanması için kısa bir süre için PCR tüpü santrifüj. </li><li> Termomikser içinde 3 saat 37 ° C&#39;de inkübe edilir. NOT: En uygun kuluçka zamanı ekler ve belirli bir şablon transkripsiyonel etkinliğinin uzunluğuna bağlıdır. Kısa uçlar (nt &lt;500), bir uzun bir enkübasyon süresi avantajlı olabilir. Bir zaman ders deney maksimum verim için optimum inkübasyon süresini belirlemek için yapılabilir. Bu nedenle, exampl için, IVT reaksiyonları kurmake 1, 2, 3, 4, 6 saat, ve gece boyunca kuluçka için ve mRNA miktarının belirlenmesi. EGFP mRNA üretimi için in vitro transkripsiyon kinetiği Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> , Şablon DNA kaldırmak IVT Reaksiyon karışımına DNase 1 ul (2 U / ml) ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 40 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA&#39;nın tasfiye edilir. Not: bulgulanan RNA konsantrasyonu, yaklaşık 1.500 ug / ml arasındadır. Böylece, beklenen toplam miktarı, ~ 120 ug olması gerekir. Diğer proteinler için sentez mRNA miktarı CDS uzunluğu ve IVT için kullanılan PCR ürününün miktarına bağlı olarak değişebilir. </li></ol> Antarktika fosfataz ile saflaştırılmış mRNA 5. Tedavi <ol><li> Not: üretilen mRNA 5 çıkarmak için fosfataz ile işlemden geçirildi &#39;tri-Bağışıklık aktifleşmesi Rig-I tarafından tanınan ve kurşun olabilir fosfatlar. Ayrıca, fosfotaz muamelesine kendinden ligasyon reaksiyonunda yeniden daire haline engeller. </li><li> Saflaştırılmış mRNA solüsyonuna 79 ul 10x Antarktika fosfataz reaksiyon tampon maddesi 9 ul ekleyin. Daha sonra, Antarktika fosfataz (5 U / ul), 2 ul ekleyin ve yavaşça örnek karıştırın. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de, reaksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 50 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA&#39;nın tasfiye edilir. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, modifiye mRNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. Giriş 260 nm / 280 nm&#39;de absorbans, (A 260 / A 280), ≥ 1.8 ve 260 oranı / 230 saflığa işaret eden, 2.0 olduğundan emin olun. NOT: beklenen toplam verim, hangi sufficie olduğunu, yaklaşık 90 ug olmalınt yaklaşık 36 mRNA Transfeksiyonlar için. </li><li> Nükleaz içermeyen su ilave edilerek, 100 ng / ul mRNA konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> -80 ° C&#39;de Transfeksiyonlar ve mağaza için gerekli olan tek kullanımlık kısma modifiye mRNA&#39;nın kısım. Birden fazla donma ve çözülme döngüleri kaçının. Düzgün hazırlanmış ve mRNA yıllardır istikrarlı saklanır. Çalışma sırasında, her zaman buz üzerinde modifiye mRNA tutun. </li></ol> 6. Kontrol Aşama: Sentezlenen Modifiye mRNA&#39;nın Kalitesi <ol><li> RNA, jel elektroforezi ile modifiye mRNA&#39;nın kalitesini kontrol edin. </li><li> Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin. </li><li> Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin. </li><li> Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel soli oluncaya kadar yaklaşık 1 saat beklemekasitleştirildi. </li><li> Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin. </li><li> 0.5-10 kb RNA merdiveni 3 ul (3 ug) ve mRNA, 10 uL bir toplam hacimde 7 ul yükleme tamponu ile değiştirilen her sentezlenir 200 ng karıştırın. Yükleme tamponu kompozisyonu, Tablo 5&#39;te tarif edilmektedir. </li><li> 10 dakika süreyle 70 ° C de merdiven ve mRNA örnekleri, denatüre. </li><li> Dikkatle merdiveni ve% 1 agaroz jel üzerinde mRNA örnekleri yükleyin. </li><li> Tampon olarak 1x TBE kullanılarak 1 saat boyunca 100 V elektroforezi gerçekleştirin. </li><li> Bir jel dokümantasyon sistemi (Şekil 4) kullanılarak UV transilluminator ve fotoğraf üzerinde merdiven ve mRNA bantları görselleştirmek. </li></ol> 7. Transfeksiyonu için Hücrelerin Hazırlanması <ol><li> 12 gözlü plakanın her bir kuyucuğu Levha 2 x 10 5 hücreleri (HEK293 hücreleri) içerir. </li><li> Bir hücre kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri. Not: transfeksiyon gününde, hücreler REAC olmalıdır% 80-90 hed. </li></ol> 8. Hücre mRNA Transfeksiyon gerçekleştirme <ol><li> Modifiye edilmiş mRNA çözülme. </li><li> Transfeksiyon için lipoplexes oluşturur. </li><li> Modifiye edilmiş mRNA, 25 ul (2.5 ug) ve 12-çukurlu bir levhanın bir kuyu transfeksiyonu için transfeksiyon karışımı oluşturmak üzere, serum ortamı, indirgenmiş 473 ul Opti-MEM (Minimal Essential Medium) katyonik lipit transfeksiyon reaktifı 2 ul ekleyin. Transfekte edilecek kuyu sayısı uygun hacimleri Scale. Negatif bir kontrol olarak, mRNA olmadan bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. </li><li> Pipetleme tarafından yavaşça karıştırınız. Transfeksiyon için lipoplexes oluşturmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında transfeksiyon karışımı inkübe edin. NOT: transfeksiyon karışımı hiçbir antibiyotikler içerir. Böylece, hücrelerin kullanımı sırasında kısırlık sağlamak için özen gösterin. </li><li> 500 ul DPBS hücreleri yıkayın / kuyu. </li><li> 12-iyi bir pla iyi biri transfeksiyon karışımı ul 500 eklete. </li><li> 37 ° C de 4 saat ve% 5 CO2 için hücreleri inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon karışımı aspire ve hücrelerin 1 ml tam hücre kültür ortamına ilave edin. </li><li> Hücre kuluçka makinesi içinde 24 saat boyunca kuluçkaya bırakılır. </li><li> Floresan mikroskobik yapın bir floresan mikroskobu (Şekil 5) kullanılarak analiz eder. Not: eGFP dışında mRNA, mRNA kodlayıcı ile transfeksiyon ile üretilen hücrelerde başka proteinlerin ekspresyonunu incelemek için hücreler, lamelleri yetiştirilebilir. Daha sonra transfeksiyon gerçekleştirilebilir ve hücreler, uygun antikorlar ile boyanmış ve fluoresan mikroskobu ile analiz edilebilir. </li></ol> Hücrelerde eGFP İfade 9. Akış Sitometrik Analizleri <ol><li> Kaynaklardan gelen hücre kültürü ortamı çıkarın ve (kalsiyum ve magnezyum içermeyen), 1 ml DPBS ile her bir yıkama. Hücre kültür plakalarının yüzeyinden hücreleri ayırmak için oyuk başına 500 ul tripsin / EDTA ilave edin. Daha sonra, 500 eklemekul TNS başına iyi tripsin inaktive. </li><li> Oda sıcaklığında, 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca müstakil hücreleri santrifüjleyin. Sadece pelet bırakarak süpernatantı. 150 ul hücre sabitleme çözeltisi hücre pelletini ve tüp sitometri akışı içine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> EGFP ifade eden hücrelerin yüzdesini ve Coğrafi İfade (floresan yoğunluğunun geometrik ortalama) (Şekil 6) kullanılarak floresans yoğunluğu analiz edin. </li></ol> Over Time Protein İfade 10. Ölçümü <ol><li> Ayrıca 8. adımda tarif edildiği gibi, bir 12-yuvalı plakanın 3 gözleri içindeki hücreler mRNA transfeksiyonu yapın mRNA ilavesi olmadan transfeksiyon karışımı ile HEK293 hücrelerinde 3 kuyu inkübe edin. </li><li> EGFP 1, 2 ekspresyonunu ölçmek ve Transfeksiyondan 3 gün sonra, proteinin (Şekil 7) süresini değerlendirmek. </li></ol>

<ol><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+%26%2334%3Bgene+therapy%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &#34;gene therapy&#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li>
<li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+Optimized+Wilms%26%2334%3B+Tumor+1+%28WT1%29+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Design of an Optimized Wilms&#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).</li>
<li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized%2C+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li>
<li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li>
<li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA%3A+implication+for+therapeutic+RNA+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+drug+discovery+%26+development%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).</li>
<li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8(2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

MRNA, tedavi rejeneratif tıpta, hastalıkların ve aşı tedavisi alanında büyük bir potansiyele sahiptir. Bu video, hücrelerdeki protein ifadesinin endüksiyonu için bir stabilize edilmiş, modifiye mRNA&#39;nın üretmektedirler. Bu protokol kullanılarak, istenen diğer mRNA oluşturulabilir. Modifiye edilmiş mRNA in vitro sentez hedef proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için arzu edilen mRNA ile hücrelerin transfeksiyonu sağlar. Ekzojen olarak teslim mRNA tamamen indirgendi kadar Böylece, arzu edilen protein, fiz...

Hücrelerde, haberci RNA transkripsiyon (mRNA) ve istenen mRNA&#39;nın proteinlere aşağıdaki çeviri hücrelerin düzgün işleyişini sağlamak. Kalıtsal veya sonradan kazanılmış genetik bozukluklar proteinlerin yetersiz ve işlevsiz sentezine yol ve şiddetli hastalıklara neden olabilir. Bu nedenle, eksik ya da kusurlu protein üretimini uyarmak için yeni bir tedavi yaklaşımı hücreler içine mRNA, değiştirilmiş sentetik eksojen dağıtım, istenilen protein için kodları. Böylece, hücreler normal olarak üretemez ya da doğal olarak ihtiyaç olan fonksiyonel proteinleri sentezlenmesi için tetiklenir. Bu yaklaşım kullanılarak, genetik bozukluklar mRNA&#39;nın katılmasıyla çözülebildiğini bozuk veya eksik protein 1 kodlar. MRNA, tedavi aynı zamanda tümör hücrelerinin ya da patojen uyarıcılar tarafından ifade edilen proteini antijenleri ile sentezlemek için aşılama için kullanılabilir. Böylece, konak bağışıklık sistemi tümör hücrelerini etkili bir şekilde ortadan kaldıracak ya INFE önlemek için etkinleştirilebilirseksiyonlar 2,3. Bundan başka, son yıllarda, mRNA, başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretmek için kullanıldı. Bu amaçla, fibroblastlar yeniden programlama için sentezleme 4-6 faktörleri uyarılması için ve rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahip iPSCs bunları dönüştürmek için mRNA ile transfekte edilmiştir. Daha önce, bilinen mRNA kullanımı, düşük stabilite ve güçlü immünojenite ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, geleneksel bir mRNA klinik uygulamalar ile sınırlı kalmıştır. Bununla birlikte, Kariko ve arkadaşları tarafından mRNA molekülü içinde 5-metilsitidin ve pseudouridine ile sitidin ve üridin yerine biyolojik sıvılar içinde kararlı mRNA moleküllerini hale getirilir ve önemli ölçüde artık tadil edilmiş mRNA&#39;ların klinik uygulanabilirliği karşılaştırın immün aktivasyonu, 7-10, azaltmıştır. Sentetik olarak üretilen tadil edilmiş mRNA&#39;ların kullanarak, istenen gen transkript geçici olarak in vivo 11 teslim edilebilirya da in vitro protein ifadesini uyarmak için. İlave edilen mRNA, hücre nakil mekanizması tarafından fizyolojik koşullar altında çevrilmiştir. Nedeniyle Viral gene terapi vektörleri göre konakçı hücre genomuna entegrasyon eksikliği, onkojenez riski 12,13 önlenir. Böylece, modifiye sentetik mRNA kullanılarak tedavi gelecekte daha iyi klinik kabul alırsınız. Burada, modifiye mRNA üretiminde (Şekil 1) mRNA ile hücreler ve transfekte hücrelerde protein ifade değerlendirilmesi, transfeksiyon için detaylı bir protokol açıklar.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><güçlü>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamin&nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum ve magnezyum içermez&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>%0.04 Tripsin / %0.03 EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Tripsin Nötralize Edici Çözelti,% 0.1 BSA HEK-293 hücrelerinde% 0.05 tripsin inhibitörü</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4 ">< güçlü > Sarf Malzemeleri< / güçlü ></td></tr> <tr><td>doku kültürü plakaları, 12 kuyulu&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi (75 cm2)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNaz ve RNaz içermeyen 1,5 ml steril mikrosantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR temiz ve steril epT.I.P.S. çift filtreli pipet uçları&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 ve mikro; L: 022491202; 100 ve mikro; L: 022491237; 1.000 ve mikro; l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>Bakteri kültürü için 14 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Plazmid amplifikasyonu ve saflaştırması</strong</td></tr><tr><td>>pcDNA 3.3_eGFP Plazmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 kimyasal bileşen Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Steril su (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB ortamı (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>25 g L-1 steril suda çözün.</td></tr><tr><td>LB agar (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>40 g L-1 steril suda çözün.</td></tr><tr><td>Ampisilin Hazır Çözelti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg / ml & nbsp;</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mRNA production</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polimeraz Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Takımı&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Metilsitididin-5 akut, -trifosfat ve nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Metil-CTP</td></tr><tr><td>Psödouridin-5&akut;-trifosfat&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Yalancı UTP</td></tr><tr><td>3&akut;-O-Me-m7G(5&akut;)PPP(5&akut;)G RNA kapak yapısı analog&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNaz İnhibitörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1334</td><td>2 U/&mikro; l (MEGAscript T7 Kit'ten)</td></tr> <tr><td>Antarktika fosfataz&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kiti ve nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap çözümü&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfeksiyon</strong</td></tr><tr><td>>Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktifi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Fetal Sığır Serumu (FBS) takviyesinin azaltılmasına izin veren Geliştirilmiş Minimal Esansiyel Orta (MEM);</td></tr><tr><td colspan="4">Jel elektroforezi</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Jelli Nükleik Asit Jel Lekesi</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10.000x suda&nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Merdiven&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow sitometri analizleri</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x konsantre&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Kesici uç amplifikasyonu ve poli (T) kuyruk PCR için astar</td></tr><tr><td>Forward Primer (HPLC sınıfı) 10 & M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&akut;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&akut;</td></tr><tr><td>Ters Astar (HPLC sınıfı) 10 & mikro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&akut;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&akut;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cell inkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td></td><td>CO2 (%5) ve O2 (%20)&nbsp;</td></tr><tr><td>CASY hücre sayacı&nbsp;</td><td>Sch&auml; rfe Sistem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril Çalışma Tezgahı&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyel inkübatör</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop spektrofotometresi&nbsp;</td><td>Analitik Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR ısı döngüsü&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez için jel aparatı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel dokümantasyon sistemi&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan Sistemi&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faz kontrast mikroskobu&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mrna&#39;nın değiştirilmiş

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

İstenilen hücrelerinde protein sentezinin endüksiyonu için sentetik mesajcı RNA (mRNA) kodlama eksojen dağıtım rejeneratif tıpta, temel hücre biyolojisi, hastalıkların tedavisi ve hücrelerin yeniden programlanmasının alanlarında büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, akış sitometrisi ile indüklenmiş protein ekspresyonu azaltılmış immün aktivasyon potansiyeli ve stabilitesi arttırılmış üretilen mRNA kalite kontrolü, hücrelerin transfeksiyonu mRNA ile ve test modifiye mRNA&#39;nın üretimi için aşamalı protokolde bir adım tarif eder. EGFP mRNA ile tek bir transfeksiyon sonrasında 3 güne kadar, transfekte edilmiş HEK293 hücreleri eGFP üretir. Bu video makalede, EGFP mRNA sentezi bir örnek olarak tarif edilmektedir. Bununla birlikte, bu prosedür, diğer arzu edilen mRNA&#39;nın üretilmesi için uygulanabilir. MRNA, modifiye edilmiş sentetik kullanarak hücreleri geçici olarak normalde eksprese olmaz arzu edilen proteinleri eksprese etmek için uyarılan edilebilir.

EGFP CD içeren pcDNA 3.3 plasmidi kullanılarak, tadil edilmiş eGFP mRNA sentezi (Şekil 1) kurulmuştur. PCR ile uç amplifikasyon ve poli T-atık sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluktaki temiz bir bant (Şekil 2) tespit edilir. MRNA (Şekil 3) verimi IVT zaman Artırılmış artırılması. IVT sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluğunda bir açık mRNA bandı üretilecek EGFP mRNA'nın uzunluğu (Şekil 4) tekabül edecek şekilde tespit edilmiştir. Oluştur...

Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder.

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA&#39;nın Değiştirilmiş

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerde protein ekspresyonunun indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA'nın in vitro sentezidir. Bu, önce plazmit ekinin veya kodlayan DNA dizisinin amplifiye edilmesi ve polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak 120 timidinin bir poli T kuyruğunun eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, üretilen DNA'nın poli adenin kuyrukları ile mRNA'ya in vitro transkripsiyonudur.Daha sonra, şablon DNA, in vitro transkripsiyon reaksiyon karışımının D'S işlemi ile çıkarılır. Son adım, beş ana fosfatı uzaklaştırmak için üretilen mRNA'nın Antarktika fosfataz muamelesidir. Sonuçta, hücreler üretilen mRNA, lipit kompleksleri tarafından transfekte edilir.Floresan mikroskobu ve akış sitometrisi analizi, hücrelerde gelişmiş GFP sentezini göstermek için kullanılır. Bu tekniğin viral transfect gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, onkogenez riskini önleyen konak hücre genomuna entegrasyon eksikliğidir. Bu yöntem, hücrelerde eksik veya kusurlu proteinlerin üretilmesine yardımcı olabilir ve genetik bozuklukların aşılama tedavisi için kullanılabilir.Ve rejeneratif tıp alanında, prosedürü göstermek laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu prosedürün başla

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Her iki tüp bebek ve hücre içi seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu pre-mRNA dizileri bir RNA hedefleme küçük molekül huzurunda ilgi ikincil yapısını belirlemek için astar uzantısı (SHAPE) deneyler tarafından analiz için detaylı iletişim kuralları Bu makalede sunulan.

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

Makrofajlar, özellikle birincil makrofajlar, kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşdıkları için transfect yapmak zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile birincil makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

Kendinden montajlı bir peptid-poloksamin nanopartikülü (PP-sNp), in vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA'yı kapsüllemek ve iletmek için mikroakışkan bir karıştırma cihazı kullanılarak geliştirilmiştir. Tanımlanan mRNA / PP-sNp, in vitro kültürlenmiş hücreleri verimli bir şekilde transfekt edebilir.

Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Öğrenin insan hücrelerinde protein ifadesini uyarmak için modifiye mRNA sentezleme yöntemini. Bu teknik plazmid amplifikasyonu ve in vitro transkripsiyon adımlarını içerir.

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA'nın Değiştirilmiş

Daha fazla video keşfet