İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bu videoda, yapılan Durant HEC 2 9 3 T hücrelerinden salgılanan proteinlerin ekspresyonu için zaman ve maliyet açısından verimli bir prosedürü açıklıyoruz. Başlangıçta, altı dünya plakasında %40 Cofluent HEC 2 9 3 T hücre kültürü hazırlanır. Daha sonra gen suyunun seyreltilmesiyle bir transfeksiyon karışımı üretilir, daha sonra plazmitleri serum serbest ortamda test eder.

Transfeksiyon karışımı, daha sonra protein ekspresyonuna izin vermek için 37 santigrat derecede inkübe edilen hücreler üzerinde biriktirilir. Supan ajanında protein tespiti western blot ile yapılabilir. Uygun bir yapı belirlendikten sonra, prosedür 10 katmanlı hücre fabrikaları kullanılarak ölçeklendirilebilir.

Hücreler, transfeksiyon olarak PEI kullanılarak transfekte edilir. Reaktif ve protein, teğetsel akış filtrasyonu ve ardından afinite kromatografisi kullanılarak kültür süpernatantlarından hasat edilebilir. Sonuç olarak, bu platform miligram miktarlarında çok çeşitli makromoleküllerin ifade edilmesine izin verir.

Bu tekniğin, balo virüsü bazlı böcek hücresi ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çok sayıda yapının taranabilmesi ve üç hafta içinde elde edilen sonuçlarla ekspresyon için ölçeklendirilebilmesidir. Bu prosedürü gösteren Shada Zini ve Jonathan Cook için Hello Aiden olacak. Laboratuvarımdan üç yüksek lisans öğrencisi: Altı oyuklu bir plakada bir mililitrelik bir hacimde oyuk başına 250.000 HEC 2 9 3 T hücresi tohumlayarak başlayın,% 10 FBS pentre takviyeli DMEM kuyusu başına bir mililitre ekleyin ve S, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı döndürün.

Daha sonra hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatörde inkübe edin. Hücreler yaklaşık% 40'lık bir ortak akıcılığa ulaştığında, transfeksiyon karışımını hazırlamak için SUP natum'u iki mililitre taze ortamla değiştirin. İlk olarak, bir eend orph tüpünde 90 mikrolitre serumsuz DMEM aliquot.

Daha sonra üç mikrolitre gen suyu ekleyin, transfeksiyon reaktifi tüpün içeriğini nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, mini hazırlık saflaştırılmış plazmid, DNA'nın mikrolitre stoğu başına 10 nanogramdan 10 mikrolitre ekleyin. Transfekte edilecek.

Tüpün içeriğini karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında bekletin. Transfeksiyonu gerçekleştirmek için, karışımı HEC 2 9 3 T hücreleri üzerine bırakın. Damla damla, transfeksiyon karışımını eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe şişirin.

Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, her oyuğa bir mililitre taze ortam ekleyin ve 48 saat daha inkübe edin. Transfeksiyondan üç gün sonra, supinatı hasat edin ve western blot ile ilgilenilen proteinin ekspresyon seviyelerini tespit edin.

Uygun bir yapı tanımlandıktan sonra, transfeksiyon prosedürü ölçeklendirilebilir. 10 katmanlı hücre fabrikaları kullanarak, bir hücre fabrikasını %5 FBS ile desteklenmiş 1,2 litre DMEM ile doldurun. Daha sonra 200 milyon HEC 2 9 3 T hücresi ekleyin ve hücreleri tüm katmanlara eşit olarak dağıtın.

% 100 Co akıcılığına yetiştirilen dört T 225 santimetre kare hücre kültürü şişesi yaklaşık 200 milyon hücre içerir. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfeksiyon karışımını bir T 75 şişesinde, 840 mikrogram DNA'yı 84 mililitre steril bir kez seyrelterek hazırlayın. Pbs.

Mililitre başına 2,5 mililitre bir miligram, polietilen iyon çözeltisi veya PEI ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Çözüm bulanık olmalı. Daha sonra, transfeksiyon karışımını yavaşça hücre fabrikasına dökün ve iyice dağıtın.

Genel katmanlar. Dört milimolar final konsantrasyonunda valproik asit ekleyin. Bu, transfeksiyon karışımı eklendikten sonra ifade verimini artıracaktır.

Protein ekspresyonuna izin vermek için kültürü dört gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ortamı transfeksiyondan dört gün sonra hasat edin ve hücre fabrikasını yeniden kullanım için hemen temizleyin, toplanan ortamı 6.000 G'de 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin ve herhangi bir partikül maddeyi gidermek için 0.22 mikron sterik kap vakumlu filtre aparatından süzün. Ardından, süpernatanı 75 mililitreye konsantre etmek için merkezi teğetsel akış filtreleme sistemini kullanın.

Süpernatan konsantre edildikten sonra, ilgilenilen protein afinite kromatografisi ile saflaştırılabilir. Bu deneyde, burada açıklanan büyük ölçekli sistemi kullanarak insan AAL iki reseptör hücre dışı alanının HA tached alt birimlerini saflaştırdık, ardından yüksek afiniteli anti THA kromatografisi izledik. Bu kumasi lekeli SDS sayfa analizinde gösterildiği gibi.

İnterlökin, iki reseptör alfa ve gama alt biriminin hücre dışı alanları, 40 kilodalton ve 46 kilodalton moleküler ağırlıklarda göç eder. IL iki R alfa ve IL iki R gama üzerinde bulunan EnLink glikanlarının heterojenliği, SDS sayfa jeli üzerinde bant genişlemesine neden oldu. Daha yüksek moleküler ağırlık bandı, kirletici BSA'yı temsil eder.

Bu videoyu izledikten sonra, 10 katmanlı hücre fabrikaları kullanılarak insan hücre kültüründen proteinlerin nasıl ifade edileceğini iyi anlamış olmalısınız. HC 2 93 T hücrelerinin biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edildiğini ve biyogüvenlik seviyesi ikide ele alınması gerektiğini unutmayın. Lütfen her zaman uygun kişisel koruyucu giysi giyin ve yüzeyler kurumsal ve resmi yönergelere göre dezenfekte edilmelidir.